凋亡 死亡检测

LSC（激光扫描细胞仪）基本应用之一：细胞凋亡检测
1，Annexin V/PI双染
凋亡或称为细胞程序性死亡是一种在许多细胞系统中观察到的普遍现象。

细胞调亡特征包括细胞形态变小，染色质浓缩和由于核酸内切酶的作用而形成的核小体。

在细胞凋亡早期，细胞膜的磷酸双分子层会发生变化。

磷酸双分子层的组成物phosphotidylserine会曝露出来并在经荧光标记后可被检测。

Annexin V是annexin家族成员之一，是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白。

Annexin V与磷脂双分子层中的PS有高度亲合力。

使用FITC标记的Annexin V和PI染料可识别出细胞膜发生改变的和丧失膜完整性的细胞群体。

当使用LSC分析时，细胞可在Annexin V 和PI染色的指引下通过CompuSort被定位。

LSC检测优点：检测时需要的样本量极少；每种类型的细胞都可观察其形态；
Annexin V染色扩展应用：
1，与DNA电泳相结合，分析DNA慧星实验
2，与DAPI染色相结果，查看DNA含量与AnnexinV阳性之间关系
2，单链DNA检测
细胞发生凋亡时，DNA双链会解开从而形成单链。

AO染料与双链DNA结合时发出330nm 的荧光，当与单链DNA结合时发出600nm以上的荧光。

据此可以识别出具有单链结构的凋
亡细胞。

3，DNA皱缩或DNA小体形成
细胞发生凋亡后，DNA会生皱缩并逐步碎裂成为DNA小体。

如果G2/M期细胞发生凋亡时，
其DNA调亡峰会形成在S期细胞群体间；G0/G1期细胞发生凋亡时，其凋亡细胞出现在
Sub-G1期位置。

都可通过观察其形态来进行确认。

4，Bax蛋白迁移至线粒体（集中化），N-kappa B由胞浆向胞核转移
正常细胞Bax蛋白分散分布在细胞浆及细胞核内，当细胞发生凋亡时Bax蛋白会集中到线
粒体内。

LSC通过Max Pixel信号并给合DNA周期信号，可分析出Bax蛋白的再分布情况。

核因子N-kappa -κb （NF-κb ）是一具有多功能转录与调节作用的蛋白质因子，它能与多种细胞因子和粘附因子基因启动子部位发生结合，增强某些基因的转录和表达，还可能延缓PMN 的凋亡，从而广泛参与基因转录的调节，特别是一些与机体免疫应答反映密切相关的基因的转录和调控。

其活化所导致的Tnf-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1等细胞因子发生改变。

正常细胞的N-kappa B 分布在胞浆内，当细胞发生凋亡时其会聚集到细胞核内。

通过LSC 的识别细胞核及细胞浆能力可分别检测它的分布含量。

5，H2AX-DNA断裂点检测
DNA双链断裂是电离辐射对DNA的重要损伤类型，与细胞死亡、基因突变甚至细胞恶性转化有密切联系。

DNA发生双链断裂后最早反应之一是位于断裂点附近的组蛋白H2AX的C末端丝氨酸残基发生磷酸化，形成γ-H2AX。

磷酸化的γ-H2AX快速转导DNA损伤信号，导致下游分子磷酸化的激活，引发一系列的生物级联反应和和细胞学反应。

γ-H2AX是迄今所研究的最重要的DNA损伤感应分子。

HL-60细胞经顺铂处理后，按不同时间点检测其DNA修复情况
6，活细胞检测细胞周期、细胞凋亡、细胞死亡
Hoechst 33342可直接渗入活细胞内染色DNA，从而可取得活细胞群体内细胞周期的分布情况。

Mitoshift探针可以检测线粒体的膜电位，早期发生凋亡的细胞仍保持膜电位，后期凋亡则丧失膜电位。

YO-PRO-1在细胞发生凋亡细胞膜通透性发性改变后就可染色细胞。

当细胞死亡后核膜完整性丧失后，可被PI染色，表示细胞死亡。

R3：YoPro+/Mitoshif+ 膜通透改变，线粒体膜电位存在，早期凋亡细胞
R4：YoPro+/Mitoshif- 膜通透改变，线粒体膜电位丧失，晚期凋亡细胞
R5：YoPro弱阳/Mitoshif-膜通透改变得十分巨大，而丢失YoPro染色，更晚期凋亡R2：YoPro+/Mitoshif+/- 活细胞
给合分析DNA周期分布。