一株致病性溶藻弧菌的多重耐药与毒力基因分子分析

一株致病性溶藻弧菌的多重耐药与毒力基因分子分析
胡梦华;马立才;赵姝;刘旭;周俊芳;房文红
【摘要】A pathogenic Vibrio alginolyticus strain,named VA-76,was isolated from ceca contents of a diseased Litopenaeus vannamei collected from Fuqing,Fujian Province.Antimicrobial susceptibilty tests for 13 antimicrobials and infection assay for Litopenaeus vannamei were performed to determine the phenotype of antimicrobial resistance and pathogenicity of VA-76,respectivly.To explore the genotype of antimicrobial resistance and pathogenicity,the isolate was also analyzed by PCR detection for virulence genes,integron-related genes and antimircobial resistance genes.In artificial infection assay,death occurred in all 4 groups of Litopenaeus vannamei infected with 3.5 ×107cfu,3.5
×106cfu,3.5 ×105cfu,and 3.5 ×104c fu,and the death rates were
100%,100%,80%,and 65%,respectively.The virulence-related genes such as tdh,tlh, toxS,collagenase,flaA,ompW,aspA,and fur were identified in VA-76.The results of antimicrobial susceptibility tests showed that this bacteria was res istant to multiple antimicribals,including florfenicol (32μg· mL-
1 ),doxycycline (32μg · mL-1 ),ciprofloxacin (>64μg · mL-
1 ),chloramphenicol (128μg·mL-1 ),streptomycin (>5 12μg·mL-
1 ),erythromycin (256μg·mL-1 ),sulfamethoxazole (>2048μg·mL-
1),TMP/SMZ (>128/2432μg·mL-1),and rifampin (>64μg·mL-
1).Especially,VA-76 exhibited high-level resistance to the latter 7 antimicrobials,and had relatively high MIC for neomycine (>32μg·mL-
1 ).Furthermore,integron 1 and SXT was also detected in this isolate,and
the gene cassete arrangement arr2-dfrA27 was identified inside this class 1 integron.Besides,insertion sequence common region1 (ISCR1 ),containing a chloramphenicol acetyltransferase gene cat2,was also detected.Several other antimicrobial resistance genes,cluding strA,strB,floR and qnrVC,were found in VA-76.However,no mutation was identified in gyrA and ParC genes of VA-76,which were usually involved in fluroquinolones resistance.This study revealed that Vibrio alginolyticus VA-76 could cause the death of Litopenaeus vannamei, exhibit resistance to multiple antimicrobials,and contain multiple virulence and antimicrobial resistance genes,indicating that prudent use of antimicrobial agents in aquaculture should be emphasized to control the development and distribution of antimicrobial resistant Vibrio alginolyticus.%从发病的凡纳滨对虾中分离并经
鉴定得到一株溶藻弧菌（命名为：VA-76），通过对虾回感实验和药物敏感性实验分别对VA-76菌株的耐药表型和致病能力进行了研究，并运用PCR方法检测了该菌的毒力相关基因、整合子和耐药基因的携带情况。

对虾感染实验结果表明，溶藻弧菌VA-76能够导致凡纳滨对虾发病死亡。

经PCR检测发现，该菌携带8种毒
力相关基因：tdh、tlh、toxS、collagenase、flaA、ompW、aspA和fur。

药敏结果显示，VA-76对环丙沙星、氯霉素、链霉素、红霉素、磺胺甲唑、复方新
诺明和利福平7种药物表现出较高的耐药水平，且该菌包含1类整合子、4类超
级整合子SXT和1型插入序列共同区（ISCR1）。

此外，该菌携带arr-2、dfrA27、strA、strB、floR、cat和qnrvC耐药相关基因。

从上述研究结果可知，菌株VA-76既具有一定的感染能力，同时对多种抗菌药物表现出较高的耐药水平，提示应
对养殖源致病性弧菌的耐药性现状予以更多的关注。

【期刊名称】《海洋渔业》
【年(卷),期】2015(000)006
【总页数】8页(P557-564)
【关键词】溶藻弧菌;多重耐药;整合子;ISCR;毒力基因
【作者】胡梦华;马立才;赵姝;刘旭;周俊芳;房文红
【作者单位】中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部海洋与河口渔业资源及生态重点开放实验室，上海 200090; 上海海洋大学水产与生命学院，上海201306;中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部海洋与河口渔业资源及生态重点开放实验室，上海 200090;中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部海
洋与河口渔业资源及生态重点开放实验室，上海 200090;中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部海洋与河口渔业资源及生态重点开放实验室，上海200090; 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306;中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部海洋与河口渔业资源及生态重点开放实验室，上海 200090;中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部海洋与河口渔业资源及生态重点开放实验室，上海 200090
【正文语种】中文
【中图分类】S941
弧菌是水产养殖中常见的、危害严重的一大类致病性病原菌。

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是弧菌属的典型代表，该菌可感染贝类、甲壳类和鱼类等动物［1］，造成重大经济损失。

此外，溶藻弧菌还是一种重要的食源性病原菌，能够造成腹泻、创伤感染、眼结膜炎、中耳炎等。

随着水产养殖业的规模化和集约化发
展，抗菌药物在疾病防控中广泛应用，造成了养殖源弧菌耐药性局势日趋严重。

此外，多种与临床上重要抗菌药物（如氟喹诺酮类、大环内脂类、头孢菌素类氨基糖苷类和四环素类等）相关的耐药基因与耐药遗传元件（如整合子等）在养殖源弧菌不断被报道［2］。

养殖过程中产生的耐药弧菌不仅对水产动物的疾病预防和治疗造成了困难，而且这些耐药菌还可能随着食物链传播而感染人类，导致抗菌药物治疗失败，对其生命健康构成威胁。

本研究从发病凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）体内分离并鉴定得到一株溶藻弧菌VA-76，通过凡纳滨对虾回感实验对该菌的感染能力和致病性进行了分析，并采用PCR扩增和测序验证的方法研究了该菌的整合子、耐药基因、毒力因子的
携带情况，以期为溶藻弧菌的耐药和致病性研究提供资料和参考。

1.1 材料
1.1.1 菌株来源
本研究中的致病弧菌分离自福建福清某养殖场发病的凡纳滨对虾，现保存于本实验室。

抗菌药物敏感性实验质控菌株大肠杆菌（E.coli）ATCC 25922购自美国典型培养物保藏中心；生理生化鉴定用参照菌株溶藻弧菌CICC 10484购于中国工业
微生物菌种保藏中心。

1.1.2 培养基和试剂
TCBS弧菌选择性培养基、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）和2216E固体培养基均购自青岛海博生物技术有限公司；PremixEx TaqTM（Version 2.0 plus dye）、DNA Maker DL2000、琼脂糖购于宝生物工程（大连）有限公司；DuRed核酸染料（10000 ×水溶液）购于上海翊圣生物科技有限公司；细菌DNA提取试剂盒购于天根（上海）生化科技有限公司；19种细菌生理生化鉴定管：赖氨酸脱羧酶、精
氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、1%蔗糖、1%甘露醇、1%水杨酸、6%NaCl胨水、1%西蒙氏枸橼酸盐、1%葡萄糖产气、1%葡萄糖产酸、1% NaCl胨水、1%葡萄
糖磷酸盐胨水、1%甘露糖、1%阿拉伯糖、1%精氨酸水解酶、0%NaCl胨水、
3%NaCl胨水、8%NaCl胨水、10%NaCl胨水，购于杭州滨河微生物试剂有限公司。

1.1.3 实验仪器
恒温培养箱，MIR-254，日本Sanyo；恒温摇床，SHKE5000-8CE，美国Thermo；PCR仪，Mastercycler pro，德国Eppendorf；高速冷冻离心机，
CF16RXⅡ，日本HITACHI；电泳仪，DYY-7C，北京六一仪器厂；凝胶成像仪，
G05-7500，美国BIO-RAD；微量移液器，德国Eppendorf；电子天平，PL3002，上海梅特勒。

1.1.4 实验动物
攻毒实验用凡纳滨对虾购自上海奉贤区某养殖场，体长范围约8～9 cm，暂养水
温25～26℃，不间断增氧。

1.2 方法
1.2.1 菌株分离、纯化和保存
在无菌操作环境下，用接种针挑取少许发病对虾的肠道内容物接种于TCBS培养基，28℃培养16～18 h；挑取典型菌落在TCBS培养基和2216E培养基上各纯化一次，之后再挑取单菌落接种于TSB肉汤中，28℃摇床中200 r·min-1培养16～
18 h。

菌液中加入终浓度为20%的甘油，置于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 菌株鉴定
将分离得到的弧菌接种于含3%NaCl的TSB肉汤中，28℃摇床中200 r·min-1过夜培养，再使用细菌基因组提取试剂盒提取总DNA。

使用针对弧菌的HSP 60基
因引物和16S rRNA基因引物对该菌进行PCR扩增并测序，再将测序结果与GenBank中的序列比对分析，引物见表1。

另外，参考细菌生化管的产品说明书，测试了所分离菌株的19项生理生化指标；并以溶藻弧菌标准菌株CICC 10484作
为参考菌株。

1.2.3 对虾感染实验
将菌株接种于TSB肉汤中，28℃摇床中200 r·min-1过夜培养。

菌液在4℃条件下，8 000×g离心5 min，用生理盐水清洗两遍后，再用生理盐水重新悬浮，然
后采用梯度稀释平板计数，最后将菌液稀释成7×108、7×107、7×106、7
×105cfu·mL-14个浓度备用。

将健康凡纳滨对虾随机分为5组（编号1、2、3、
4及对照组C），每组设2个平行，每个平行组10 ind虾，水温控制在25～26℃。

为上述5组对虾分别肌肉注射50μL含有3.5×107、3.5×106、3.5×105、3.5× 104cfu本研究中的致病弧菌菌液和等体积的无菌生理盐水。

每天喂食3次，观察并记录各组虾的死亡时间和数目。

1.2.4 毒力相关基因的检测
本研究采用PCR扩增的方法检测了弧菌感染相关的基因，包括溶血素有关基因（tdh、trh和tlh）、毒力调控基因（toxR和toxS），以及其它毒力相关基因（collagenase、ureR、flaA、ompW、aspA和fur），引物序列及PCR反应条件参考熊盼等［4］。

PCR产物送上海生工生物测序，之后将序列与NCBI数据库中的核酸序列进行Blast比对验证。

1.2.5 药物敏感性实验
采用CLSI［5］描述的微量肉汤稀释法测定本实验分离所得弧菌对13种抗菌药物的敏感性，包括环丙沙星、氯霉素、氟苯尼考、红霉素、新霉素、链霉素、多西环素、利福平、磺胺甲噁唑、复方新诺明、头孢吡肟、美罗培南和呋喃妥因。

同时，以大肠杆菌ATCC 25922作为质控菌株，并设置阴性（菌液）和阳性（MH肉汤）对照。

将无菌生长的最低药物溶液浓度视为最小抑菌浓度（MIC）。

1.2.6 整合子和耐药基因检测
采用PCR方法检测1、2、3类整合子［6］和4类整合子SXT［7］整合酶基因，
以及1型插入序列共同区（ISCR1）的转座酶基因；另外，还检测了1型整合子3′CS保守区的sul1和qacEΔ1基因［8］与1类整合子可变区。

基于插入序列共
同区（ISCR）的典型结构，并依据ISCR1转座酶基因（Accession Number：
KP688397.1）和sul1基因序列（Accession Number：KF906549.1）分别设计
引物ISCR-VF：5′-CGAACACTGCGGCGGTCA-3′和ISCR-VR：5′-TTCAGAATGCCGAACACC-3′来扩增ISCR1的可变区。

PCR产物经电泳检测后送往上海生工生物进行测序，之后进行Blast比对分析。

采用PCR方法检测氨基糖苷类、β-内酰胺类、四环素类、氟喹诺酮类、酰胺醇类
等耐药基因，包括：blaOXA、blaTEM［9］、blaSHV、blaCTX-M［10］、strA、strB［11］、cat-1［12］、floR［13］、fexA、cfr［14］、tetA、tetB、tetM［15］、qnrVC［16］、ermA、ermB和ermC［17］等。

PCR产物送上
海生工生物进行测序，之后将测序结果与NCBI数据库中的序列进行比对验证。

2.1 溶藻弧菌的鉴定
菌株VA-76在TCBS琼脂平板上呈现为黄色、圆形、光滑、突起的菌落。

进行HSP 60基因和16S rRNA基因的PCR扩增、电泳后，分别得到550 bp和1 466 bp大小的目的条带。

测序结果进行Blast比对分析的结果显示，HSP 60基因和
16S rRNA基因序列与溶藻弧菌的相似度分别为100%和99%。

菌株VA-76的19项生理生化鉴定结果均与溶藻弧菌CICC 10484一致。

结合菌株VA-76在TCBS
上的菌落形态、HSP 60基因和16S rRNA基因的序列比对结果及生理生化鉴定结果，将该菌鉴定为溶藻弧菌。

2.2 对虾感染实验
除对照组之外，其余各感染组的对虾在实验周期内（6 d）均发生了死亡。

其中，高感染剂量组（3.5×107、3.5×106cfu）在感染后24 h之内全部死亡，其余两组（3.5×105、3.5×104cfu）对虾死亡率分别为80%和65%，实验结果见表2。

2.3 毒力相关基因检测
毒力相关基因的PCR检测与序列比对结果发现，溶藻弧菌VA-76共携带8种毒力基因：溶血素相关基因tdh和tlh，其它毒力基因toxS、Collagenase、FlaA、ompW、AspA和fur（图1）。

而trh、toxR和UreR三个毒力基因未检出。

2.4 药物敏感性实验
菌株VA-76对13种抗菌药物的药敏实验结果见表3。

该菌对环丙沙星、氯霉素、氟苯尼考、多西环素、链霉素、红霉素、磺胺甲噁唑、复方新诺明、利福平和呋喃妥因10种药物表现为耐药性，其中环丙沙星、氯霉素、链霉素、红霉素、磺胺甲噁唑、复方新诺明和利福平7种药物表现出较高的耐药水平，而对头孢吡肟和美罗培南的耐药程度也处于中介水平。

此外，VA-76对新霉素的MIC值也高达
32μg·mL-1以上，也远高于本实验室所分离的其它养殖源弧菌。

2.5 整合子和耐药基因的检测
整合子检测结果发现，菌株VA-76包括完整的1类整合子结构：5′保守区的int1基因，以及3′保守区的磺胺类耐药基因sul1、季铵盐与溴化乙锭耐药基因
qacEΔ1。

该1类整合子的可变区经PCR扩增后得到一个1 308 bp的片段，测序并在NCBI上通过Blast比对后发现该可变区包含两个耐药基因盒：利福平耐药基因arr-3与甲氧苄啶耐药基因dfrA27。

此外，VA-76中还检测到4类整合子SXT 与1型插入序列共同区ISCR1，且ISCR1的下游还携带有氯霉素乙酰转移酶基因cat2。

耐药基因检测结果表明，该菌携带的耐药基因包括：链霉素耐药基因strA 和strB、氟苯尼考耐药基因floR、氟喹诺酮类耐药基因qnrVC5，其它的耐药基因没有检出（图2）。

另外，gyrA和parC对应的氨基酸序列分别与NCBI数据库登录的氨基酸序列gb｜ABB 73196.1｜和gb｜EEZ 82274.1｜的相似度均为100%，未发现位点突变。

弧菌是水产养殖中一类最为常见、流行性最广、危害最严重的细菌性病原之一
［20-21］。

其中，溶藻弧菌为专性嗜盐菌，主要分布在海洋、沿海水环境以及海洋动物体内，可引起对虾类、牙鲆属鱼类（Paralichthys）、日本鳗鲡（Anguilla japonica）、大黄鱼（Larimichthys crocea）等多种经济动物的疾病。

此外，溶
藻弧菌还能造成人类的肠道炎症、伤口感染及耳炎等。

近年来，随着抗菌药物在水产养殖中的广泛使用，有关溶藻弧菌耐药性的研究和报道也越来越多［22］。

溶
藻弧菌的耐药性不仅给水产养殖中的疾病防控带来困难，造成经济损失，而且这些耐药菌及其所携带的耐药基因可能随着食品消费链传播，威胁人类生命健康。

本研究对一株分离自凡纳滨对虾的溶藻弧菌VA-76的研究发现，肌注3.5×107、3.5×106、3.5×105、3.5×104cfu的该菌液均可造成凡纳滨对虾的死亡，在6 d
内死亡率分别达到100%、100%、80%、65%，且前两个高浓度组对虾的死亡均发生在感染24 h之内，而对照组对虾在6 d内没有死亡，该结果与赵增元等［23］的研究结果一致，说明溶藻弧菌VA-76具有感染能力，在一定的条件下能够造成
对虾的发病和死亡。

如表3所示，各组对虾的死亡时间和死亡率表现差异，表明VA-76的感染剂量与对虾感染程度密切相关。

毒力基因检测表明，该菌tdh和tlh 基因均为阳性，而这两种基因与人类弧菌性胃肠炎感染密切相关［24］。

蔡双虎
等［25］发现直接溶血毒素TDH具有较强的毒性作用，对红笛鲷（Lutjanus sanguineus）的LD50仅为（8.34±0.008）μg·g-1。

JIA等［26］的研究发现，溶藻弧菌tlh对斑马鱼（Zebra fish）具有较强的毒性，其LD50为0.8 mg·g-1。

UreR和trh在VA-76中均未检出，该结果与近年来有研究发现UreR和trh基因具有遗传学关联性的结论较为一致［27］。

此外，该菌还携带toxS、collagenase、flaA、ompW、AspA和fur等毒力基因，这些在一定程度上构成
了溶藻弧菌VA-76致病能力的分子基础。

药敏实验结果显示，该菌对多达10种抗菌药物的敏感性均较低，包括：环丙沙星、红霉素、多西环素、新霉素、链霉素、磺胺甲基异噁唑、复方新诺明、氯霉素、利
福平和呋喃妥因。

氟喹诺酮类药物（如环丙沙星等）是临床上治疗弧菌感染的首选药物之一。

氟喹诺酮类耐药通常与DNA旋转酶基因gyrA和拓扑异构酶基因parC上的位点有关，但VA-76中并未发现相关的突变位点，而检测到了qnrVC5基因，该耐药基因已报道于环丙沙星耐药的副溶血弧菌［16］。

此外，该菌中还检测到了多种其它的耐药基因，如链霉素耐药基因strA和strB、氯霉素耐药基因floR等。

大环内酯类因其分子较大而不易穿过革兰氏阴性菌的细胞壁，造成许多革兰氏阴性菌对该类药物天然耐受，而弧菌显然不属此列［28］。

本研究中，红霉素对VA-76的MIC值为128μg·ml-1，但是在该菌中并没有检测到相关的耐药基因。

因此，造成VA-76红霉素耐药的分子机制值得进一步深入研究。

整合子是一类重要的可移动基因元件，其可以携带一到多个耐药基因盒在不同菌株之间传播，整合子在细菌耐药性尤其是多重耐药性的转移扩散中起到了非常重要的作用。

经PCR检测发现，菌株VA-76含有完整的1类整合子结构，即包括1型整合酶基因、磺胺类耐药基因sul1和季铵盐及溴化乙锭耐药基因qacEΔ1，且其可变区包含两个耐药基因盒（arr-3—dfrA27）。

其中，arr-3基因能介导利福平耐药，而dfrA27能介导甲氧苄啶耐药。

该整合子基因盒的排列结构在多种来源的大肠杆菌中已有报道［29］，提示该1类整合子可能来源于耐药性大肠杆菌。

此外，溶藻弧菌VA-76还携带有4类超级整合子SXT元件和1型插入序列共同区ISCR1，ISCR1下游可变区包含一个氯霉素耐药基因cat2。

4类超级整合子SXT 可长达100 kb以上［30］，常携带多种耐药以及代谢相关的基因，因而需要对VA-76进行全基因组测序来进一步研究SXT的结构。

综上所述，分离自病虾的溶藻弧菌VA-76携带多达8种毒力相关的基因，能造成健康凡纳滨对虾的感染死亡。

另外，该菌对多种抗菌药物表现出较高的耐药水平，并携带数种耐药基因和可移动遗传元件，如1类整合子、SXT和ISCR1。

由此可见，水产养殖源病原菌耐药的局势正在不断恶化，提示在养殖过程中要进一步规范
和控制抗菌药物的使用，以遏制耐药菌和耐药基因的产生和扩散。

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