水飞蓟素对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的影响及IL-6和NF-κB的表达变化

水飞蓟素对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的影响及IL-6和NF-κB
的表达变化
董建;杨洁;王玉浔;史国辉
【摘要】目的探索不同浓度水飞蓟素对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的作用及对IL-6和NF-κB表达的影响.方法将40只成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠随机分为假手术组(S组)、缺血再灌注模型组(IR组)、低剂量药物组(L组)、高剂量药物组(H 组).采用全自动生化分析仪检测血清肌酐及尿素氮浓度,ELISA检测肾组织细胞白介素-6(interleu-kin-6,IL-6)及细胞核因子-κB(nuclear factorκB,NF-κB)浓度,HE染色检测肾脏病理损伤程度,免疫组化检测肾脏IL-6及NF-κBp65的表达.结果 IR组血清肌酐、尿素氮浓度、胞核NF-κB、胞质IL-6表达均较S组明显升高
(P<0.05),L组、H组较IR组血清肌酐、尿素氮浓度及胞核NF-κB、胞质IL-6表达降低(P<0.05),并随着药物剂量增加进一步降低(P<0.05);IR组较S组肾小管损伤重,L组及H组肾小管损伤程度较IR组明显减轻,并随着给予浓度的增加而损伤程度进一步减轻.结论水飞蓟素可以减轻大鼠IRI,能够抑制细胞质IL-6、细胞核NF-κB 表达,并随着给药浓度的增加作用逐渐增强.
【期刊名称】《西安交通大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2017(038)006
【总页数】4页(P926-929)
【关键词】水飞蓟素;大鼠;缺血再灌注损伤;IL-6;NF-κB
【作者】董建;杨洁;王玉浔;史国辉
【作者单位】华北理工大学附属医院肾内科,河北唐山 063000;华北理工大学附属医院肾内科,河北唐山 063000;华北理工大学附属医院肾内科,河北唐山 063000;华北理工大学附属医院肾内科,河北唐山 063000
【正文语种】中文
【中图分类】R692
肾脏缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, IRI)是指肾脏在血液中断或减少时遭受一定损伤，待恢复血液供应后，肾功能不仅没有恢复正常反而损伤加重，导致功能进一步异常、代谢紊乱及结构破坏的现象[1]。

肾脏IRI是诱发急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)较为重要的原因。

AKI发病率及死亡率比较高，全世界每年超过1 300万患者遭受此损伤，而170万人因此病死亡[2-3]。

目前针对肾脏IRI并没有有效的治疗，预后常常较差。

水飞蓟素是从水飞蓟种子中提取的黄酮类混合物，具有抗炎、抗氧化、保肝、降糖、降脂、抗肿瘤等作用。

NF-κB是在转录过程中RNA聚合酶转录时所需要的一种辅助因子[4]，其信号转导通路改变会引起多种炎症性疾病的发生，如在肾脏IRI中发生的炎症反应[5]，也可以通过调控促炎等相关基因的转录影响白介素-6(IL-6)的表达，IL-6可加重炎症反应进一步损害肾脏。

有研究表明水飞蓟素可以抑制肝脏细胞核NF-κB依赖基因的表达，从而发挥保肝作用。

鉴于水飞蓟素明显的抗炎作用和本身无明显毒副作用，本研究观察了其对大鼠IRI时的肾功能及IL-6、NF-κB的影响。

1.1 仪器与试剂图像采集及分析系统(北京航空航天大学)；Bio-Rad酶标仪；水飞蓟素胶囊(德国马博士大药厂，生产批号：B1403206)；IL-6、NF-κBp65免疫组织化学试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；NF-κB及IL-6 ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.2 实验动物与分组清洁级雄性SD大鼠[北京维通利华实验动物技术有限公司，
合格证号SCXK(京)2009-003]，SPF级环境饲养，体质量在250～290 g。

于华北理工大学动物实验中心动物房饲养 7 d 适应环境，可自由获取食物和水。

本实验
的动物处理方法经华北理工大学医学伦理委员会商议后批准。

选用随机数字法将
40只雄性大鼠分为4组，即假手术组(S组)、缺血再灌注模型组(IR组)、水飞蓟素低剂量组(L组)、水飞蓟素高剂量组(H组)。

S组及IR组术前给予生理盐水灌胃7 d，L组及H组术前分别给予水飞蓟素100 mg/(kg·d)、200 mg/(kg·d)灌胃7 d。

1.3 肾脏IRI模型的建立方法及处理术前准备，禁食禁水，麻醉、备皮、消毒，手术切口3～4 cm，腹中线逐层打开腹腔。

IR组、L组、H组结扎右侧输尿管及右
侧肾动静脉，摘取右侧肾脏，无创动脉夹阻断左侧肾脏血液供应，夹闭左侧肾动静脉40 min后再灌注，手术结束。

再灌注24 h后，给予100 mL/L水合氯醛腹腔
注射再次麻醉大鼠，逐层打开腹腔，留取肾组织及血液样品，颈椎脱臼处死动物。

S组不给予缺血再灌注处理，其余步骤与其他组相同。

1.4 肾功能检测用含有促凝剂的采血管留取静脉血，采用全自动生化分析仪检测
血清肌酐及尿素氮浓度。

1.5 病理组织学检查肾脏取出后经40 g/L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片(片厚4 μm)HE染色，电动正置显微镜下(×400)观察肾小管损伤情况。

1.6 酶联免疫吸附法检测IL-6、NF-κB含量的变化将肾组织剪切成小块，加入适
量PBS，离心，弃上清，按细胞压积∶Buffer A=1∶1.5的体积比，加入Buffer A 震荡，再加入1/20总体积的Buffer B震荡，4 ℃，16 000 r/min离心，取上清
液获得细胞质蛋白；将沉淀物加入100 μL Buffer C震荡离心，留取上清液即获得核蛋白。

分别依据IL-6及NF-κB ELLISA试剂盒操作流程进行实验，最后放入酶
标仪读数记录数据。

1.7 免疫组化法检测IL-6、NF-κBp65蛋白的表达肾组织石蜡切片常规脱蜡、水化，柠檬酸盐高压热修复，滴加兔抗鼠IL-6抗体、NF-κBp65抗体(稀释比均为
1∶300)，湿盒内4 ℃过夜，滴加羊抗兔二抗，37 ℃孵育30 min，DAB显色、
脱水、透明、封片。

PBS代替一抗为阴性对照，光学显微镜下观察、摄片。

阳性
率的定量分析：每个标本取5张切片，200倍显微镜下的肾小管处随机选择5个
视野，用HPIAS-1000图像分析系统计算吸光度A值作为半定量参数，测量IL-6
及NF-κBp65的表达，A值越小表示IL-6及NF-κBp65表达越强。

1.8 统计学方法所有数据均采用Excel建立数据库，应用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，方差分析后的两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 肾功能检测结果 IR组、L组及H组血清肌酐、血尿素氮水平高于S组
(P<0.05)，L组及H组血清肌酐、血尿素氮水平明显比IR组低(P<0.05)，H组血清肌酐、血尿素氮浓度较L组低(P<0.05，表1)。

2.2 肾脏组织的形态学变化镜下观察，S组肾小球、肾小管清晰可见，结构完整，无明显异常改变。

IR组肾组织皮髓质交界区大量肾小管明显肿胀、坏死，刷状缘
脱落，部分肾小管阻塞，肾间质有大量中性粒细胞浸润。

L组肾小管肿胀稍轻，肾小管刷状缘可见少量脱落细胞，未见肾基膜破裂，肾间质仅有少量中性粒细胞浸润。

H组肾小管肿胀较轻，肾小管刷状缘未见明显脱落，肾间质未见明显中性粒细胞(图1)。

2.3 肾组织IL-6、NF-κB的含量的检测结果 IR组、L组、H组肾组织匀浆的细胞
胞质IL-6、胞核NF-κB水平均高于S组(P<0.05)，其中IR组肾组织胞质IL-6、
胞核NF-κB浓度最高(P<0.05)，H组IL-6、NF-κB水平较L组明显降低(P<0.05，表2)。

2.4 肾组织IL-6、NF-κBp65表达的检测结果 IR组肾组织中胞质IL-6、胞核NF-
κBp65表达水平明显高于S组(P<0.05)；L组及H组胞质IL-6、胞核NF-κBp65
表达较IR组降低(P<0.05)，H组较L组更低(P<0.05，表3、图2)。

△P<0.05。

本研究结果显示IR组血清肌酐及尿素氮水平较S组明显升高，镜下观察肾脏组织病理可见IR组皮髓质交界区大量肾小管明显肿胀、坏死，刷状缘脱落，部分肾小管阻塞，肾间质有大量中性粒细胞浸润。

这提示肾脏在缺血再灌注后对肾脏造成一定程度的肾损害，炎症反应较重，模型建立成功。

有研究表明肾小球滤过率快速下降与肾小管、肾小球的变化伴随间质性炎症有关[6]，IRI可以通过诱发内皮细胞功能紊乱、白细胞介导的炎症反应、降低微小血管的血流量引起急性肾损伤[7-10]。

哺乳动物NF-κB家族由5个成员组成：p65(RelA)、c-Rel、RelB、
p50/p105(NF-κB1)、p52/p100(NF-κB2)，他们形成了不同的异源二聚体或同源二聚体[11]。

在正常生理状态时，细胞质中NF-κB与NF-κB抑制蛋白(inhibitory kappa B, ⅠκB)在胞质中结合，其活性被抑制，当创伤、感染等外界刺激时，
ⅠκB会被ⅠκB酶复合物磷酸化而失去抑制作用，ⅠκB开始泛素化，随后被特定蛋白酶降解，NF-κB变成游离状态进入细胞核内[12]，结合靶向基因的启动子或增强子区域的特定序列，调节促炎基因等相关基因的转录，进而改变多种炎症相关因子及酶类物质的表达，如IL-6、IL-1、TNF-α。

同时，编码ⅠκB蛋白使细胞恢复稳态[13]。

有文献报道，NF-κB在缺血时活化，再灌注12 h开始升高，2～3 d 达到顶峰[14]；本实验的IR组胞质IL-6、胞核NF-κB表达均较S组升高；有文献报道在缺血再灌注损伤后，TNF-α抑制剂减轻了炎症改变[15]。

这表明IRI时胞质中的NF-κB由结合状态变为游离状态进入细胞核，从而调控炎症因子如IL-6的表达，大量的炎症介质可以激活中性粒细胞、淋巴细胞、单核巨噬细胞等向损伤部位聚集，发生炎症反应损伤肾组织。

水飞蓟素包括水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟亭、水飞蓟宁等成分。

其对肝脏有明显的抗炎、抗氧化而发挥保护作用。

本实验的L组、H组的血清肌酐、尿素氮水平、胞质IL-6、胞核NF-κB表达均较IR组降低，并随着水飞蓟素H组较L组降
低更显著，并且L组及H组肾小管肿胀减轻，刷状缘脱落减少，肾间质中性粒细
胞明显减少，TAN等[16]发现水飞蓟素可以降低肾脏IRI大鼠血清肌酐、尿素氮水平。

这提示水飞蓟素可以减轻大鼠肾脏IRI，并且提升药物浓度后，其肾脏保护作
用增强。

同时，水飞蓟素可以抑制IL-6、NF-κB的表达，其对肾脏IRI的保护作
用可能与此有关。

总之，目前的研究结果为水飞蓟素在大鼠IRI的防治方面提供了一定的理论基础。

临床IRI患者病情较为复杂，常常合并多种疾病，而且目前并没有明确有效保护肾脏IRI的药物应用于临床。

本实验发现水飞蓟素可以减轻大鼠肾脏IRI、降低IL-6、NF-κB的表达。

此外，水飞蓟素还对心脏、脑、胃、肠IRI有保护作用，更适合临床应用。

但是，还需要细胞实验以及多中心、多样本、大样本的临床研究进一步验证，为预防及减轻肾脏IRI提供可靠依据。

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