抗氧化活性测定方法

总黄酮测定方法
仪器与设备：
1.恒温混匀仪BG-200 (杭州朗基科学仪器有限公司)
2.移液枪(p1000, p200)
3.分析天平（SHIMADZU PHILIPPINES MANUFACTURING INC. AUY 220
日本岛津）
4.15×150 mm 玻璃试管
5.具塞玻璃试管, 10 mL
6.容量瓶, 1000, 100, 10 mL
7.紫外-可见分光光度计（UV-1800 日本岛津）
试剂：
1.硼氢化钠(成都市科隆化工试剂厂, NaBH4, FW 37.83, 粉末, 分析纯,
≥97.0%) 避光干燥保存。

2.三氯化铝(天津博迪化工股份有限公司，AlCl3·6H2O, FW 165,分析纯，晶
体, ≥99.0%)
3.四氯苯醌(FW245.88,Aladdin Industrial Corporation 中国上海，FW245.88
≥98%,分析纯)
4.乙醇(EtOH) (成都市科隆化工试剂厂，FW46.07，无水乙醇, ≥99.7%,分析
纯)
5.四氢呋喃(THF) (广东广华科技股份有限公司，FW 72.11，≥99.0%,分析纯)
6.冰乙酸(成都市科隆化工试剂厂, FW60.05, 99.8%,分析纯)
7.盐酸(成都市科隆化工试剂厂,36.0%-37% w/v, 12 M,分析纯)
8.槲皮素(国药集团化学试剂有限公司，FW302.24, ≥ 98%, 生化试剂BR)
9.香兰素(天津博迪化工股份有限公司, FW152.15, ≥ 99.0%,分析纯)
试剂配制：
1.0.3, 0.5, 1.0,
2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0 mM 槲皮素溶液，溶剂为四氢呋喃：乙
醇（THF:EtOH）=1:1。

配制10 mM 槲皮素标准溶液：准确称取151.12 mg槲皮素，用上述溶剂定
溶至50mL容量瓶。

2.50.0 mM NaBH4乙醇溶液：
称取189.2 mg NaBH4, 无水乙醇溶解，定容100mL容量瓶。

(不宜长期保存; 松开盖子以防炸裂)
3.7
4.6 mM AlCl3 6H2O乙醇溶液(含有1% H2O)
称取 1.80 g AlCl3 6H2O, 1 mL 水溶解，加入适量无水乙醇，后定容100mL容量瓶(储存防潮)。

4.20.0 mM 四氯苯醌四氢呋喃溶液
称取491.8 mg四氯苯醌, 四氢呋喃（THF）溶解定容100mL.
5.0.8 M 冰乙酸溶液
称取 4.84g冰乙酸, 蒸馏水定容100mL.
6.16% (w/v, 1052 mM) 香兰素甲醇溶液
称取16.0 g 香兰素, 甲醇定容100 mL.
操作步骤：
1. 用移液管准确移取0.3、0.5、1.0、
2.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0mL配置好的10Mm槲皮素标液于10mL容量瓶，用THF/EtOH (1:1, v/v) 溶液定容。

用移液枪移取槲皮素各浓度梯度标液1mL或者花椒叶各相浸膏稀释样液（5mg/mL）1mL于玻璃试管中（样液必须现配先用），空白采用THF/EtOH (1:1, v/v) 溶液1mL。

2.含有1mL样液或者1 mL 槲皮素标液的试管中, 加0.5 mL 50.0 mM NaBH4溶液，0.5 mL 74.6 mM AlCl3溶液,后在室温下于红外转子摇床内摇30 min. 再加0.5 mL 50.0 mM NaBH4溶液，摇30min。

3.加2.0 mL 冰的(4 ºC) 0.8 M 冰乙酸溶。

避光，试管内溶液晃匀后，摇晃15min。

4.加入1 mL 20.0 mM 四氯乙醌，后于红外转子摇床内，95 ºC反应60min。

5.反应完全后，自来水冷却。

6. 甲醇转出，至少两次，定容具塞试管于4mL刻度线处。

7.加入1 mL 16% 香兰素甲醇溶液，2 mL 12 M HCl 浓盐酸，混匀后室温(20-25 ºC)下避光保存15 min。

8.于490nm下测定吸光度值，每个样液重复三次。

9.数据处理。

总黄酮含量表示为: mmol槲皮素/g样品或者浸膏。

数据为三组重复的mean ± SD 。

数据处理：
1. 标准曲线：
黄酮测定标曲制作原始数据：
槲皮素标准液浓度mM Abs1 Abs2
0 0.167 0.169
0.3 0.257 0.252
0.5 0.32 0.292
1 0.391 0.388
2 0.552 0.555
4 0.88 0.892
5 1.004 1.122
6 1.268 1.266
8 1.6 1.597
10 1.956 1.959
黄酮测定标曲制作原始数据的系统性描述
槲皮素浓度
mM
Mean
Std.
Deviation
Std.
Error
95% 置信区间
Minimum Maximum
Lower
Bound
Upper
Bound
0 0.168 0.0020 0.0012 0.163 0.173 0.166 0.17
0.3 0.255 0.0035 0.0025 0.223 0.286 0.252 0.257
0.5 0.306 0.0198 0.0140 0.128 0.484 0.292 0.32
1 0.390 0.0021 0.0015 0.370 0.409 0.388 0.391
2 0.554 0.0021 0.0015 0.534 0.57
3 0.552 0.555
4 0.886 0.008
5 0.0060 0.810 0.962 0.88 0.892
5 1.063 0.0834 0.0590 0.313 1.813 1.004 1.122
6 1.26
7 0.0014 0.0010 1.254 1.280 1.266 1.268
8 1.599 0.0021 0.0015 1.579 1.618 1.597 1.6
10 1.958 0.0021 0.0015 1.938 1.977 1.956 1.959
回归方程及标准曲线：用表格内红色数据绘制，绘制时需减去空白溶液的吸光度值，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

y = 0.1743x + 0.0387；R2 = 0.9996，X：浓度mM
2. 计算公式：
大红袍花椒叶不同极性溶液萃取浸膏黄酮含量测定原始数据：
A B C D E F 标液校正空白
Abs1 0.75 0.275 0.217 0.887 0.634 0.476 0.377 0.166 Abs2 0.654 0.222 0.204 0.729 0.56 0.53 0.372 0.167 Abs3 0.807 0.225 0.246 0.777 0.668 0.438 0.375 0.168 黄酮含量（mmol槲皮素/g）=C2V2/C1V1
C2= (Y- 0.0387 )/ 0.743 mM
V2=显色液的总体积。

7mL。

C1=样品液的初始浓度。

如花椒叶为5mg/mL。

V1=加到显色管初始浓度样品溶液体积。

7mL。

例如：
选取上面表格内A1 Abs值0.75减去空白对照吸光度平均值0.167，得0.583，带入黄酮测定回归方程y = 0.1743x + 0.0387得：C2=3.12mM, 计算的黄酮含量=4.37 mmol槲皮素/g。

最后的数据均为三次重复的平均值±标准偏差。

酸性染料比色法测定花椒总生物碱的含量
仪器与材料
紫外一可见分光光度计(UV-1800 日本岛津)；
白屈菜红碱标准品(上海融禾医药科技发展有限公司，FW 348.37，白色结晶粉末，≥ 99.26%)，溴甲酚绿（天津博迪化工股份有限公司，FW 698.02，分析纯）,
磷酸二氢钠（天津博迪化工股份有限公司，NaH2PO4·2H2O, FW156.07，分析纯）磷酸氢二钠（天津博迪化工股份有限公司，Na2HPO4·12H2O, FW 358.14，分析纯）试剂配制：
(1)pH值为7．6的缓冲溶液的配制：0．2mol／LNaH2PO4(13．0mL)和0．2moL ／LNa2HPO4(87．0
mL)，酸度计校正为7．6。

(2)溴甲酚绿溶液的配制
称取0．05g溴甲酚绿加入磷酸缓冲液(pH值=7．6)，定容至100mL，制得溴甲酚绿缓冲液。

(3)标准溶液的配制
称取5mg白屈菜红碱样品加入无水乙醇，定容至20mL，制得白屈菜红碱标准溶液(0．25mg／mL)。

操作步骤：
标准曲线的绘制方法
分别吸取1，2，3，4，5mL对照品溶液，置于20mL试管中，加水补至5mL。

测定时，各吸取标液1mL（空白采用1mL无水乙醇），依次加入溴甲酚绿磷酸缓冲液1mL和5mL氯仿溶液，振摇1min后，倒入分液漏斗中静置60min，分取氯仿层，在425nm波长下测吸光度值，以生物碱含量（单位：mg/ML）为横坐标，吸光度值为纵坐标，做标准曲线。

花椒生物碱含量测定：
取花椒叶样液1mL，按照上述标曲方法，依次精密加入溴甲酚绿磷酸缓冲液1mL 和5mL氯仿溶液，振摇1min后，倒入分液漏斗中静置1h，分取氯仿层，在425nm 波长下测吸光度值。

将测得的吸光度值代人标准曲线。

数据处理：
标准曲线：
生物碱测定标曲制作原始数据：
白屈菜红碱浓度mg/mL Abs1 Abs2 Abs3
0 0.065 0.064 0.064
0.04 0.091 0.092 0.09
0.08 0.095 0.094 0.094
0.12 0.098 0.097 0.098
0.16 0.1 0.099 0.104
0.2 0.105 0.105 0.105
生物碱测定标曲制作原始数据的系统性描述
白屈菜红碱
浓度mg/mL
Mean
Std.
Deviation
Std.
Error
95% 置信区间
Minimum Maximum
Lower
Bound
Upper
Bound
0 0.064 0.0006 0.0003 0.063 0.066 0.064 0.065
0.04 0.091 0.0006 0.0003 0.089 0.093 0.09 0.092
0.08 0.094 0.0006 0.0003 0.093 0.096 0.094 0.095
0.12 0.098 0.0006 0.0003 0.093 0.099 0.097 0.098
0.16 0.101 0.0010 0.0006 0.096 0.106 0.099 0.105
0.2 0.105 0.0032 0.0019 0.103 0.109 0.104 0.105
回归方程及标准曲线：用表格内红色数据绘制，绘制时需减去空白溶液的吸光度值，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

y = 0.0858x + 0.0232；R² = 0.9997
计算公式:
大红袍花椒叶6种洗脱相浸膏生物碱含量测定原始数据：
A B C D E F 空白
1Abs 0.23 0.294 0.502 0.547 0.23 0.32 0.117
2 Abs 0.196 0.304 0.495 0.558 0.26 0.317 0.122
3 Abs 0.191 0.296 0.497 0.509 0.271 0.32 0.203
生物碱含量（mmol白屈菜红碱/g）=C2V2/C1V1/348.37
C2= (Y- 0.0232)/ 0.0858（mg/mL）
V2=显色液的总体积（氯仿层）。

10mL。

C1=样品液的初始浓度。

如花椒叶为0.25mg/mL。

V1=加到显色管初始浓度样品溶液体积。

1mL。

例如：
选取上面表格内A1 Abs值0.23减去空白对照吸光度平均值0.147，得0.083，带入生物碱测定回归方程y = 0.0858x + 0.0232得：C2=0.697 mg/mL, 计算得生物碱含量=0.08 mmol白屈菜红碱/g。

最后的数据均为三次重复的平均值±标准偏差。

花椒叶中总酚含量测定方法
前言：
大红袍花椒叶预处理，适当粉碎，称取5g花椒叶粉末，80%冰丙酮100mL，4℃，提取30min，真空抽滤，收集滤液，残渣再次用80%冰丙酮100mL，4℃，提取30min，抽滤，合并滤液，薄膜蒸发仪旋蒸至粘稠状，80%乙醇溶解，定容100mL容量瓶，-20℃冰箱保存备用。

材料:
∙试管
∙50 mL 容量瓶
∙50 mL 烧杯
∙125 mL 三角瓶
∙250 mL 圆底烧瓶
∙紫外一可见分光光度计(UV-1800 日本岛津)
∙移液管Pipette
∙蒸馏水
∙福林酚(Sigma F-9252, 2M Acid)
∙没食子酸·一水(F.W 188.13, 科帮生物)
∙无水碳酸钠（天津博迪化工股份有限公司, FW 105.99）
操作步骤:
1.福林酚试剂(FCR): Sigma, F-9252, Lot#:50K5416, 不需稀释。

2.7%碳酸钠溶液(Na2CO3, FW=105.99)
称取7g无水碳酸钠，溶解于约25mL蒸馏水中，然后转移到100mL容量瓶中，再用蒸馏水定容至刻度线。

3.将冰冻的样品放到37℃水浴锅中解冻。

4.准备没食子酸母液及标液
母液I：称取27.645mg没食子酸（一水），即25mg没食子酸，再用蒸馏水定容到25mL容量瓶中。

母液II ：吸取5mL母液一定容到50mL容量瓶中。

设置没食子酸的浓度梯度为0.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0ug/mL。

没食子酸梯度标液配制
标液浓度(μg/mL)没食子酸母液II (mL) 蒸馏水加入量(mL)
0.0 0.00 2.00
20.0 0.40 1.60
40.0 0.80 1.20
60.0 1.20 0.80
标液浓度(μg/mL)没食子酸母液I (mL) 蒸馏水加入量(mL) 100.0 0.20 1.80
150.0 0.30 1.70
200.0 0.40 1.60
250.0 0.50 1.7
300.0 0.60 1.40
5.分别吸取200ul的样液（必要时可稀释）或者没食子酸标液（空白采用蒸馏水）
于试管中。

做三个重复。

6.每个试管中加入800ul蒸馏水，摇匀。

7.再加入200ul福林酚试剂，摇匀，静置6min。

8.分别加入2000ul7%碳酸钠溶液，摇匀。

9.最后加入1600ul蒸馏水，混匀，室温，避光90min，并打开分光光度计预热
中。

10.扫描最大吸收波长，在该波长下测定其吸光度。

本次实验多酚含量测定在
772nm处测定吸光度值。

得出标曲的线性方程，计算样品没食子酸当量（mmol/g）。

11.多酚测定标曲制作：
数据处理：
标准曲线：
总多酚测定标曲制作原始数据：
没食子酸浓度ug/mL Abs1 Abs2 Abs3
0 0.097 0.096 0.096
20 0.222 0.222 0.22
40 0.33 0.329 0.343
60 0.424 0.426 0.427
80 0.52 0.519 0.519
100 0.583 0.604 0.595
200 1.073 1.078 1.074
250 1.287 1.296 1.282
300 1.506 1.501 1.5
总多酚测定标曲制作原始数据的系统性描述
没食子酸浓度ug/mL
Mean
Std.
Deviation
Std.
Error
95% 置信区间
Minimum Maximum
Lower
Bound
Upper
Bound
0 0.096 0.0006 0.0003 0.095 0.098 0.096 0.097
20 0.125 0.0010 0.0006 0.123 0.127 0.124 0.126
40 0.238 0.0081 0.0047 0.218 0.258 0.233 0.247
60 0.329 0.0021 0.0012 0.324 0.335 0.327 0.331
80 0.423 0.0000 0.0000 0.423 0.423 0.423 0.423
100 0.498 0.0111 0.0064 0.470 0.525 0.486 0.508
200 0.979 0.0031 0.0018 0.971 0.986 0.976 0.982
250 1.192 0.0072 0.0042 1.174 1.210 1.186 1.2
300 1.406 0.0026 0.0015 1.399 1.413 1.404 1.409 回归方程及标准曲线：用表格内红色数据绘制，绘制时需减去空白溶液的吸光度值，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

y = 0.0046x + 0.05；R² = 0.9994
计算公式：
大红袍花椒叶6种洗脱相浸膏总多酚含量测定原始数据：
A B C D E F 标液校正空白
Abs1 0.249 0.131 0.147 0.265 0.237 0.13 0.58 0.071 Abs2 0.213 0.14 0.131 0.328 0.237 0.13 0.564 0.06 Abs3 0.225 0.123 0.147 0.32 0.237 0.131 - 0.061
多酚含量（mmol没食子酸/g）=C2V2/C1V1/170.12
C2= (Y- 0.05 )/ 0.0046 mM
V2=显色液的总体积。

4.8mL。

C1=样品液的初始浓度。

如花椒叶为0.25mg/mL。

V1=加到显色管初始浓度样品溶液体积。

0.2mL。

例如：
选取上面表格内A1 Abs值0.249减去空白对照吸光度平均值0.064，得0.185，带入多酚测定回归方程y = 0.0046x + 0.05，得：C2=29.35 mg/mL, 计算的多酚含量=16.56 mmol没食子酸/g。

最后的数据均为三次重复的平均值±标准偏差。

P.S.:
样品黄酮测定样液浓度多酚测定样液浓度生物碱测定样液浓度样液稀释用溶剂
A 乙醇相5mg/mL 0.25mg/mL 0.25mg/mL 无水乙醇
B 石油醚相5mg/mL 0.5mg/mL 0.25mg/mL 无水乙醇
C 氯仿相5mg/mL 0.5mg/mL 0.25mg/mL 无水乙醇
D 乙酸乙酯相5mg/mL 0.25mg/mL 5mg/mL 无水乙醇
E 丙酮相5mg/mL 0.25mg/mL 5mg/mL 50%乙醇
F 甲醇相5mg/mL 0.25mg/mL 5mg/mL 50%乙醇
大红袍花椒叶六种洗脱相成分测定
黄酮含量mmol槲皮素/g 多酚含量mmol没食子酸/g 生物碱含量mmol白屈菜红碱/g
A 4.27±0.62a 14.11±2.25b 0.05±0.03c
B 0.28±0.24c 1.06±0.52c 0.17±0.01b
C 0.16±0.14c 1.70±0.57c 0.44±0.00a
D 4.75±0.65a 23.35±0.02a 0.02±0.00c
E 3.33±0.44b 15.09±0.00b 0.01±0.00c
F 2.21±0.37b 2.00±0.07c 0.01±0.00c
i数据均为三次重复的平均值±标准偏差, 同一列中，相同字母表示两种洗脱相成分差异不显著。

ABTS法
原理：
ABTS法最先由Miller等人开创，用于测定生物样品的抗氧化能力。

该方法是以ABTS [ 2 , 2' -azi-no-bis ( 3-ethylbenzthiazoline-6-sulfpnic acid)，即2，2’-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）。

这种水溶性的自由基引发剂为显色剂。

ABTS 经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS•+，向其中加入被测物质，如果该物质中存在抗氧化成分，则该物质会与ABTS•+发生反应而使反应体系褪色，然后在ABTS•+这种自由基的最大吸光波长下(一般选择734nm)检测吸光度的变化，与含Trolox(6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic Acid)，一种类似于VE的水溶性物质的对照标准体系比较，换算出被测物质总的抗氧化能力，结果多表示为每g测试物质相当的抗氧化能力所需要的Trolox的微摩尔数，所以也把该方法称为TEAC ( Trolox equivalent antioxidant capacity)法，也有研究者提出用抗坏血酸作为对照标准，将该方法称为VCEAC或者AEAC法。

ABTS•+清除率(%)=(A control−A test)*100/A control
A control: 对照管吸光值A test：待测样品吸光值
仪器设备：
●50mL锥形瓶
●50mL量筒
●10mL容量瓶
●50mL容量瓶
●100mL容量瓶
●1000mL容量瓶
●分析天平（SHIMADZU PHILIPPINES MANUFACTURING INC. AUY 220）
●移液枪（吉尔森，100-1000μl）
●封口膜
●真空泵
●抽滤瓶
●布氏漏斗
●定量滤纸
●旋转蒸发仪
●紫外-可见分光光度计（UV-1800 日本岛津）
试剂：
●蒸馏水
●丙酮（C3H6O，成都市科龙化工试剂厂，分子量：58.08 g/mol，含量≥99.5%，
分析纯AR）
●乙醇（C2H6O，成都市科龙化工试剂厂，分子量：46.07 g/mol，含量≥99.7%，
分析纯AR）
●氯化钠（NaCl，西安化学试剂厂，分子量：58.44 g/mol，含量≥99.0%）
●氯化钾（KCl，天津博迪化工股份有限公司，分子量：74.55 g/mol，含量≥99.5%）●磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O，天津博迪化工股份有限公司，分子量：
358.14g/mol，含量≥99.0%）
●磷酸二氢钾（KH2PO4，天津博迪化工股份有限公司，分子量：136.09 g/mol，
含量≥99.5%）
●浓盐酸(HCl，成都市科隆化工试剂厂, 分析纯AR，36.0%-37% w/v, 12M)
●ABTS（C18H24N6O6S4，sigma，分子量548.68g/mol，含量≥98.0%，500元）●过硫酸钾（K2S2O8，津博迪化工股份有限公司，分子量：270.32 g/mol，含量
≥99.5%）
●水溶性维生素E(Trolox):
溶液配制：
1.10Mm (mol/L )PBS缓冲液：称取8g NaCl，0.2g KCl，3.63g Na2HPO4•12H2O,
0.24gKH2PO4，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，
常温保存备用。

2.7mM（mol/L ）ABTS溶液：称取0.0384gABTS，用蒸馏水定容到10ml容量
瓶。

3. 2.45mMmol/LK2S2O8溶液：称取0.0066g K2S2O8，用蒸馏水定容到10ml容量
瓶。

4.ABTS•+反应液：将7mmol/L ABTS溶液(现配)与2.45mmol/LK2S2O8溶液(现配)
按1:1混合，反应过夜（12h-16h）制成ABTS•+储备液。

为了使ABTS•+反应液在30℃，734 nm下的吸光值为0.70士0.02。

一般先用10 mmol/L的PBS 缓冲液稀释40倍，然后测其吸光值，再慢慢往里加10 mmol/L的PBS缓冲液稀释成所需浓度。

5.Trolox标准液：准确称取25mg Trolox，用80%乙醇溶解定容至100mL容量瓶，
即配成1000umol/L将之作为母液，依次用80%乙醇配成800、600、400、200、100、25umol/L Trolox标准液。

4℃条件下保存备用。

6.样液制备：
a.分别称取粉碎的金露梅、银露梅和小叶金露梅叶片各2g，置于50ml锥形
瓶中，并加入80%的冰丙酮，混匀，用封口膜将瓶口封好。

b.将锥形瓶置于4℃冰箱中浸提30min。

c.用真空泵将提取液抽滤出来。

d.滤渣取出置于50ml锥形瓶中，再次加入80%的冰丙酮，混匀，用封口膜
将瓶口封好。

重复步骤b—c，合并提取液。

e.将每种植物提取液用旋转蒸发仪浓缩成浸膏。

f.将浸膏用80%的乙醇溶解出来，并定容至100mL容量瓶中，即制成浓度为
20mg/mL的金露梅、银露梅和小叶金露梅干叶提取液，分别稀释100倍
(0.2mg/mL)，储存于-24℃冰箱中，待测。

每种植物做三次平行。

（测之前
先将样液解冻，预热至37℃）。

方法步骤：
1.打开分光光度计预热1h，调波长为734 nm。

2.吸取100ul 稀释100倍(0.2mg/mL)的金露梅、银露梅和小叶金露梅样液于3
只试管中，编号1′、2′、3′。

并吸取100ul以上7个不同浓度梯度的Trolox标液于7只试管中，编号0---6。

每个样（标液）做三个平行试验。

3.分别往1′、2′、3′、0、1、2、3、4、5、6号试管中加入3.9mL预热至37℃的
ABTS•+反应液。

37℃水浴条件下反应10min。

4.反应完毕，于734nm条件下测定吸光度。

测得结果错误！未找到引用源。

带入公式求得清除率：错误！未找到引用源。

标准曲线
图1 Trolox清除ABTS自由基标准曲线
Fig1 Standard curve of Trolox scavenge ABTS•+
以μmol TE/g DW为单位，求得金露梅、银露梅和小叶金露梅trolox当量（μmol/g)。

错误！未找到引用源。

FRAP法
原理：Fe3+-TPTZ可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈蓝色，并于593nm 处具有最大吸光值。

根据吸光度大小可计算出样品抗氧化活性的强弱。

由Benzie和Strain(1996)建立的FRAP法原理简单，操作简便，不需特殊仪器，易于标准化，己用于测定不同生物样品的抗氧化活性。

而且具有快速、重复性好等优点，FRAP法所测结果反映的不是样品针对某一种特定自由基的清除活性，而是样品总的还原能力，因此一些学者认为该法测定的结果可用于反映样品的总抗氧化活性。

仪器设备：
●50mL锥形瓶
●50mL量筒
●50mL容量瓶
●100mL容量瓶
●分析天平（SHIMADZU PHILIPPINES MANUFACTURING INC. AUY 220）●移液枪（吉尔森，100-1000μl）
●封口膜
●真空泵
●抽滤瓶
●布氏漏斗
●定量滤纸
●旋转蒸发仪
●紫外-可见分光光度计（UV-1800 日本岛津）
试剂：
●蒸馏水
●丙酮（C3H6O，成都市科龙化工试剂厂，分子量：58.08 g/mol，含量≥99.5%，
分析纯AR）
●乙醇（C2H6O，成都市科龙化工试剂厂，分子量：46.07 g/mol，含量≥99.7%，
分析纯AR）
●浓盐酸(HCl，成都市科隆化工试剂厂, 分析纯AR，36.0%-37% w/v, 12M)
●三氯化铁（FeCl3•6H2O，天津博迪化工股份有限公司，分子量：270.3 g/mol，
含量≥99.0%）
●醋酸钠（C2H3NaO2•3H2O，西安化学试剂厂，分子量：136.08 g/mol，含量≥
98.0%，化学纯）
●冰乙酸（C2H4O2，成都市科隆化工试剂厂，分子量：60.05 g/mol，含量≥99.5%）●三吡啶三吖嗪(TPTZ，C18H12N6, sigma，分子量：312.33 g/mol，含量≥98%）●水溶性维生素E（C14H18O4，sigma，分子量250.29g/mol，含量≥97.0%）溶液配制
1.40mmol/L盐酸溶液：取浓盐酸（12mol/L）0.1mL，加水至30ml，置于避光处，
备用。

2.20mmol/L三氯化铁溶液：称取0.2703g FeCl3•6H2O,用蒸馏水定容至50mL，避
光，备用。

3.300mmol/L醋酸盐缓冲液：称取0.31g C2H3NaO2•3H2O,加入1.6mL CH3COOH，
定容至100mL容量瓶，避光，备用。

4.10mmol/L TPTZ溶液：称取TPTZ样品0.03123g，用40mmol/L 的盐酸定容至
10mL，冷藏，备用。

5.FRAP工作液：将300mmol/L醋酸盐缓冲液、10mmol/L TPTZ溶液、20mmol/L
三氯化铁溶液按10:1:1配制。

（现用现配，用之前预热至37℃）
6.Trolox标液：称取25.029mg Trolox，溶于适量的80%乙醇中，并定容至100mL
容量瓶，即为1000umol/L Trolox标液，将之作为母液，依次配得600、400、200、100、50、25、12.5、6.25 、0 umol/L Trolox标准溶液。

7.样液配制：
g.分别称取粉碎的金露梅、银露梅和小叶金露梅叶片各2g，置于50ml锥形
瓶中，并加入80%的冰丙酮，混匀，用封口膜将瓶口封好。

h.将锥形瓶置于4℃冰箱中浸提30min。

i.用真空泵将提取液抽滤出来。

j.滤渣取出置于50ml锥形瓶中，再次加入80%的冰丙酮，混匀，用封口膜将瓶口封好。

重复步骤b—c，合并提取液。

k.将每种植物提取液用旋转蒸发仪浓缩成浸膏。

l.将浸膏用80%的乙醇溶解出来，并定容至100mL容量瓶中，即制成浓度为
20mg/mL的金露梅、银露梅和小叶金露梅干叶提取液，分别稀释100倍
(0.2mg/mL)，储存于-24℃冰箱中，待测。

每种植物做三次平行。

（测之前
先将样液解冻，预热至37℃）。

方法步骤：
1.打开分光光度计预热1h。

2.吸取400ul 稀释100倍(0.2mg/mL)的金露梅、银露梅和小叶金露梅样液于3只
试管中，编号1′、2′、3′。

并吸取400ul以上9个不同浓度梯度的Trolox标液于9只试管中，编号0---8。

每种植物做三个平行试验。

3.分别往1′、2′、3′、0、1、2、3、4、5、6、7、8号试管中加入3mL预热至37℃
的FRAP工作液。

37℃条件下反应10min。

4.在593nm下测定吸光度。

以80%的乙醇作为空白管。

记下吸光值。

测得结果错误！未找到引用源。

Trolox标准曲线：
金露梅样品FRAP值计算：根据反应后的A值，在标准曲线上求得相应Trolox 浓度（μmol/L)，求得每g样品相当于Trolox的μmol量定义为FRAP值。

FRAP 值越大，抗氧化活性越强。

DPPH法
原理：DPPH•在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其孤对电子在517nm 附近有强吸收(显深紫色)。

当有机清除剂存在时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱，通过测定吸收减弱的程度，可评价自由基清除剂的活性。

取2ml DPPH 溶液溶解待测物，充分混合，静置30min。

517nm测定其吸光度。

每个样品平行做三次。

K（%）=[1-(A i-A j)/A c] ×100%
式中，K 为样品对DPPH 自由基的清除率；A i为2ml DPPH溶液+2ml样液的吸光度；A j为2ml样品提取液+2ml乙醇的吸光度；A c为2mlDPPH 溶液+2ml 乙醇的吸光度。

仪器设备：
●50mL锥形瓶
●50mL量筒
●10mL容量瓶
●50mL容量瓶
●100mL容量瓶
●分析天平（SHIMADZU PHILIPPINES MANUFACTURING INC. AUY 220）●移液枪（吉尔森，100-1000μl）
●封口膜
●真空泵
●抽滤瓶
●布氏漏斗
●定量滤纸
●旋转蒸发仪
●紫外-可见分光光度计（UV-1800 日本岛津）
试剂：
●蒸馏水
●丙酮（C3H6O，成都市科龙化工试剂厂，分子量：58.08 g/mol，含量≥99.5%，
分析纯AR）
●乙醇（C2H6O，成都市科龙化工试剂厂，分子量：46.07 g/mol，含量≥99.7%，
分析纯AR）
●DPPH（C18H13N5O6，sigma，分子量：398.32 g/mol，含量≥99.7%）
溶液配制：
1.DPPH溶液：准确称取3.98mgDPPH，用80%乙醇定容至100mL容量瓶，即配成浓度为
0.1mg/mL的DPPH溶液。

4℃冰箱中避光保存，备用。

2.样液配制：
m.分别称取粉碎的金露梅、银露梅和小叶金露梅叶片各2g，置于50ml锥形瓶中，并加入80%的冰丙酮，混匀，用封口膜将瓶口封好。

n.将锥形瓶置于4℃冰箱中浸提30min。

o.用真空泵将提取液抽滤出来。

p.滤渣取出置于50ml锥形瓶中，再次加入80%的冰丙酮，混匀，用封口膜将瓶口封好。

重复步骤b—c，合并提取液。

q.将每种植物提取液用旋转蒸发仪浓缩成浸膏。

r.将浸膏用80%的乙醇溶解出来，并定容至100mL容量瓶中，即制成浓度为20mg/mL的金露梅、银露梅和小叶金露梅干叶提取液。

将其作为母液。

s.将20mg/mL的金露梅、银露梅和小叶金露梅干叶提取液（母液）稀释成10个浓度梯度为400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0μg/mL 的样液。

3.阳性对照：Trolox标准液：准确称取25mg Trolox，用80%乙醇溶解定容至
100mL容量瓶，即配成1000umol/L将之作为母液，依次配成200、100、50、
30、10、6、4、2、0umol/L Trolox标准液。

4℃条件下保存备用。

方法步骤：
5.打开分光光度计预热1h。

517nm
6.吸取2mL0.1mg/mL DPPH溶液于10只试管中，编号0---9。

7.分别往0---9号试管中加入2mL浓度梯度为0---400μg/mL的金露梅（银露梅、
小叶金露梅）提取液。

室温条件下反应30min。

每种植物做三组平行。

8.反应完毕，于517nm条件下测定吸光度。

9.Trolox阳性对照：吸取2mL0.1mg/mL DPPH溶液于9只试管中，编号0---8。

分别往0---8号试管中加入2mL浓度梯度为0---200μg/mL的Trolox标准液。

室温条件下反应30min。

于517nm条件下测定吸光度。

每个浓度做三组平行。

测得结果
样品名称IC50（ug/mL)
金露梅16.717
银露梅19.369
小叶金露梅23.874
Trolox 4.280
脂质抗氧化能力测定
采用改进的硫代巴比妥酸活性物种测定法，利用蛋黄匀浆作为丰富脂质媒体来衡量其脂质过氧化能力。

首先，将蛋黄匀浆以1.15% w/v KCL溶液稀释至10% v/v 混匀。

取50 μl蛋黄匀液，50 μl不同浓度的样品溶液，150 μl的0.67% w/v硫代巴比妥酸和150 μl 20%的三氯乙酸混溶至400μl。

混合液完全混匀后置于95°C的条件1 h。

冷却后，加入等量的正丁醇，离心10分钟（3000 rpm ），取上清液在532nm 下测吸光度，抑制百分率以以下公式计算：
过氧化抑制率(%) = (1 − t/c) × 100
c为空白组的吸光度，t为加样组的吸光度。

α-生育酚，BHA 和BHT 作为参考标准.得出抑制浓度和清除率的IC50 值。

试剂：
鸡蛋黄。