长尾潜蝇茧蜂寄生后橘小实蝇幼虫体内4种酶活性的变化

长尾潜蝇茧蜂寄生后橘小实蝇幼虫体内4种酶活性的变化王勇;郭俊杰;陈家骅;季清娥
【摘要】Determinate the activity of catalase (CAT), peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD), phenoloxidase (PO) in the 4th instar larvae of B.dorsalis parasitized by Diachasmimorpha longicaudata. The results showed that after the larvae was parasitized, under the regulation of the immune system there was a great of reactive oxygen species (ROS), which increased the activity of CAT, POD, SOD comparing the parasitized-free larvae. However, the activity of PO was decreased distinctly. The synergy of the four enzymes efficiently decreased excessive ROS in host to guarantee the efficient parasitism and increased the survival rate of parasitic wasps.%测定长尾潜蝇茧蜂(Diachasmimorpha longicaudata)寄生的4日龄橘小实蝇(B.dorsalis)幼虫体内过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化物酶(PO)活性.结果表明:幼虫在被寄生后,在其免疫系统的调节下产生大量的活性氧自由基(ROS),致使被寄生的幼虫较未被寄生的3种抗氧化物酶(CAT、POD、SOD)活性明显高,然而被寄生的幼虫PO活性明显低于未被寄生的幼虫.这4种酶协同作用,从而有效减少寄主体内过量的ROS,保证寄生蜂能有效地寄生,提高寄生蜂的存活率.
【期刊名称】《热带作物学报》
【年(卷),期】2013(034)002
【总页数】4页(P335-338)
【关键词】长尾潜蝇茧蜂;橘小实蝇;抗氧化物酶;酚氧化物酶
【作者】王勇;郭俊杰;陈家骅;季清娥
【作者单位】福建农林大学益虫研究所,福建福州 350002
【正文语种】中文
【中图分类】S433
橘小实蝇[Bactrocera dorsalis（Hendel）]是目前我国最重要的实蝇类害虫之一，严重危害柑橘、番石榴、芒果等46科250多种果树和蔬菜[1]。

该虫原产于热带
和亚热带地区，国内主要分布于广东、广西、湖南、贵州、福建、海南、云南等长江以南省区[2]。

传统防治橘小实蝇的方法主要有施用化学农药、甲基丁香酚灭雄和生物防治等[3-4]，近年来，随着人们环保和可持续发展意识的增强，采用实蝇寄生蜂进行害虫生物防治已越来越受到重视。

长尾潜蝇茧蜂[Diachasmimorpha longicaudata（Ashmead）]隶属膜翅目（Hymenoptera）茧蜂科（Braconidae），潜蝇茧蜂亚科（Opiinae），是实蝇类害虫最重要的寄生蜂之一，已知能寄生至少14种实蝇的幼虫[5]。

国外对长尾潜蝇茧蜂在室内大量饲养过程中自身带病、细胞病变效应做了较多的研究[6]，但有
关长尾潜蝇茧蜂寄生对寄主酶活性的影响报道很少，而寄生蜂寄生可引起寄主昆虫免疫系统产生细胞免疫反应，如包囊作用、黑化作用和吞噬作用；同时导致迅速合成抗菌物质的体液免疫反应。

在此过程中，酚氧化酶（PO）催化酪氨酸形成多巴（DOPA），并将多巴氧化为醌，最终形成黑色素。

醌会引发产生活性氧自由基（ROS），如超氧阴离子（O2·-）和羟自由基（·OH），其细胞毒性有助于杀死病
原菌和寄生物，但过多的活性氧会造成有机体损伤[7]。

本实验通过研究橘小实蝇
幼虫被寄生以后其体内过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧
化酶（SOD）和酚氧化物酶（PO）的变化，从而探索长尾潜蝇茧蜂的寄生机制，为人工大量饲养长尾潜蝇茧蜂提供理论指导。

1 材料与方法
1.1 材料
供试橘小实蝇在室温（25±1）℃，相对湿度（70±10）%，LD 14 h∶10 h 条件下，饲养到 4 日龄。

1.2 方法
1.2.1 长尾潜蝇茧蜂对橘小实蝇幼虫的寄生将4日龄橘小实蝇幼虫放入装有1 500头左右已经羽化10d的长尾潜蝇茧蜂的饲养笼中，长尾潜蝇茧蜂用蜂蜜喂养，寄
生4 h后将橘小实蝇幼虫放入人工饲料中饲养，未被寄生的桔小实蝇幼虫作为对照。

1.2.2 粗酶液的制备将5头被寄生的橘小实蝇幼虫用蒸馏水冲洗3次，然后将其
放入5 mL匀浆器中，加入0.05 mol/L，pH7.0的PB缓冲液2 mL，冰浴匀浆。

在4℃条件下8 000 r/min离心10 min，取上清液置低温冰箱保存，分析前解冻。

以同样的方法对未被寄生的橘小实蝇幼虫进行制样，重复3次。

分批获取寄生4、24、48、72 h的样品和对照的酶粗提液，各自贴好标签。

1.2.3 过氧化氢酶活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性采用改进的冯从经等[8]的
方法测定，取30%H2O21 mL，加水至100 mL。

从中取出10 mL，加入pH7.0，0.05 mol/L的磷酸缓冲液90 mL，测定230 nm处1cm光路OD值，如其OD
值在0.50～0.55之间，即作为过氧化氢酶的底物溶液。

取已预温至25℃的底物溶液3mL，在25℃条件下加入粗酶液20 μL，立即测定230 nm处的OD值，1 min后再测1次。

按下列公式计算CAT活性：K=（2.303/60）×lg（OD1/OD2）/组织中蛋白含量（OD1为零时 OD230，OD2为1 min后OD230）。

CAT酶活
力单位U/g prot，U代表每g组织蛋白中CAT酶每s分解吸光度为0.50～0.55
的底物中的CAT酶相对量。

1.2.4 过氧化物酶活性的测定在Tatiana等[9]的方法上稍加改进。

反应体系含有0.05 mol/L的PB缓冲液，愈创木酚和稀释30倍的30%的H2O2，加入酶提取
液后于 470 nm 处[ε=26.6 L/（mmol·cm）]，测其5 min内吸光值的变化。

按下列公式计算POD活性： K=（ΔOD·V）/（ε·T·P·v）。

式中，V：酶促反应总体积（mL）；T：反应时间（min）；P：蛋白质含量（g/mL）；v：加入反应体系中
的酶液体积（mL）；ε：消光系数。

1.2.5 超氧化物歧化酶活性的测定 SOD活性测定在姬国红[10]方法的基础上略加
改进。

3.3 mL反应液中含 50 mmol/L 的磷酸缓冲液（pH=7.0），750 μmol/L
淡蓝四唑（NBT），100μmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），100μL酶液，
130mmol/L蛋氨酸，最后加20μmol/L核黄素。

置于4 000 lx日光下进行光化
学反应，反应温度为30℃，25 min，然后用黑暗终止反应，立即在560 nm下比色。

一个酶活单位为该反应条件下引起3.3 mL反应液达到50%抑制所需的酶量。

1.2.6 酚氧化物酶活性的测定参照Jiang等[11]的方法稍加改进，酚氧化酶活性以
L-DOPA转化成多巴色素时490 nm处的吸光值表示。

测定时取150μL分别作为粗酶液，再加入120μL的0.1mol/L氯代十六烷基吡啶（CPC）于比色杯中混匀，30℃下温育10 min，然后加入150 μL的0.02 mol/L的L-DOPA作为底物继续
温育1 min，加入PB缓冲液至总体积3.0 mL，测定490 nm处1 min内吸光值
的增大值。

每毫克蛋白吸光值增大0.001设定为1个酶单位，计算酚氧化酶活性。

1.2.7 蛋白质浓度测定采用Bradford法[12]测定蛋白浓度。

1.2.8 数据处理数据采用SPSS软件进行方差分析、t检验等统计分析。

2 结果与分析
2.1 牛血清蛋白标准曲线和蛋白含量
根据考马斯亮蓝G.250染色法的测定结果，求得牛血清蛋白含量与OD值之间的标准曲线为y=0.007 4x+0.026 0，R2=0.997 2（图1，其中，y代表OD值；x 代表蛋白质含量，单位μg）。

根据所测酶液的OD值，通过标准曲线，计算出未寄生与被寄生的橘小实蝇幼虫蛋白含量。

图1 牛血清蛋白标准曲线
2.2 长尾潜蝇茧蜂寄生对橘小实蝇幼虫CAT活性的影响
由表1可看出，被寄生的幼虫CAT活性与对照相比，在刚开始的4 h时差异不显著（p＜0.05），在24 h以后明显升高（p＜0.01），说明长尾潜蝇茧蜂可导致寄主体内H2O2增加，从而使CAT活性增大，为了清除过量的H2O2，避免·OH对细胞的毒害，这有利于寄生蜂在寄主幼虫体内进一步发育[13]。

被寄生组与未被寄生组都在24 h至48 h时CAT活性增势明显，而且在48 h这一时间的CAT活性达到顶峰，可能是因为这个阶段是幼虫狂长阶段，从而诱导CAT活性增大。

2.3 长尾潜蝇茧蜂寄生对橘小实蝇幼虫POD活性的影响
由表2可看出，被寄生的幼虫POD活性与对照相比，在4 h和24 h时差异极显著（p＜0.01），在48 h差异显著（p＜0.05），在72 h时差异不明显升高（p ＞0.05），表明寄生也诱导POD活性升高，其作用与CAT相同。

未被寄生与被寄生的幼虫在48 h时酶活性到达最高值，说明了这个阶段的幼虫活力最好，CAT 与POD活性显示平行关系。

此外，被寄生组在24 h至48 h时POD活性增势明显，与CAT也相似。

表1 长尾潜蝇茧蜂未寄生与寄生的橘小实蝇幼虫CAT活性说明：同列数据后不同大小写字母分别表示数据间差异性比较达极显著（p＜0.01）和显著（p＜0.05）水平。

下同。

处理 4 h 24 h 48 h 72 h未被寄生（3.46±0.14）a （4.11±0.06）A （6.25±0.12）A （4.29±0.04）A被寄生（3.93±0.10）a （4.84±0.08）B （8.20±0.07）B （5.34±0.03）B
表2 长尾潜蝇茧蜂未寄生与寄生的橘小实蝇幼虫POD活性处理 4 h 24 h 48 h 72 h未被寄生（119.21±1.11）A （145.22±1.42）A （153.44±1.88）a
（98.52±2.56）a被寄生（132.91±1.11）B （162.23±0.25）B
（172.49±1.77）b （113.51±1.49）a
2.4 长尾潜蝇茧蜂寄生对橘小实蝇幼虫SOD活性的影响
由表3可看出，被寄生的幼虫SOD活性与对照相比，在4 h时差异极显著（p＜0.01），在被寄生24 h和48 h差异显著（p＜0.05），在72 h时差异不显著。

SOD活性在24 h时到达最顶峰，而CAT和POD在24 h时偏低，48 h时则相反，CAT、POD活性与SOD活性显示互补关系。

3种酶的共同点是，寄生能诱导其活性升高。

2.5 长尾潜蝇茧蜂寄生对橘小实蝇幼虫PO活性的影响
由表4可看出，被寄生的幼虫PO活性与对照相比，在4 h时差异不显著（p＞
0.05），在被寄生24 h以后差异极显著（p＜0.01）。

被寄生的幼虫PO活性比
未被寄生的低，说明寄生能有效降低寄主幼虫的PO活性。

PO活性在24 h时到
达最顶峰，在48 h活性又降低，是由于在这个阶段CAT和POD的活性非常高，从而抑制了PO的活性
表3 长尾潜蝇茧蜂未寄生与寄生的橘小实蝇幼虫SOD活性处理 4 h 24 h 48 h 72 h未被寄生（144.05±1.29）A （235.56±1.70）a （60.56±1.30）a
（64.69±0.49）a被寄生（154.30±0.52）B （282.47±7.16）b （68.38±0.38）b （71.81±2.34）a
表4 长尾潜蝇茧蜂未寄生与寄生的橘小实蝇幼虫PO活性处理 4 h 24 h 48 h 72 h 未被寄生（24.96±0.75）a （41.61±1.67）A （17.14±0.25）A （32.02±0.46）A被寄生（21.66±0.08）a （23.59±0.65）B （11.74±0.04）B （14.88±0.68）B
3 讨论
寄生可以有效地抑制寄主PO的活性，而提高抗氧化物酶的活性的现象与国内外一些学者的研究结果相似。

如黄芳[14]的关于半闭弯尾姬蜂寄生小菜蛾的研究报道，半闭弯尾姬蜂寄生能够显著抑制小菜蛾血淋巴内酚氧化酶前体激活；姬国红[10]的关于夜蛾斯氏线虫对菜青虫几种保护酶活力的影响的研究结果显示，接入线虫后，菜青虫的SOD与CAT活力显著上升；张芸等[15]的关于夜蛾斯氏线虫对黄粉虫3种保护酶活力的影响研究结果表明，夜蛾斯氏线虫侵染黄粉虫后抗氧化物酶也显著上升。

本研究结果显示，寄生可以有效地抑制PO的活性，特别是寄生24 h以后被寄生的与未寄生的幼虫差异极显著，寄生还可以提高抗氧化物酶的活性，CAT活性在
24 h后寄生与未寄生的幼虫差异极显著，而POD和SOD活性是在24 h之前差
异极显著，随着时间推移差异趋向于不明显，说明在不同时间段，起主导作用的抗氧化物酶不同，在24 h时PO与SOD活性较高，到了48 h时CAT与POD活性显著升高，而SOD与PO活性显现降低趋势，说明CAT与POD的活性显示为平行关系，而与SOD则显示为互补关系，这与前人做的一些研究结果相似[13]。

寄生蜂雌蜂在寄主体内产卵后同时注入分泌物，使寄主的发育、行为、生理生化都发生了改变，以产生适合寄生蜂幼虫早期生长的环境。

本研究主要探索寄主被寄生后体内4种酶活性的变化，得出抗氧化物酶和酚氧化物酶呈现的功能上的互补关
系有利于寄生蜂有效地寄生寄主，提高寄生蜂在寄主体内的存活率。

本研究从生理生化角度上研究寄生蜂的寄生机制，可为人工大量饲养长尾潜蝇茧蜂提供理论指导。

Ahamad等[16]认为，粉纹夜蛾类植食性昆虫不同组织中不同抗氧化物酶活性存
在差异，本研究没有针对寄主各种组织分开研究，只是整只虫体全部放入匀浆器中处理，因此这4种酶在不同组织中的特异性有待于进一步研究。

在抗氧化物酶与黑色素的关系上，黑色素参与了清除自由基的反应，并在一定程度
上起到替代SOD清除自由基的作用；高水平POD可以促进5,6-二羟基吲哚最终
氧化为黑色素；黑色素的产生是由PO和CAT共同控制的，CAT可以增加黑色素的量[13]，因此有必要对这4种酶与黑色素的关系进行研究。

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