Plackett—Burman试验、最速上升试验及Box—Behnken试验联用优化栀子多酚超声提取

Plackett—Burman试验、最速上升试验及Box—Behnken试验联用
优化栀子多酚超声提取工艺
目的优化栀子多酚超声提取工艺。

方法通过Plackett-Burman试验从乙醇浓度、粒径、液料比、超声功率、超声温度、超声时间、提取次数几个影响因素中挑选出显著因素，然后针对显著因素采用最速上升试验确定响应面的中心点，最终利用Box-Behnken试验优化栀子多酚超声提取工艺。

结果最佳提取工艺为乙醇浓度45%，液料比25：1，提取时间35min，栀子总多酚得率为1.857%，与预测值1.9%接近。

结论优化工艺科学合理，为栀子的开发提供了参考。

[Abstract] Objective To optimize the ultrasonic extraction process of polyphenols from Gardenia jasminoides Ellis. Methods The significant factors were selected from the influence factors of concentration of ethanol，particle diameter、the ratio of liquid to material，ultrasonic power，ultrasonic temperature，ultrasonic time and extraction times by Placket-Burman experiment，then the central point of response surface was determined by the Steepest ascent experiment，finally the ultrasonic extraction process was optimized by Box-Behnken experiment. Results Optimum ultrasonic extraction process was as follows：concentration of ethanol 45%，the ratio of liquid to material 25：1，ultrasonic time 35min，the total yield of polyphenol was 1.857%，close to the predicted value of 1.9%. Conclusion The optimized extraction technology which provided references for the exploitation and utilization of Gardenia jasminoides Ellis was scientific and reasonable.
[Key words] Gardenia jasminoides Ellis；Polyphenol；Plackett-Burman experiment；Steepest ascent experiment；Box-Behnken experiment
栀子为常用中药，在我国应用历史悠久，历代主要本草著作中均有收录。

国内外从19世纪末开始对栀子属植物进行大量化学成分方面的研究[1-5]，目前为止，从栀子中发现了大量的多酚类化合物。

多酚类化合物是一类复杂的具有多个酚羟基的次生代谢产物，具有抗氧化性[6]、清除自由基、降血脂、降血压、降血糖[7-8]、抗肿瘤[9-10]、抗衰老、镇痛、抗炎、抗菌等作用[11]。

近年来，响应面优化法在中药提取工艺、中药制剂工艺、中药处方筛选中已有大量应用[12]，而Placket-Burman试验可从大量影响因子中筛选出显著因子，最速上升试验又可将显著因子最大程度逼近中心点，故此在优选响应面显著因子方面最为准确有效[13]。

本研究利用Placket-Burman试验筛选出乙醇浓度、液料比、提取时间三个显著因素、采用最速上升试验确定响应面分析的中心点，最终通过Box-Behnken试验响应面分析，优化了栀子总多酚的超声提取的工艺，为栀子的开发利用提供了参考。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
栀子（江西樟树天齐堂中药饮片有限公司），经江西中医药大学范崔生教授鉴定为栀子（Gardenia jasminoides Ellis）的果实，烘干，粉碎，过筛，备用。

没食子酸标准品（中国药品生物制品检定所，批号110813-201204），95%乙醇、85%浓磷酸、37%浓盐酸（汕头市西胧化工有限公司），无水碳酸钠、硫酸锂、溴水（天津市风船化学试剂科技有限公司），钼酸钠、钨酸纳（天津市化学试剂四厂）所有试剂均为分析纯。

Folin-Ciocalten（FC）试剂：参照文献[14]自配。

1.2 实验仪器
KQ-300超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司），HH-4数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），0412-CENTRIRIFUGE离心机（上海方术器械厂），BS224S 电子天平（北京塞多利器有限公司），YF-116摇摆式粉碎机（浙江瑞安市永历制药机械有限公司），UV-2100紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）。

1.3 方法
1.3.1 没食子酸标准曲线绘制称取没食子酸标准品10mg，用80%乙醇定容至100mL容量瓶。

分别移取没食子酸标准品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL 于10mL容量瓶，加水至4.0mL后，加入2mL FC试剂摇匀，静置5min；再加入10%碳酸钠溶液2mL，用水定容至刻度，摇匀，避光放置2h，以80%乙醇溶液作空白组，于波长764nm处测定吸光度。

以吸光度为纵坐标，没食子酸浓度（?g/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：Y=0.095X-0.103，相关系数R2=0.9980。

1.3.2 栀子总多酚的测定方法[15] 精密称取栀子粉末0.5g，在一定条件下超声提取，定容至20mL，取一定量上清液于10mL容量瓶，加水至4.0mL，先加入2mL FC试剂，摇匀，静置5min；再加入2mL 10%碳酸钠溶液，用水定容至刻度，摇匀，避光放置2h，以试剂作空白组，测定其在波长764nm 处的吸光度，通过没食子酸标准曲线计算所测样品的浓度，按下式计算栀子总多酚含量，每组试验平行3次。

总多酚含量（%）=提取出的多酚类化合物量/栀子量×100%。

2 结果与分析
2.1 Plackett-Burman（PB）试验
PB试验是一种通过N次试验可以研究最多K=N-1个变量（N一般为4的倍数）的两水平的实验设计方法，能够通过比较各因素两水平的差异与整体的差异来确定其显著性，从而达到筛选显著因素的目的，可以避免在之后的优化试验中由于因素太多或部分因素不显著而造成的试验成本浪费[16-17]。

考察栀子总多酚超声提取的7个影响因素，各因素以及水平的选择来源于单因素预实验：X1为乙醇浓度、X2为粒径、X3为液料比、X4为超声功率、X5为提取温度，X6 为提取时间，X7为提取次数，X8为虚构变量用以估算误差。

每个因素分别选取高水平（1）和低水平（-1），以栀子总多酚提取率为响应值，用Design-Expert.8.05b软件设计试验并进行数据处理。

PB试验设计因素及水平编码见表1，实验设计及响应值见表2，方差分析见表3。

Design-Expert.8.05b软件拟合出多项式方程如下：
Y=-1.41+1.6×10-2X1-9.2×10-2X2+1.6×10-2
X3+3.5×10-3X4+2.9×10-3X5+1.3×10-2 X6+2.6×10-2 X7
由表3可以看出，模型R2=0.9788，表明有97.88%试验数据的差异可用该模型解释。

R2adj=0.9418与R2接近，能够更好的看出模型的解释力。

各因素对响应值的影响由P值决定，P＜0.05时，该因素对总多酚的提取为显著因素，反之不显著。

表3及拟合多项式可以看出，乙醇浓度X1、料液比X3、提取时间X6为显著因素，对提取率的影响均为正相关，显著程度为X3>X1>X6。

2.2 最速上升试验
最速上升试验，又叫最陡爬坡试验，能够快速的将各因素水平趋近最优响应值，最终建立有效的响应面拟合方程[18]。

根据PB试验的结果，进行最速上升试验。

由PB试验结果可知，乙醇浓度、料液比、提取时间对栀子总多酚得率有显著影响，因此按这三个因素效应的大小比例设定最速上升路径和步长。

乙醇浓度、料液比、提取时间的均为正相关，三因素的水平均为递增，试验设计和结果见表4。

由表4可知，栀子多酚得率最大值在试验4附近，因此选择试验4中各参数值为后续Box-Behnken试验的中心点。

2.3 Box-Behnken试验
采用Box-Behnken响应面试验法，将乙醇浓度、液料比、提取时间三因素取三水平，编码及水平见表5，试验设计及结果见表6，方差分析见表7。

表7中，P＜0.05表明模型或考察的因素有显著影响。

模型的P＜0.0001，表明模型显著性很高；模型失拟项P值为0.1097，大于0.05，表示失拟项不显著；模型的R2=0.9971，R2adj=0.9934，表明模型的相关性和解释度都很好。

表7的结果中，由P值大小来判断，乙醇浓度A、料液比B、提取时间C三个因素对响应值的大小影响为B>A>C，同时AC、A2、B2、C2的P值均PAB>PBC，响应值存在极值，经Design-Expert.8.05b进一步计算得出：当乙醇浓度为44.53%，液料比25.26mL/g，提取时间为35.28min时，栀子总多酚提取率有最大值，为1.9%。

2.4 验证试验
为检验Box-Behnken响应面优化模型的可靠性，依据实际情况，将提取条件调整为乙醇浓度45%，液料比25mL/g，提取时间为35min，平行试验3次，取平均值，得到实际提取率为1.857%，与预测值1.9%接近，表明采用Box-Behnken 响应面优化的栀子总多酚超声提取模型准确可靠。

3 结论
本研究采用PB试验法、最速上升试验法、和Box-Behnken试验法，确定影响栀子总多酚超声提取率3个显著因素为乙醇浓度、液料比、提取时间，在最佳工艺条件：乙醇浓度为44.53%，液料比25.26mL/g，提取时间为35.28min下，栀子总多酚得率预测值为 1.9%。

依据实际情况将最佳工艺条件调整为乙醇浓度45%，液料比25mL/g，提取时间为35min，经验证试验表明，此条件下栀子总多酚得率为1.857%，与预测值1.9%接近，表明了响应面模型的可靠性和准确定性，为栀子做为天然抗氧化剂来源的开发和利用提供了参考。

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