土霉素在中华绒螯蟹肝胰腺中的药代动力学及残留消除规律

土霉素在中华绒螯蟹肝胰腺中的药代动力学及残留消除规律封琦;王权;顾伟;梁廷明;王文;吴光红
【摘要】采用高效液相色谱法,研究了土霉素在中华绒螯蟹肝胰腺中的药代动力学特征及残留消除规律.结果表明,(18±1)℃的水温条件下,单剂量肌肉注射给药40 mg/kg体重,肝胰腺药时曲线关系符合带时滞的一级吸收一室开放模型:C
=69.45×[e-0.005(t-0.0387)-e-8.195(t-0.038 7)].主要药代动力学参数为:药时曲线下总面积(AUC0-∞)为16 352.31μg·h/mL,药物平均驻留时间(MRTo-∞)为178.79 h,总体清除率(CL8)为0.002 45 L/kg·h,表观分布容积(Vd/F)为0.46 L/kg,基于末端消除相的消除半衰期(t1/2β)为130.71 h.与鱼类相比,土霉素在中华绒螯蟹肝胰腺中的消除速率快于冷水种,慢于温水种.在水生甲壳动物中,其消除速率也缓于其他物种.建议中华绒螯蟹给药后79.51 d后方能上市,以保证安全食用,合理推荐剂量为41.85 mg/kg体重.
【期刊名称】《江苏农业科学》
【年(卷),期】2013(041)003
【总页数】4页(P260-263)
【关键词】中华绒螯蟹;土霉素;药代动力学;消除规律;休药期;高效液相色谱
【作者】封琦;王权;顾伟;梁廷明;王文;吴光红
【作者单位】江苏省畜牧兽医职业技术学院动物科技系,江苏泰州225300;江苏省畜牧兽医职业技术学院动物科技系,江苏泰州225300;江苏省淡水水产研究所,江苏南京210017;江苏省淡水水产研究所,江苏南京210017;江苏省淡水水产研究所,江苏南京210017;江苏省生物多样性与生物技术重点实验室,江苏南京210046
【正文语种】中文
【中图分类】S948
中华绒螯蟹(Eriorcheir sinensis)俗称河蟹、大闸蟹，是我国内陆水域中最重要的
名特优养殖品种之一。

随着养殖规模扩大，集约化程度不断提高，各种疾病也日趋严重，在中华绒螯蟹众多病害中，颤抖病最常见、危害最为严重。

王文等开展了中华绒螯蟹颤抖病病原的分离、纯化、培养、Koch’s法则验证等方面的研究，并
结合分子生物学方法，明确其为螺原体类(spiroplasma)微生物[1-2]。

梁廷明等通过螺原体药敏试验筛选出了特效药物土霉素并结合毒性试验以及回感治疗试验提供了给药方案[3]。

土霉素(OTC)是美国FDA批准的第1个渔用抗生素，因其具有抗菌谱广、杀菌力强、价廉易得等特点，已在水产病害的控制中广泛应用。

近年来，国内外许多学者对土霉素在水产动物体内的药代特征及残留消除规律进行了广泛研究，但主要集中于鱼类和虾类[4-14]，而有关土霉素在中华绒螯蟹体内的药代和消除规律研究尚未见报道。

中华绒螯蟹肝胰腺(即“蟹黄”)为其重要的药物代谢器官，还是人们所喜爱的美食，而以往的报道大多以血淋巴和肌肉组织为研究对象。

本试验主要研究土霉素肌注给药后在中华绒螯蟹肝胰腺内的代谢过程和消除规律，有助于指导生产用药，确定休药期，防治滥用药物，保障健康安全消费。

1 材料与方法
1.1 试验动物
健康中华绒螯蟹(Eriorcheir sinensis)购自江苏省淡水水产研究所，体质量80～120 g，共150只。

试验前于南京禄口水产养殖基地循环水控温养殖池(4.0
m×3.0 m×1.0 m)中暂养1周，投喂的饲料由南通正大饲料有限公司提供。

试验
用水为曝气48 h的自来水，连续充氧，试验水温为(18±1) ℃，试验过程中停饲。

1.2 药品及试剂
土霉素原药(含量95%)购自江苏今牧公司，盐酸土霉素标准品纯度(99%)，购自Sigma公司。

乙腈为色谱纯，Tedia公司产品；盐酸、磷酸、高氯酸、磷酸氢二钠，分析纯，南京化学试剂一厂产品。

0.05 mol /L磷酸氢二钠溶液：精确称量17.907 g Na2HPO4 ·12H2O和0.373 g EDTA-Na2盐溶于1 L 超纯水，用磷酸调节pH值=2.5。

标准液配制：称取0.01 g 盐酸土霉素标准品溶于 0.01 mol/L 磷酸氢二钠，定容至100 mL，得到100 μg/mL 盐酸土霉素的母液。

采用流动相逐级稀释配制工作曲线。

1.3 试验仪器
Agilent1100型高效液相色谱仪，色谱柱为ZORBAX C18，4.6×250 mm，DAD 检测器。

Beckman Avanti J26XP 高速冷冻离心机，Direct-Q3超纯水系统(millipore)，BSA-CW分析天平，BUCHI R-215旋转蒸发仪，KINEMATICA实验室匀浆机，德国BS14-WXZ涡旋振荡器，梅特勒S20K酸度计，CYS-1001 微型超声波清洗机。

1.4 试验设计与采样
肌注给药：土霉素原粉4 g溶解于100 mL 5 % 盐酸水溶液，配成40 mg/mL的注射液。

给药前，每只中华绒螯蟹称重并用75%乙醇体表消毒。

通过中华绒螯蟹第4步足与体壁关节膜处肌肉注射，按体重换算给药。

采样：给药后的5、10、15、30 min及1、2、4、6、8、12、24、48、72、168、336 h取肝胰腺。

每一时间点各取10只中华绒螯蟹(雌雄各半)。

样品置于-20 ℃冻存。

同时将为给药的一组按同样时间程序采样作为对照组。

1.5 样品预处理
样品室温下自然解冻，置高速匀浆机中打散。

准确称取(5.000±0.001) g 样品于
50 mL离心管中，加入1 %高氯酸溶液10 mL，涡旋仪振荡15～30 s ，10 000
r/min离心10 min，取上清。

再分别以15、15、10 mL高氯酸溶液加入残渣提
取3次，合并上清(0.45 μm滤膜)过滤。

预处理采用AccuBOND ODS-
C18(Agilent，3 mL/500 mg)固相萃取柱，先用5 mL甲醇、2 mL 5 %EDTA，5 mL超纯水依次洗柱；控制上样流速，使样品缓慢通过；用10 mL超纯水洗去杂质；20 mL 5 %三乙胺甲醇溶液洗脱；收集洗脱液，50 ℃水浴旋转蒸干。

流动相
定容至5 mL，0.45 μm滤膜过滤，取20 μL进样。

1.6 流动相和色谱条件
流动相为体积比为18 ∶82的乙腈-0.05 mg/L磷酸氢二钠溶液(含 0.001 mol/L EDTA，pH值2.5)混合液，使用前超声波脱气10 min。

柱温，37 ℃；流速，1.0 mL/min；检测波长355 nm。

1.7 数据分析
1.7.1 药代动力学分析 3P97药动软件(中国药理学会数学专业委员会编制)采用Marquardt法对1、2、3房室分别以权重1、1/C、1/C/C等3种情况进行计算，依据残差平方和与AIC值判别最适模型。

中华绒螯蟹肝胰腺药物浓度-时间曲线关系采用房室模型拟合，药代动力学参数分别采用经典房室模型和统计矩原理来推算。

以药时曲线消除相末端4个时间点数据作对数线性回归，斜率即用来估测消除速
率常数β；按照公式：t1/2β=0.693/β推算消除半衰期(t1/2β)[15]；给药剂量优
化则根据公式：Cmin=Dose×e-βtd/Vd(area)推算，Cmin为最低有效浓度，td
为药效期[16]。

1.7.2 休药期的计算休药期选用欧盟兽药委员会(Committee for Veterinary Medicinal Products，CVMP)制定的统计方法(WT1.4软件)，该法主要基于对数
线性模型计算组织中药物浓度低于最高残留所必须的时间[17]。

2 结果与分析
2.1 土霉素样品及标准品的色谱行为及标准曲线
在本试验色谱条件下，土霉素标准品和样品的保留时间都在5.344 min左右(图1、图2)。

样品中虽有杂质峰出现，但与目标化合物峰分离良好(图2)。

由图3可知，土霉素在0.05～20 μg/mL范围内有良好线性关系，其回归方程为：y=29.709x-3.67，相关系数r2为0.9998。

2.2 土霉素在肝胰腺组织中的药时曲线及药代动力学参数
肝胰腺中药时曲线呈现典型的双峰现象。

肌注给药后 2 h 药物浓度达到第1个峰
值[(102.02±10.92) μg/mL]，这一阶段药物吸收速度较快；随后药物浓度一直呈
下降趋势；24 h 后药物浓度又开始上升，至48 h出现第2个峰浓度
[(58.27±3.26) μg/mL]；以后一直持续到试验结束，药物浓度缓慢下降(图4)。

OTC在中华绒螯蟹肝胰腺中的药代动力学特征符合带时滞的一级吸收一室开放模型，其理论方程为：
C=69.45×[e-0.005(t-0.0387)-e-8.195(t-0.038 7)]，拟合度r2=0.999
9(P<0.01)。

尾段消除相速率常数β为0.005h-1，与运用房室模型计算出的消除
速率Ke值一致；相应消除半衰期t1/2β为130.71 h。

主要药动学参数详见表1。

基于药动学参数优化后的给药剂量为41.85 mg/kg体重，略高于本试验所采用的梁廷明等[3]推荐的治疗剂量40 mg/kg体重。

2.3 最高残留限量设定与休药期的计算
参照我国农业部食品安全标准设定最高残留限量(MRL，0.1 mg/kg-OTC)，推算
出水温(18±1) ℃时，在肌肉注射单次给药剂量为40 mg/kg体重情况下，休药期
为79.51 d(图5)。

表1 肌肉注射给药后土霉素在中华绒螯蟹肝胰腺中的药代动力学参数[(18±1) ℃]参数单位数值房室模型Aμg/mL69.45Keh-10.005Kah-18.195T0h0.038 7非房室模型AUC0-∞μg·h/mL16 352.31MRT0-∞h178.79CLSL/(kg·h)0.002 45Vd/F L/kg0.46
注：A为分布相与消除相的零时截距；Ka、Ke分别为为一级吸收速率常数和消除速率常数；T0 为时滞；AUC0～∞为药时曲线下总面积；MRT0～∞ 为总的药物平均驻留时间；CLS表示总体清除率；Vd/F为表观分布容积。

3 讨论
3.1 检测方法的可行性
提取液采用高氯酸能有效去除蛋白质[18]；洗脱液中的三乙胺作为扫尾剂，能有效改善色谱分离过程碱性化合物拖尾现象，达到增加峰形对称性的效果[19]；流动相中加入EDTA-Na2是为了螯合色谱柱中的杂质金属离子，避免土霉素与柱结合，从而造成对目标分析化合物的量低估以及拖尾[20]。

以引起3倍基线噪音的药物浓度为检测限(LOD)，本法的LOD为0.015 μg/mL。

0.1、10 μg平均加标回收率分别为74.18%、86.97%。

日内精密度为2.67%，日间精密度为8.56%，满足了本研究的药代动力学分析要求。

3.2 药动模型选择比较
以往有关肝脏组织的药代动力学研究大多采用二室模型[21-23]，本研究中则发现一室模型拟合效果更好。

考虑到各自研究的试验条件，采样点设计以及药物不同，很难判断究竟哪种模型更合适。

非房室模型不受经典房室模型的限制，适用于任何房室，仅假设药物末端以单指数消除，目前的体内数据解析中非房室模型已经成为主流处理的方法，各国药品审评当局均推荐采用[24- 25]。

为方便与前人的结果相
比较，因而本研究采用基于统计矩的非房室模型来进行探讨。

3.3 土霉素在肝胰腺组织中的吸收和分布
肌注给药后中华绒螯蟹肝胰腺中的药物峰浓度(102.02±10.92 μg/mL)远远高于锯缘青蟹[23](32.12 μg/mL)和牙鲆[8](13.78 μg/mL)。

相应达峰时间(2 h)也快于后两者(锯缘青蟹4 h；牙鲆4 h)。

这主要是由于口灌给药方式下，药物首先要通过
肝肠循环的首过作用才能到达作用部位[26]，而肌肉注射条件下药物吸收分布较快。

本研究中所观察到的双峰药时曲线与田中二良[27]、李美同等[28]和郭海燕等[29]
的研究结果类似，这表明土霉素在河蟹肝胰腺中同样存在着重吸收现象。

最后4
个时间点的药时曲线下面积占整个药时曲线总面积的67.61%，从数量上证实了重吸收的存在。

这部分重吸收的药量不可能来源于甲壳类外骨骼，因为在2～14 d
这么短的时间内外骨骼中与Ca2+、Mg2+螯合的OTC根本来不及缓慢释放；也
不可能是残留在注射部位的药物缓慢释放造成的，由于甲壳类具备开管式循环系统，肌肉注射给药时到达体循环的药量会被完全吸收。

Warner提出，排泄器官绿腺的主要功能并非清除体内垃圾，而是调节体内离子平衡和选择性过滤重吸收[30]。

因此土霉素在肝胰腺中的重吸收现象可能与绿腺的重吸收机制相关。

3.4 土霉素在肝胰腺中的消除规律
本研究中采用非房室模型与房室模型算出的消除速率结果相等(均为0.005 h-1)，
进一步验证了模型的拟合效果很好。

与鱼类肝脏中的代谢情况相比，土霉素在中华绒螯蟹肝胰腺中的消除速率[(18±1) ℃，0.12 d-1]介于冷水种[大鳞大麻哈鱼
15 ℃，0.097 d-1[31]；虹鳟鱼(10±0.5) ℃，0.103 d-1[32]；鲑鱼(10±0.5) ℃，0.068 d-1[32]与温水种[草鱼(21±1) ℃，0.34 d-1[33]]之间。

而在甲壳动物肝胰
腺中，土霉素的消除半衰期则按中国对虾(23～25 ℃，t1/2β-16.12 h)[34]、锯缘青蟹[(27±1) ℃，t1/2β-71 h][23]、中华绒螯蟹[(18±1) ℃，t1/2β-130.71 h]顺
序递增。

由此看来，除了种属间的生理结构差异，温度影响可能是影响消除速率的
主导因素[11]。

3.5 给药方案的优化
药代动力学研究的主要目的之一就是为了制定合理的给药方案。

前期体外药敏试验得出土霉素针对中华绒螯蟹螺原体的最小抑菌浓度MIC为2 μg/mL[3]，采用Excel软件参照一室模型方程推算出药效期td为719.38 h，接近30 d。

结合药动参数优化后的给药剂量为41.85 mg/kg体重，接近于回感治疗试验得出的最适剂量40 mg/kg体重，理论上确认了梁廷明等结果的合理性[3]。

3.6 休药期的制定
有关休药期的计算软件国内外仅有2种[35]，而且国内开发的仅适用于静脉注射二室模型，不适用于本研究，因此采用欧盟标准软件WT-1.4。

本试验所采用的温度为(18±1) ℃，这主要是从病害预防角度模拟春末夏初病原潜伏期施药的水温条件。

考虑到不同的水温药物消除速率不一样，过长或过短的休药期都会对养殖户造成不利影响，为了方便广大养殖户参考，将休药期以度日值(℃·d)为单位来表示：在本研究条件下[肌肉注射单次给药，水温(18±1) ℃，剂量 40 mg/kg 体重]，土霉素
在中华绒螯蟹肝胰腺中的休药期为1 432度日。

4 总结和展望
综上所述，本研究建立的高效液相检测方法适于中华绒螯蟹肝胰腺中土霉素的残留分析(LOQ<MRL-0.10 mg/kg)；揭示了土霉素在中华绒螯蟹肝胰腺中的代谢动力学过程，发现土霉素在中华绒螯蟹肝胰腺中同样存在重吸收现象，消除速率除了受到种属差异影响之外，温度影响较大；提供了合理的给药剂量和休药期建议。

今后的研究重点将集中在探讨多种给药途径(口灌、药浴)、各种水温条件以及不同生理状况(健康与颤抖病感染)下的群体药代动力学特征，为生产实践中的科学防治提供理论依据。

参考文献:
【相关文献】
[1]Wang W，Zhu N N，Gu Z F，et al. Study on the transmission of tremor disease(TD)in the Chinese mitten crab，Eriocheir sinensis (Crustacea ： Decapoda)[J]. Journal of Invertebrate Pathology，2002，81(3)： 202-204.
[2]Wang W，Wen B H，Gasparich G E，et al. A spiroplasma associated with tremor disease in the Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis)[J]. Microbiology，2004，150(Pt 9)：3035-3040.
[3]Liang T M，Feng Q，Wu T，et al. Use of oxytetracycline for the treatment of tremor disease in the Chinese mitten crab Eriocheir sinensis[J]. Disease of Aquatic Organisms，2009，84(3)： 243-250.
[4]王群，孙修涛，刘德月，等. 土霉素在黑鲷体内的药物代谢动力学研究[J]. 海洋水产研究，2001，22(1)： 42-47.
[5]李雪梅，张其中，魏明. 土霉素在鱼体内的动力学研究概况[J]. 水利渔业，2004，24(5)： 8-9.
[6]杨贤庆，李来好，郝淑贤，等. 土霉素在凡纳滨对虾肌肉组织中残留情况的研究[J]. 热带海洋学报，2007，26(3)： 53-56.
[7]郑增忍，赵思俊，邹明，等. 土霉素在大菱鲆体内药代动力学及残留消除规律研究[J]. 中国农学
通报，2008，24(10)： 559-563.
[8]纪荣兴，刘爱原，张春丽，等. 土霉素在牙鲆体内的药代动力学研究[J]. 海洋科学，2008，32(7)：38-41，45.
[9]Schifferli D，Galeazzi R L，Nicolet J，et al. Pharmacokinetics of oxytetracycline and therapeutic implications in veal calves[J]. Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，1982，5(4)： 247-257.
[10]Black W D，Ferguson H W，Byrne P，et al. Pharmacokinetic and tissue distribution study of oxytetracycline in rainbow trout following bolus intravenous administration[J]. Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，1991，14(4)： 351-358.
[11]Rigos G，Alexis M，Andriopoulou A，et al. Pharmacokinetics and tissue distribution
of oxytetracycline in sea bass，Dicentrarchus labrax，at two water temperatures[J]. Aquaculture，2002，210(1/2/3/4)： 59-67.
[12]Reed L A，Siewicki T C，Shah J C. Pharmacokinetics of oxytetracycline in the white shrimp，Litopenaeus setiferus[J]. Aquaculture，2004，232(1/2/3/4)： 11-28.
[13]Chiayvareesajja S，Chandumpai A，Theapparat Y，et al. The complete analysis of oxytetracycline pharmacokinetics in farmed Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei)[J]. Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，2006，29(5)： 409-
414.
[14]Poapolathep A，Poapolathep S，Jermnak U，et al. Muscle tissue kinetics of oxytetracycline following intramuscular and oral administration at two dosages to giant freshwater shrimp (Macrobrachium rosenbergii)[J]. Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，2008，31(6)： 517-522.
[15]Baggot J D. Drug disposition//Baggot J D. Principles of drug disposition in domestic animals the basis of veterinary clinical pharmacology[M]. Philadelphia，PA： W. B. Saunders，1977：48-72.
[16]Doi A M，Stoskopf M K，Lewbart G A. Pharmacokinetics of oxytetracycline in the red pacu (Colossoma brachypomum) following different routes of administration[J]. Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，1998，21(5)： 364-368.
[17]Concordet D，Toutain P L. The withdrawal time estimation of veterinary drugs revisited[J]. Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，1997，20(5)： 380-386.
[18]王绍云，周光明，王莉. 反相高效液相色谱法测定肝组织中土霉素、四环素残留量[J]. 西南师范大学学报：自然科学版，2005，30(6)： 1078-1081.
[19]于世林. 高效液相色谱方法及应用[M]. 北京：化学工业出版社，2000： 195-230.
[20]Oka H，Ito Y，Matsumoto H. Chromatographic analysis of tetracycline antibiotics in foods[J]. Journal of Chromatography A，2000，882(1/2)： 109-133.
[21]吴光红，张静波，孟勇，等. 不同水温下恩诺沙星在中华绒螯蟹体内药物代谢动力学[J]. 南京农业大学学报，2008，31(2)： 105-110.
[22]李海迪，杨先乐，胡鲲，等. 双氟沙星及其代谢产物在中华绒螯蟹体内药物代谢及残留消除规律[J]. 动物学杂志，2009，44(2)： 12-20.
[23]陈玉露，房文红，周凯，等. 土霉素在锯缘青蟹体内的药物代谢和消除规律[J]. 海洋渔业，2009，31(2)： 154-160.
[24]王广基. 药物代谢动力学[M]. 北京：化学工业出版社，2005： 136-145.
[25]操继跃，卢笑丛. 兽医药物动力学[M]. 北京：中国农业出版社，2005： 161-162.
[26]Gibaldi M，Perrier D. 药物动力学[M]. 北京：科学出版社，1981： 317-322.
[27]田中二良. 水产药详解[M]. 北京：农业出版社，1982： 127-150.
[28]李美同，郑国兴. 土霉素在鳗鲡组织中残留的消除规律[J]. 水产学报，1997，21(1)： 39-43.
[29]郭海燕，张其中，李雪梅. 两种给药途径土霉素残留在鲫鱼体内的消除规律[J]. 淡水渔业，2005，35(2)： 17-20.
[30]Warner G F. The biology of crabs[M]. New York： Van Nostrand Reinhold Company，1977： 21-23.
[31]Namdari R，Abedini S，Law F. Tissue distribution and elimination of oxytetracycline in seawater chinook and coho salmon following medicated-feed treatment[J]. Aquaculture，1996，144(1/2/3)： 27-38.
[32]Namdari R，Abedini S，Law F C P. A comparative tissue distribution study of oxytetracycline in rainbow trout，Oncorhynchus mykiss (Walbaum)，and chinook salmon，Oncorhynchus tshawytscha(Walbaum)[J]. Aquaculture Research，1999，30(4)： 279-286.
[33]Zhang Q Z，Li X M. Pharmacokinetics and residue elimination of oxytetracycline in grass carp，Ctenopharyngodon idellus[J]. Aquaculture，2007，272(1/2/3/4)： 140-145. [34]Wang W F，Lin H，Xue C，et al. Elimination of chloramphenicol，sulphamethoxazole and oxytetracycline in shrimp，Penaeus chinensis following medicated-feed treatment[J]. Environment International，2004，30(3)： 367-373.
[35]王静，吴光红，孟勇. 针对二室模型的渔药休药期计算软件设计[J]. 渔业现代化，2009，
36(1)： 9-13.。