肿瘤标志物检测方法
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
癌胚抗原（CEA mRNA）用于结直肠癌、胃癌、胰 腺癌、乳腺癌等CEA分泌性肿瘤；
甲胎蛋白（AFP mRNA）用于肝细胞癌微转移的检 测。
七 生物芯片水平
基因芯片：Zhu G报道用显微分割和芯片技术 结合分析乳房癌不同部位肿瘤细胞之间基因 表达差异；
组织芯片：组织芯片可以帮助节省试剂、人 力和费用。过去分析一个肿瘤的试剂量现在 可以分析高达数百甚至上千个肿瘤，而且是 在同一张切片上同时进行；
SELDI-TOF-MS由蛋白质芯片、飞行质谱和分 析软件部分组成。
八 表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术（二）
生物样品（如血清、细胞）
基本工作原理
特定蛋白质被特定的芯片表面
吸附到芯片上 洗脱
非特异性结合的蛋白质
特异性结合的蛋白质
＋能量
吸收分子
结合的蛋白质解析形成荷电离子（＋、－）
质
谱
软件分析
20世纪90年代，RIA技术研究的主要进展是试管 固相法。学者将试管固相法称之为第四代RIA。
1 放射免疫分析（二）
固相RIA和免疫放射测量法（IRMA）的灵敏度、 特异性、稳定性及测量范围均优于液相竞争法；
尤其是不需要使用离心机进行分离，简化了操作 步骤，提高了检测的精密度；
活化试管RIA和IRMA技术系共价键结合，包被均 一，稳定性好，实现了分析技术一步法，易于实 现自动化分析。
图
肿瘤标记物
八 表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术（三）
缺陷及进一步改进：SELDI-TOF-MS自身也存 在一定的缺陷，需要进一步的完善，如应保证操 作平台的稳定性， 可设计相应的蛋白芯片试剂 盒，降低耗材成本，便于推广。
20世纪90年代后期，在EIA中引进了放大系统， 主要是生物素—亲和素系统的应用，使测定的灵 敏度赶上或超过了RIA。
2 酶免疫分析（二）
酶联免疫荧光测量法（ELIFA）同时兼具酶联 免 疫 吸 附 试 验 （ ELISA ） 和 荧 光 免 疫 分 析 （FIA）两种方法的优点，其灵敏度较传统的 ELISA明显提高，最小检出值达10-15mol/L。
可检测AFP、CEA、CA19-9、CA72-4、CA125、 CA15-3、NSE、Cyfra21-1、PSA、f-PSA等。
1 放射免疫分析（一）
放射免疫分析 （radio immunoassay,RIA） 放 射免疫分析自20世纪60年代问世以来，在生物医 学各个领域得到了广泛的应用。
蛋白芯片：为多标志联合检测提供了理想工 具，英国RANDOX公司已经在全球同时推出 的包括8种肿瘤标志的蛋白芯片。
八 表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术（一）
表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术（SELDI-TOF-MS）：
是近几年新兴的差异蛋白质组学技术，具有快 速、准确、高通量、灵敏度高等特点，为蛋白 质研究提供了一项有效技术，加快了肿瘤标记 物的筛选和研究。
四 细胞水平
细胞水平：流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）。 利用FCM对细胞、细胞器的结构和某些功能进行定量
检测； 利用细胞表面特征性标记对特定的细胞亚群进行分析和
分选的先进技术方法。 利用FCM检测白血病和淋巴瘤标记物（CD系列）利于
诊断和鉴别诊断； 利用FCM检测恶性肿瘤细胞的P-gp，可为临床选择化
增强发光酶免疫分析法（ELEIA）是20世纪80 年代后期发展起来的新型免疫分析技术，其特 点是：酶促增强发光信号，且发光信号保持稳 定，该方法的最小检出值达10-20mol/L。
3 化学发光免疫分析（一）
化学发光免疫分析 （chemiluminesent immunoassay,CLIA）
三 组织化学水平
常规标本中约5％－15％疑难病例和恶性肿瘤需 采用免疫组化进行鉴别诊断和预后分析。
Porter D利用mRNA原位杂交检测细胞水平基 因表达，在组织芯片上免疫组织化学检测乳房 导管原位癌和浸润癌病理学特征和临床意义。
图像分析技术可以定量测定组织切片上肿瘤细 胞DNA量和形态学分析，对判断肿瘤恶性程度 及预后具有重要临床价值。
疗药物提供依据； 利用FCM检测消化道肿瘤外周血CD44水平。
六 分子水平
分子学水平：聚合酶链反应法（PCR）是一种极为 简单、敏感、高效、特异和快速的能在体外扩增 DNA的技术。
国内外用RT-PCR方法检测外周血中的肿瘤细胞的 主要标记基因有细胞角蛋白19（CK19 mRNA）和 20 （CK20 mRNA）用于上皮性恶性肿瘤；
4 时间分辨荧光免疫分析（二）
运用Eu3＋标记物重组G 蛋白作为通用示踪物极大地提 高了标记化合物的质量，有利于降低非特异性结合。提 高半抗原标记率将方法的灵敏度提高到一个新水平，以 适应生物样品中浓度很低的物质的测定。
一种将半抗原和聚赖氨酸结合作为标记Eu3＋的前体； 一种将链亲和素与甲状腺素球蛋白结合作为标记Eu3＋
2 酶免疫分析（一）
酶免疫分析（enzyme immunoassay,EIA） 由于 RIA和IRMA有着自身固有的、难以克服的缺陷， Engvall和Vanweemen各自领导的研究小组分别以 酶代替同位素，于1971年创立了酶免疫分析技术 (EIA)。因其标记物制备简单，有效期长，对环 境无污染等特点，EIA技术得到了迅速的普及和 发展。
1981年，Pannagli将化学发光原理与免疫反应结合起来 建立了化学发光免疫分析法（CLIA）。
这种方法虽然灵敏度可以达到放免的水平，但是影响检 测结果的因素较多，稳定性较差，而且在发生化学反应 之后，样品的发光无法再现。
使用甲基吖啶酯标记抗体更为理想，因不必加催化剂， 所以受外界因素的干扰少，且操作简单，稳定性高，标 记蛋白后不影响发光信号的产生。在这一领域全自动测 定仪器的研制发展很快，极大地提高了该方法的分析效 率和普及推广。
肿瘤标志物检测方法
一 概述
同一个标志物可以用不同的方法检测，如可 以从血清水平、免疫组化水平检测CEA和P－gp 等，也可以从细胞和分子水平用FCM平
血清学水平：除了传统的放射免疫分析(RIA)和 酶联免疫分析（ELISA)外。
目前在国内主要有三类全自动免疫化学分析系统 （化学免疫发光免疫分析系统、荧光免疫分析系 统和电化学发光免疫分析系统）广泛的应用于临 床，对血清肿瘤标记物检测具有快速、准确、半 定量。
3 化学发光免疫分析（二）
近年来，免疫电化学发光（IECL）技术正在快速发 展。这一方法具有灵敏、快速、稳定、选择性强、 重现性好、易于操作、方法灵活多样的优点。它是 集电化学发光、生物素—抗生物素、免疫分析，并 由固相免疫分析发展起来的磁微球等技术于一体， 是众多学科交叉的研究领域。
IECL分析方法多样，广泛地应用于抗原、半抗原和 抗体的免疫检测，其线性范围也较宽，符合临床检 验的需要。IECL技术的发展趋势在于合成新的发光 标记物，优化标记技术和免疫分析方法。
的前体。
利用这两种人工合成的标记前体制备的Eu3＋标记物， 将方法的灵敏度提高了1－2 个数量级。
五 电镜水平
电镜水平：电镜酶细胞化学水平技术、免疫电镜 技术、原位杂交电镜技术。
三 组织化学水平
组织化学：免疫组化和原位分子杂交组化技术是 今年发展起来的一门边缘学科。
它将免疫学技术和分子生物学技术同组织病理学 切片方法巧妙结合在一起，在组织细胞原位显示 某些化学成分和特定基因片断。
4 时间分辨荧光免疫分析（一）
时间分辨荧光免疫分析（time resolved fluorecence immunoassay,TRFIA）
是20世纪80年代初问世的另一种非放射性免疫分析法, 其主要特点是示踪物为标记稀土元素,如Eu3＋、 Tb3＋ 或Sm3＋。
TRFIA灵敏度高、应用范围广，目前已实现分析技术完 全自动化。
甲胎蛋白（AFP mRNA）用于肝细胞癌微转移的检 测。
七 生物芯片水平
基因芯片：Zhu G报道用显微分割和芯片技术 结合分析乳房癌不同部位肿瘤细胞之间基因 表达差异；
组织芯片：组织芯片可以帮助节省试剂、人 力和费用。过去分析一个肿瘤的试剂量现在 可以分析高达数百甚至上千个肿瘤，而且是 在同一张切片上同时进行；
SELDI-TOF-MS由蛋白质芯片、飞行质谱和分 析软件部分组成。
八 表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术（二）
生物样品（如血清、细胞）
基本工作原理
特定蛋白质被特定的芯片表面
吸附到芯片上 洗脱
非特异性结合的蛋白质
特异性结合的蛋白质
＋能量
吸收分子
结合的蛋白质解析形成荷电离子（＋、－）
质
谱
软件分析
20世纪90年代，RIA技术研究的主要进展是试管 固相法。学者将试管固相法称之为第四代RIA。
1 放射免疫分析（二）
固相RIA和免疫放射测量法（IRMA）的灵敏度、 特异性、稳定性及测量范围均优于液相竞争法；
尤其是不需要使用离心机进行分离，简化了操作 步骤，提高了检测的精密度；
活化试管RIA和IRMA技术系共价键结合，包被均 一，稳定性好，实现了分析技术一步法，易于实 现自动化分析。
图
肿瘤标记物
八 表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术（三）
缺陷及进一步改进：SELDI-TOF-MS自身也存 在一定的缺陷，需要进一步的完善，如应保证操 作平台的稳定性， 可设计相应的蛋白芯片试剂 盒，降低耗材成本，便于推广。
20世纪90年代后期，在EIA中引进了放大系统， 主要是生物素—亲和素系统的应用，使测定的灵 敏度赶上或超过了RIA。
2 酶免疫分析（二）
酶联免疫荧光测量法（ELIFA）同时兼具酶联 免 疫 吸 附 试 验 （ ELISA ） 和 荧 光 免 疫 分 析 （FIA）两种方法的优点，其灵敏度较传统的 ELISA明显提高，最小检出值达10-15mol/L。
可检测AFP、CEA、CA19-9、CA72-4、CA125、 CA15-3、NSE、Cyfra21-1、PSA、f-PSA等。
1 放射免疫分析（一）
放射免疫分析 （radio immunoassay,RIA） 放 射免疫分析自20世纪60年代问世以来，在生物医 学各个领域得到了广泛的应用。
蛋白芯片：为多标志联合检测提供了理想工 具，英国RANDOX公司已经在全球同时推出 的包括8种肿瘤标志的蛋白芯片。
八 表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术（一）
表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术（SELDI-TOF-MS）：
是近几年新兴的差异蛋白质组学技术，具有快 速、准确、高通量、灵敏度高等特点，为蛋白 质研究提供了一项有效技术，加快了肿瘤标记 物的筛选和研究。
四 细胞水平
细胞水平：流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）。 利用FCM对细胞、细胞器的结构和某些功能进行定量
检测； 利用细胞表面特征性标记对特定的细胞亚群进行分析和
分选的先进技术方法。 利用FCM检测白血病和淋巴瘤标记物（CD系列）利于
诊断和鉴别诊断； 利用FCM检测恶性肿瘤细胞的P-gp，可为临床选择化
增强发光酶免疫分析法（ELEIA）是20世纪80 年代后期发展起来的新型免疫分析技术，其特 点是：酶促增强发光信号，且发光信号保持稳 定，该方法的最小检出值达10-20mol/L。
3 化学发光免疫分析（一）
化学发光免疫分析 （chemiluminesent immunoassay,CLIA）
三 组织化学水平
常规标本中约5％－15％疑难病例和恶性肿瘤需 采用免疫组化进行鉴别诊断和预后分析。
Porter D利用mRNA原位杂交检测细胞水平基 因表达，在组织芯片上免疫组织化学检测乳房 导管原位癌和浸润癌病理学特征和临床意义。
图像分析技术可以定量测定组织切片上肿瘤细 胞DNA量和形态学分析，对判断肿瘤恶性程度 及预后具有重要临床价值。
疗药物提供依据； 利用FCM检测消化道肿瘤外周血CD44水平。
六 分子水平
分子学水平：聚合酶链反应法（PCR）是一种极为 简单、敏感、高效、特异和快速的能在体外扩增 DNA的技术。
国内外用RT-PCR方法检测外周血中的肿瘤细胞的 主要标记基因有细胞角蛋白19（CK19 mRNA）和 20 （CK20 mRNA）用于上皮性恶性肿瘤；
4 时间分辨荧光免疫分析（二）
运用Eu3＋标记物重组G 蛋白作为通用示踪物极大地提 高了标记化合物的质量，有利于降低非特异性结合。提 高半抗原标记率将方法的灵敏度提高到一个新水平，以 适应生物样品中浓度很低的物质的测定。
一种将半抗原和聚赖氨酸结合作为标记Eu3＋的前体； 一种将链亲和素与甲状腺素球蛋白结合作为标记Eu3＋
2 酶免疫分析（一）
酶免疫分析（enzyme immunoassay,EIA） 由于 RIA和IRMA有着自身固有的、难以克服的缺陷， Engvall和Vanweemen各自领导的研究小组分别以 酶代替同位素，于1971年创立了酶免疫分析技术 (EIA)。因其标记物制备简单，有效期长，对环 境无污染等特点，EIA技术得到了迅速的普及和 发展。
1981年，Pannagli将化学发光原理与免疫反应结合起来 建立了化学发光免疫分析法（CLIA）。
这种方法虽然灵敏度可以达到放免的水平，但是影响检 测结果的因素较多，稳定性较差，而且在发生化学反应 之后，样品的发光无法再现。
使用甲基吖啶酯标记抗体更为理想，因不必加催化剂， 所以受外界因素的干扰少，且操作简单，稳定性高，标 记蛋白后不影响发光信号的产生。在这一领域全自动测 定仪器的研制发展很快，极大地提高了该方法的分析效 率和普及推广。
肿瘤标志物检测方法
一 概述
同一个标志物可以用不同的方法检测，如可 以从血清水平、免疫组化水平检测CEA和P－gp 等，也可以从细胞和分子水平用FCM平
血清学水平：除了传统的放射免疫分析(RIA)和 酶联免疫分析（ELISA)外。
目前在国内主要有三类全自动免疫化学分析系统 （化学免疫发光免疫分析系统、荧光免疫分析系 统和电化学发光免疫分析系统）广泛的应用于临 床，对血清肿瘤标记物检测具有快速、准确、半 定量。
3 化学发光免疫分析（二）
近年来，免疫电化学发光（IECL）技术正在快速发 展。这一方法具有灵敏、快速、稳定、选择性强、 重现性好、易于操作、方法灵活多样的优点。它是 集电化学发光、生物素—抗生物素、免疫分析，并 由固相免疫分析发展起来的磁微球等技术于一体， 是众多学科交叉的研究领域。
IECL分析方法多样，广泛地应用于抗原、半抗原和 抗体的免疫检测，其线性范围也较宽，符合临床检 验的需要。IECL技术的发展趋势在于合成新的发光 标记物，优化标记技术和免疫分析方法。
的前体。
利用这两种人工合成的标记前体制备的Eu3＋标记物， 将方法的灵敏度提高了1－2 个数量级。
五 电镜水平
电镜水平：电镜酶细胞化学水平技术、免疫电镜 技术、原位杂交电镜技术。
三 组织化学水平
组织化学：免疫组化和原位分子杂交组化技术是 今年发展起来的一门边缘学科。
它将免疫学技术和分子生物学技术同组织病理学 切片方法巧妙结合在一起，在组织细胞原位显示 某些化学成分和特定基因片断。
4 时间分辨荧光免疫分析（一）
时间分辨荧光免疫分析（time resolved fluorecence immunoassay,TRFIA）
是20世纪80年代初问世的另一种非放射性免疫分析法, 其主要特点是示踪物为标记稀土元素,如Eu3＋、 Tb3＋ 或Sm3＋。
TRFIA灵敏度高、应用范围广，目前已实现分析技术完 全自动化。