微生物的观察及革兰氏染色

实验日期：2017.10.25 实验班级：生物技术指导教师：张建丽
姓名：高熹学号：1120152430
环境中微生物的分离和纯化
1 实验目的
1）了解培养基的制备原则和制备程序，熟悉常用培养基的名称
2）掌握微生物的分离、接种技术
3）了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围，掌握高压蒸汽灭菌的操作方法
2 实验原理
2.1 显微镜及油镜
2.1.1 显微镜
普通光学显微镜是由一组光学系统和支持及调节光学系统的机械系统组成。

机械系统包括镜座、镜臂、镜台、物镜转换器、镜筒及调节器等。

镜座是显微镜的基座，使显微镜能平稳地放置在桌子上；镜台又称载物台，是放置标本的地方，镜台上有压片夹用以固定被检标本，标本移动器可使标本前后和左右移动，有的标本移动器带有游标尺，可指明标本所在位置；镜臂用以支持镜筒，也是移动显微镜时手握的部位；镜筒是连接目镜和物镜的金属筒，镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接；物镜转换器安装在镜筒的下端，其上装有3~5个不同放大倍数的物镜，可以通过转动物镜转换器随意选用合适的物镜；调节器安装在镜臂基部，是调节物镜与被检标本距离的装置，通过调节粗、细螺旋便可清晰地观察到标本。

光学系统主要包括目镜、物镜、聚光镜和反光镜等，较好的显微镜有内光源。

目镜一般由两块透镜组成，不同的目镜上刻有5×、10×和15×等字符以表示该目镜的放大倍数；物镜是显微镜中很重要的光学部件，由多块透镜组成，根据物镜的放大倍数和使用方法的不同，分为低倍物镜、高倍物镜和油镜等。

被检物体经显微镜的目镜和物镜放大后的总放大倍数是物镜的放大倍数和目镜放大倍数的乘积。

2.1.2 油镜
油镜是实验室常用的显微镜之一，清晰度略高于普通光学显微镜，用于观察衣原体，细菌，细胞器等较细微的结构。

使用油镜时，需在玻片上滴加香柏油。

这是因为油镜的放大倍数较高，而透镜很小，光线通过不同密度的介质物体（玻片→空气→透镜）时，部分光线会发生折射而散失，进入镜筒的光线少，视野较暗，物体观察不清。

如在透镜与玻片之间滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），则使进入油镜的光线增多，视野亮度增强，物象清晰。

2.2微生物形态的观察
2.2.1 个体形态
镜检细胞形状、大小、排列，革兰氏染色反应，运动性，鞭毛位置、数目，芽孢有无、形状和部位，荚膜，细胞内含物；放线菌和真菌的菌丝结构，孢子丝、孢子囊或孢子穗的形状和结构，孢子的形状、大小、颜色及表面特征等。

2.2.2 菌落特征
在固体培养基平板上观察菌落生长的性状（形状、光泽、透明度、颜色、质地等）。

2.3 革兰氏染色
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，这种染色法是由一位丹麦医生Hans Christian Gram于1884年所发明，最初是用来鉴别肺炎球菌与克雷白氏肺炎菌之间的关系。

未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察阳性紫色阴性红色阳性紫色阴性红色。

染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。

通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

2.4 无菌操作
用于防止微生物进入人体组织或其它无菌范围的操作技术称为无菌操作。

如外科手术需防止细菌进入伤口。

在各种生物实验中,为了防止微生物地生长和繁殖影响实验的进行,也要在无菌的环境下进行。

3 实验仪器及材料
3.1 实验仪器
超净工作台，显微镜。

3.2 实验材料
细菌装片，擦镜纸，香柏油，擦镜液，菌液，结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%乙醇，蕃红染液。

4 实验步骤
4.1 使用油镜观察细菌装片
（1）将光线调至最强程度（聚光器提高，光圈全部开放）。

（2）转动粗调节器使镜筒上升，滴香柏油1小滴（不要过多，不要涂开）于接物镜正下方标本上。

（3）转动接物镜转换盘，使油镜头于镜筒下方。

（4）俯身镜旁侧面在肉眼的观察下，转动粗调节器使油镜头徐徐下降浸入香柏油内，轻轻接触玻片为止。

（5）慢慢转动粗调节器，使油镜头徐徐上升至见到标本的物象为止。

（6）转动微调节器，使视野物象达到最清晰的程度。

（7）左手徐徐移动推进器，并转动微调节器以观察标本。

（8）标本观察完毕后，转动粗调节器将镜筒升起，取下标本玻片。

立即用擦镜纸将镜头上的香柏油擦净。

4.2 革兰氏染色
（1）左手持菌液试管,右手持接种环在火焰中灼烧,冷却后从试管中取菌液一滴,在洁净载玻片上做一涂膜。

（2）在空气中自然干燥。

（3）用镊子夹住涂片一端,在火焰上连续通过三次，以载玻片在手背上试感觉不烫为宜。

（4）滴加数滴结晶紫染液于细菌涂片上，染色1分钟，水洗。

（5）用卢戈氏碘液覆盖涂片1分钟，水洗。

（6）滴加95%的乙醇，轻轻摇动玻片进行脱色，直至流出的乙醇无紫色时，水洗。

（7）滴加蕃红染液复染2分钟以上，水洗，吸干镜检。

5 实验结果
5.1细菌装片的观察
（1）金黄葡萄球菌：呈球形或近似球形，个体微小。

（2）四联球菌：以四个球菌排呈方形。

（3）枯草芽孢杆菌：杆状，单个或链状排列，有的细胞中间可见椭圆形芽孢。

（4）螺菌：弧形，两头染色深，中间稍浅，将孔径光阑稍调小可见很细微的鞭毛。

（5）大肠杆菌：杆状。

（6）破伤风梭菌：有的细胞没有芽孢，呈梭形染色较浅半透明。

有芽孢的细胞呈蝌蚪状，芽孢很大位于菌体顶端，芽孢边缘染色深，中间稍浅。

（7）固氮菌：菌体呈圆形，周围有无固定形态的荚膜。

5.2 革兰氏染色观察
大肠杆菌在革兰氏染色后呈红色，故为革兰氏阴性菌，而金黄色葡萄球菌在革兰氏染色后呈紫色，故为革兰氏阳性菌。

5.3 菌落观察
分别观察了平板划线法培养的金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和大肠杆菌，菌落都较小，呈点状，表面呈现蜡状。

6 实验反思：
（1）使用油镜时要注意使用完毕后要及时用清洗液清洗镜头并及时擦净。

（2）革兰氏染色，载玻片是否干净、取菌量、合适的菌龄、热固定及每一步水洗和酒精脱色程度是实验成功的关键。