白血病患者循环DNA定量和完整性分析及其临床意义

白血病患者循环DN A定量和完整性分析及其临床意义
高玉洁,杨再林,钟晓明,邵会媛,杨松,肖玲,白垚,蔡晓钟,张伶
[摘要]　目的　分析白血病患者血浆DNA的含量及完整性,并探讨其临床意义。

方法　以2008年6月-2009年3月收治的60例白血病患者作为实验组,同期在门诊行体检的健康正常人20例、血液系统良性病变者20例、淋巴瘤患者10例、实体肿瘤患者20例(食管癌6例、原发性肝癌4例、鼻咽癌5例、乳腺癌5例)作为对照组(n=70)。

测定两组患者的血浆DNA含量,比较两组间、不同FAB分型的急性髓细胞白血病患者间、实验组不同年龄段及不同病程患者间血浆DNA水平的差异。

采用聚合酶链反应扩增β2actin 大片段和小片段产物并行琼脂糖凝胶电泳观察,比较实验组患者与对照组中正常人血浆DNA的差异。

结果　实验组患者血浆DNA 浓度(41312±11814μg/L)约为对照组中正常人(1916±719μg/L)的21倍(P<0105),且高于对照组的其他疾病患者(P<0105)。

实验组血浆DNA浓度与年龄及疾病病程有关,不同FAB型别的急性髓细胞白血病患者血浆DNA含量无显著差异。

实验组血浆DNA 电泳呈现大小不一的片段,而且其血浆DNA中可扩增出β2actin的大、小片段产物,完整性较高。

正常人仅可见少量小片段DNA。

结论　白血病患者血浆DNA含量和完整性明显增高,对白血病的诊断及预后判断具有重要价值。

[关键词]　白血病;DNA;血浆
[中图分类号]　R73317;R446111 [文献标志码]　A [文章编号]　057727402(2010)0120024204
Q u antification,integrity ev alu ation and clinical significance o f circu lating DN A in plasm a of leuk emi a p atients
G AO Yu2jie,Y AN G Z ai2lin,ZHON G X iao2ming,SHAO Hu2yuan,Y AN G S ong,XIAO Ling,BAI Y ao,CAI
X iao2zhong,ZHANG Ling31Department of Clinical Hematology,Faculty of Laboratory Medicine,Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing400016,China
3C orresponding author,E2mail:cqumszhl@
[Abstract]　Objective　T o evaluate the clinical significance of detection of both plasma DNA concentration and integrity in leukemia patients.M ethods　S ixty leukemia patients were assigned as experimental group,and the control group consisted of70subjects,including 20healthy subjects for health check in out2patient clinic,20patients with benign hematological diseases,10cases of lymphoma and20cases of solid tum ors(6cases of esophageal carcinoma,4cases of primary hepatic carcinoma,5cases of nasopharyngeal carcinoma and5cases of breast cancer).Plasma DNA of patients in the both groups were detected,and the differences in plasma DNA level were then compared respectively between the patients with different FAB types of acute myelocyte leukemia(AML)and those in experimental group with various age or clinical scenarios.Polymerase chain reaction(PCR)was performed to amplify large and short fragments ofβ2actin,and integrity of plasma DNA was analyzed with agarose gel electrophoresis.R esu lts　Mean concentration of plasma DNA in experimental group were(41312±11814)μg/L,which was about21times higher than that in the various control groups.The plasma DNA level in experimental group was closely correlated to age of patients and course of disease.However,no significant difference was found in plasma DNA concentrations between the subjects with different FAB subtypes.Agarose gel electrophoresis analysis showed a typical ladder pattern of DNA fragments from the plasma DNA in experimental group,and miscellaneous fragments ofβ2actin were amplified by PCR, demonstrating increased integrity in plasma DNA of leukemia patients,while only short products were amplified in healthy subjects.
C onclusion　Both the concentration and integrity of plasma DNA are increased in leukemia patients,which may have important clinical value in both diagnosis and m onitoring prognosis for the leukemia patients.
[K ey w ords]　leukemia;DNA;plasma
循环DNA(circulating cell2free DNA,cf2DNA)是一类存在于人体液(如血浆)、呈游离状态的DNA。

肿瘤患者血浆DNA含量明显增高,并具有与肿瘤组织DNA相似的特性,与疾病进展、治疗效果以及预后密切相关[1]。

最近研究发现循环DNA的完整性与肿瘤
[基金项目]　国家自然科学基金面上项目(30872418)
[作者简介]　高玉洁,硕士研究生。

主要从事白血病基础与临床方面的研究
[作者单位]　400016　重庆　重庆医科大学检验系临床血液学教研室(高玉洁、钟晓明、邵会媛、杨松、蔡晓钟、张伶);第三军医大学西南医院血液中心(杨再林);重庆医科大学附属儿童医院检验科(肖玲);重庆医科大学附属第一医院检验科(白垚)
[通讯作者]　张伶,电话:023*********;E2mail:cqumszhl@sina1com 的临床进展联系紧密[2]。

急性白血病是常见的血液系统恶性肿瘤,其患者血浆循环DNA的含量显著增高。

目前,微小残留白血病(minimal residual disease,MRD)的监测多以疾病相关融合基因作为分子标志物,但不同型别白血病融合基因检出率高低不一,易受血液样本中大量正常血细胞的干扰,且大部分核型正常的白血病患者因无基因改变,无法依靠该方法确诊。

Rogers 等[3]发现白血病患者血浆DNA水平的增高可早于骨髓组织细胞学的异常,认为血浆DNA可作为监测MRD和白血病早期复发的一种新的通用指标。

本文定量检测了白血病患者的血浆DNA含量,并进一步分析了其与患者临床特征和疾病进展之间的关系,同时
观察了血浆DNA的完整性,现报道如下。

1　材料与方法
111　研究对象及分组　所有入选者均为2008年6月-2009年3月在第三军医大学西南医院、重庆医科大学附属第一医院和重庆医科大学附属儿童医院血液科、门诊或肿瘤科进行诊治的患者或进行体检的正常人。

实验组(n=60):为白血病患者,均经细胞形态学、细胞化学、免疫学确诊。

其中急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)45例、急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)15例。

男32例,女28例;年龄3310±814(1～65)岁,其中<20岁者10例,20～59岁者40例,≥60岁者10例。

初诊的白血病患者15例,化疗1个月后经急性白血病疗效判断标准判为完全缓解(complete remission,CR)5例、部分缓解(partial remission,PR)10例、未缓解(non2remission, NR)15例,执行造血干细胞移植术(HSCT)5例,复发10例。

45例AML患者根据FAB分型分类,包括M13例、M214例、M35例、M49例、M510例、M64例。

对照组(n=70):包括在门诊行体检的健康正常人20例;血液系统良性病变者20例,为同一时期收治且排除其他病变者;淋巴瘤患者10例;实体肿瘤患者20例(食管癌6例、原发性肝癌4例、鼻咽癌5例、乳腺癌5例),诊断均经组织病理学证实。

112　血细胞DNA的提取　取实验组静脉血1ml,严格按照Omega SE Blood K it试剂盒(Omega公司)说明书操作步骤进行血细胞DNA提取,每1ml全血获得100μl DNA。

113　血浆样本收集及血浆DNA抽提、纯化　每例入选者取静脉血2ml,置EDT A抗凝管中,3000r/min离心20min后将血浆吸至洁净离心管,3000r/min离心10min,完全去除血细胞成分后置干燥洁净冻存管中, -80℃低温冰箱保存备DNA抽提。

严格按照试剂盒(Qiagen公司)说明书操作步骤进行血浆DNA提取,每2ml血浆可获得300μl DNA。

所有血浆DNA均采用同一批号试剂盒抽提,以减少批间误差并便于集中检测。

114　血浆DNA定量检测及分析　取10μl DNA样本置于透明载板,与1∶3000荧光染料SY BR G reen I(百维信公司)等比例稀释并充分混匀后置于紫外与可见光成像分析系统(Bio2Rad公司)中,摄取图像,经软件系统分析读取其荧光强度,根据标准含量DNA(重庆嘉美公司)的荧光强度作回归方程,计算出相应样本的DNA浓度。

比较实验组与对照组,实验组内不同年龄段及不同FAB分型AML患者,实验组20～59岁年龄段患者中10例男性与10例女性患者,以及实验组中初诊、CR、PR、NR、HSCT、复发患者间血浆DNA水平的差异。

115　血浆DNA完整性分析　将提取的实验组及对照组中正常人的血浆DNA直接行琼脂糖凝胶电泳,若出现大小不等的电泳条带,则提示其中包括正常细胞凋亡分解产生的DNA小片段和非凋亡细胞分泌的DNA 大片段,说明其具有一定的完整性。

另外,以实验组患者和对照组正常人的血浆DNA以及实验组患者的细胞DNA为模板,采用PCR法扩增人基因组中管家基因肌动蛋白(β2actin),通过观察β2actin大片段与小片段产物条带的丰度,分析实验组与正常人血浆DNA的完整性。

β2actin大片段产物(543bp)对应的引物为:上游5′2GGG ACCTG ACTG ACT ACCTC23′,下游5′2CGT2 CAT ACTCCTG CTTG CTG23′;β2actin小片段产物(230bp)对应的引物为:上游5′2CTCTCTG CTCCTC2 CTGTTCG ACAG23′,下游5′2GTGG AATCAT ATTG2 G AACATGT23′。

所有引物均由宝生物公司合成。

β2 actin的PCR扩增反应条件为:95℃预变性5min;94℃30s、55℃30s、72℃45s,35个循环;72℃延伸10min。

在PCR扩增仪(Bio2Rad公司)上完成扩增反应。

每次实验均以去离子水作为阴性对照。

PCR产物行琼脂糖凝胶电泳,紫外凝胶成像系统观察结果。

116　统计学处理　采用SPSS1310软件进行分析,计量资料以 x±s表示,组间比较采用t检验和方差分析。

P<0105为差异有统计学意义。

2　结 果
211　实验组与对照组血浆DNA含量比较　由表1可见,实验组血浆DNA含量显著高于对照组(P<0105),约为正常人的21倍,实体肿瘤患者的519倍,淋巴瘤患者的417倍。

对照组中,淋巴瘤患者和实体肿瘤患者的血浆DNA含量显著高于正常人(P<0105),而淋巴瘤与实体肿瘤患者间、血液系统良性病变患者与正常人间血浆DNA含量无统计学差异(P>0105)。

表1　实验组与对照组血浆DNA含量比较(μg/L, x±s)
T ab11　Plasma DNA level in both experimental and control group (μg/L, x±s)
组　别血浆DNA含量
实验组(n=60)413.2±118.4
对照组(n=70)
　正常人(n=20)19.6±7.9(1)
　淋巴瘤患者(n=10)88.6±23.5(1)(2)
　实体肿瘤患者(n=20)70.3±21.4(1)(2)
　血液系统良性病变患者(n=20)21.2±3.5(1)
注:与实验组比较,(1)P<0105;与正常人比较,(2)P<0105
212　实验组不同年龄及不同FAB分型AML患者血浆DNA含量的差异　实验组中,≥60岁者(n=10)血浆DNA水平(42912±16916μg/L)高于其余各年龄段患者
(P <0105);<20岁者血浆DNA 水平(25911±7218
μg/L )明显高于20～59岁者(16619±9516
μg/L ,P <0105)。

同时,对20～59岁年龄段中男性(n =10)和女性(n =10)患者血浆DNA 水平进行比较发现,同一年龄段、不同性别
的患者血浆DNA 含量无统计学差异(P >0105)。

对45
例不同FAB 型别的AML 患者进行检测发现,各型别间血浆DNA 含量无明显差异(图1)。

图1　不同FAB 型别AML 患者血浆DNA 含量比较
Fig 11　Plasma DNA level of patients with acute myeloid leukemia and different types of FAB
213　实验组不同临床状态患者血浆DNA 含量的差异　初诊白血病患者血浆DNA 含量最高,达49715±
20210
μg/L (P <0105)。

化疗后,血浆DNA 含量逐渐下降,NR 患者血浆DNA 含量(10810±5011
μg/L )仍较高,与其他组比较有统计学差异(P <0105);PR 患者血
浆DNA 含量(5311±1917
μg/L )已处于较低水平,而CR 和行HSCT 的患者血浆DNA 含量(分别为2419±
1314、1714±912
μg/L )趋于正常;复发患者血浆DNA 含量(18116±8318
μg/L )则又增高,与其余患者比较有统计学差异(P <0105)。

214　两组血浆DNA 片段完整性分析　实验组血浆DNA 呈现大小不等的片段(100～500bp ),以小片段居多;对照组中正常人血浆仅可见少量100～250bp 的小片段DNA 。

实验组细胞DNA 显示为大于2000bp 的大片段(图2)。

图2　血浆或血细胞DNA 片段电泳图
M 1Marker ;1、21正常人血浆DNA ;3、41实验组血浆DNA ;51
实验组血细胞DNA
Fig 12　DNA fragments in plasma or hematocytes
以血浆DNA 为模板扩增管家基因β2actin ,结果发
现,实验组可扩增出β2actin 的大、小两种片段(543、
230bp )产物,而正常人仅扩增出小片段(230bp )产物,说
明白血病患者血浆DNA 完整性较正常人高。

此外,对同一白血病患者血浆来源DNA 与血细胞来源DNA 中的β2actin 扩增产物进行比较,可见血浆来源DNA 的β2actin 大片段产物丰度不如血细胞来源DNA (图3)。

图3　β2actin 扩增产物电泳图
M 1Marker ;1,21正常人血浆DNA ;3,41实验组血浆DNA ;5,61实验组血细胞DNA
Fig 13　PCR products of β2actin
3　讨 论
20世纪70年代后期,Leon 等[4]研究发现肿瘤患
者循环DNA 水平远高于正常人,随后在食管癌、肝癌、
乳腺癌等多种实体肿瘤中发现血浆DNA 具有肿瘤相关的特征性改变,提示循环DNA 可作为实体肿瘤早期诊断的有效指标。

近年来研究发现循环DNA 的完整性与肿瘤进展关系密切,可作为循环DNA 定量测定的补充,用于指导临床诊治及病情监测。

曾有研究发现AML 等血液系统恶性肿瘤患者血浆DNA 具有白血病特异性的基因改变[5],Jilani 等[6]进一步证实血浆DNA
改变与白血病患者的预后密切相关。

因此定量测定白血病患者血浆DNA并分析其完整性具有重要意义。

本研究参考了文献[7]的方法,应用SY BR G reen I 荧光染色法对60例白血病患者血浆DNA进行定量检测,结果显示实验组血浆DNA含量(41312±11814μg/ L)明显高于正常人(1916±719μg/L),而Wu等[8]采用荧光分光光度计检测白血病患者血清DNA含量约为1000μg/L;同时本研究中淋巴瘤患者血浆DNA含量(8816±2315μg/L)低于Deligezer等[9]报道的淋巴瘤血浆DNA水平,这些结果的不同可能与所选样本及实验方法不同有关。

但是,从本实验和前述文献报道的结果均可看出血液系统恶性肿瘤血浆DNA含量有高于正常人的趋势。

进一步分析血浆DNA含量与白血病临床特征的相关性,发现AML患者血浆DNA含量与年龄分段密切相关,低年龄段者(<20岁)与高年龄段者(≥60岁)循环DNA含量较高,这与Wu等[8]的研究结果一致。

此外,在实验组同一年龄段患者中,不同性别间血浆DNA含量的差异无统计学意义(P>0105),不同FAB型别的AML患者血浆DNA含量也未见明显差异。

本研究还发现初诊AML患者经化疗和HSCT治疗后,血浆DNA含量下降,而AML复发时血浆DNA含量再次升高,该结果与最近Schwarz等[10]在ALL患者中的研究结果一致,他们还提出在ALL诱导治疗过程中可通过检测血浆DNA含量来监测MRD。

因此,测定血浆DNA含量的变化有助于白血病的预后评估。

本研究还发现,白血病患者血浆DNA呈大小不等的片段,同时可从白血病患者血浆DNA中扩增出β2 actin的大、小片段产物,表明白血病患者血浆DNA的完整性比正常人高,与Ellinger等[11]在睾丸癌中的研究结果一致。

肿瘤患者血浆DNA具有较高的完整性,这可能由于血浆DNA来源于肿瘤细胞释放、坏死肿瘤细胞或微转移灶裂解等非凋亡途径,而正常人血浆DNA主要来源于正常细胞的凋亡,且凋亡过程中DNA 被降解而呈现为小片段。

最近Deligezer等[12]证实血浆DNA的完整性分析对乳腺癌具有较高的预后评估价值。

因此有必要深入探讨血浆DNA的完整性与白血病病情进展的关系,以利于预后判断。

本研究结果显示,白血病患者血浆DNA含量异常增高,且与疾病的临床特征和病程进展密切相关,同时白血病患者血浆DNA具有较高的完整性,因此血浆
DNA检测对白血病的辅助诊断和预后判断具有重要意义。

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(2009210213收稿　2009211207修回)
(责任编辑　李恩江)。