一株柱状假丝酵母产脂肪酶条件的优化研究

一株柱状假丝酵母产脂肪酶条件的优化研究
徐启峻;滕宏飞;黄程;赵玉谨;罗红宇
【摘要】对一株柱状假丝酵母菌的产酶条件进行了优化.确定最佳培养基配方为橄榄油6 g/L、酵母膏9 g,/L、吐温-80 1％、CaC12 0.5 g/L、K2HPO42 g/L、MgSO4·7H2O2 g/L、pH自然;确定最优发酵条件为培养基初始pH5.2、培养时间25 h、摇床转速150 r/min.在最适产酶条件下,重复发酵5批后柱状假丝酵母所产脂肪酶平均酶活在(15.00±0.05) U/mL,RSD为2.34％,重复性较好.该株酵母菌生存环境为酸性,并在pH为5.2时产酶效果最好,推导该脂肪酶为酸性脂肪酶,对油脂水解产生的游离脂肪酸将会有一定程度的抵抗作用.此外,柱状假丝酵母培养25h 后即可获得最佳产酶效果,发酵周期短,既能节约成本,又能提高单位时间产酶量,适用于工业化生产.
【期刊名称】《中国油脂》
【年(卷),期】2015(040)005
【总页数】6页(P70-75)
【关键词】柱状假丝酵母;酸性脂肪酶;生长;产酶
【作者】徐启峻;滕宏飞;黄程;赵玉谨;罗红宇
【作者单位】浙江海洋学院食品与药学学院,浙江舟山316004;浙江海洋学院食品与药学学院,浙江舟山316004;浙江海洋学院食品与药学学院,浙江舟山316004;浙江海洋学院食品与药学学院,浙江舟山316004;浙江海洋学院食品与药学学院,浙江舟山316004
【正文语种】中文
【中图分类】Q55;TQ426
脂肪酶，又称三酰基甘油酯水解酶，是一类特殊的酯键水解酶，主要水解由甘油和12个碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油酯[1]。

由于脂肪酶的催化底物为水不溶性的油脂类物质，因此该酶只能作用于异相或有机相中。

有研究表明，在水溶液中，脂肪酶催化酯类的水解反应, 而在有机溶剂中则催化酯化反应及酯交换反应[2]。

脂肪酶的这种特殊的催化行为使其在食品、医药、环保、皮革、饲料及生
物柴油等领域得到广泛的应用[3]。

矫春丽等[4]利用南极假丝酵母脂肪酶B合成手性药物；潘虹等[5]对有机相中的脂肪酶催化合成肉桂酸肉桂酯进行了研究；杨欣
等[6]利用黑曲霉脂肪酶对菜籽油脚料进行水解。

脂肪酶的来源包括动植物和微生物。

微生物脂肪酶比动植物脂肪酶具有更大范围的作用pH、反应温度及对底物的专一性等优势[7]，因而得到广泛的研究并用于工业生产。

目前，产脂肪酶菌株主要集中在根霉[8]、曲霉[9]、假丝酵母[10]、青霉[11]、毛霉[12]、假单胞菌[13]等。

优良的产酶菌株应至少满足非致病、不产毒素、发酵周期短、培养基低廉、不易变异、对噬菌体不敏感等条件。

假丝酵母脂肪酶被许多研究者认为是最好的用于水解反应的脂肪酶。

江华等[14]利用柱状假丝酵母脂肪酶去除麦秸中亲脂类抽提物；甘争艳等[15]在无溶剂体系中，对假丝酵母脂肪酶Lipase AY 30G水解油脂的性能进行了研究。

我们对购自中国农业微生物菌种保
藏管理中心的一株柱状假丝酵母的最适产酶条件进行优化研究，以期为后续的酵母细胞固定化和产酶及水解鱼油等天然油脂的工作提供理论支持。

1.1 试验材料
1.1.1 原料与试剂
马铃薯，购自农贸市场。

柱状假丝酵母(Candida cylindracea)，编号20339，购于中国农业微生物菌种保
藏管理中心(ACCC)。

橄榄油，化学纯。

葡萄糖、琼脂、液体石蜡、甘油、浓HCl、无水乙醇、聚乙烯醇(PVA，聚合度1 750±50)、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4·2H2O、
MgSO4·7H2O、NaOH、邻苯二甲酸氢钾、酚酞、95%中性酒精、吐温-80、吐
温-20、Triton X-100等，均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备
YXQ-LS-100G型立式压力蒸汽灭菌器；VS-1300L-U型双人单面垂直流净化工作台；DNP型系列电热恒温培养箱；HZQ-X100型恒温双层振荡培养箱；CU420
型电热恒温水箱；JZ-Ⅱ型均质器；BSA 124S型精密电子天平，Sartorius 公司。

1.1.3 培养基
斜面培养基：将100 g去皮、去芽眼、切成薄片的马铃薯放入锅中，加入500 mL 水，煮沸20～30 min至马铃薯软而不烂时，用6～8层纱布过滤，取滤汁于锅中，补水至500 mL，即得马铃薯汁，加10 g葡萄糖，煮沸后加入10 g琼脂，融化后补足失水至500 mL，pH自然。

种子培养基：葡萄糖3 g/L，橄榄油3 g/L，蛋白胨4 g/L，酵母膏4 g/L，
K2HPO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，pH自然。

基础发酵培养基：葡萄糖3 g/L，橄榄油3 g/L，蛋白胨4 g/L，酵母膏4 g/L，吐温-80 5%，K2HPO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，pH自然。

1.2 试验方法
1.2.1 菌种活化
无菌条件下，向盛有菌体干粉的安瓿瓶中注入300 μL无菌生理盐水使菌体悬浮。

用接种环挑取1环菌悬液，采取三区划线法接种到固体平板上，25℃下培养48 h。

挑取平板上长势较好的单菌落，镜检确认没有杂菌后，转移到斜面培养基上，25℃
下培养，得到斜面菌种。

1.2.2 发酵培养基配方及培养条件的优化
用接种环挑取1环斜面菌种至60 mL种子培养基中，25℃、120 r/min下培养
24 h，得种子液。

种子液按1%的接种量加入到60 mL基础发酵培养基中，25℃、120 r/min 培养48 h。

以发酵液的酶活为考察指标，采用单因素试验法考察不同
碳源、氮源、表面活性剂对柱状假丝酵母发酵产酶的影响，并考察Ca2+对其产生与分泌脂肪酶的诱导作用。

在此基础上，运用正交试验法对上述因素的组合进行优化，并采用SPSS软件对数据进行分析，以获得柱状假丝酵母最佳产酶条件。

同时，考察了柱状假丝酵母发酵初始pH、发酵时间、摇床转速对酵母生长及产酶的影响。

菌种接种量皆为1%。

1.2.3 脂肪酶活力测定
采用改进的橄榄油乳化法：将橄榄油与2% PVA按1∶4的比例加入均质器中，5 000 r/min下匀浆2 min，制成橄榄油质量分数为20%的乳化液。

取两只250 mL 三角瓶，依次作为空白瓶(A)和样品瓶(B)，分别向其中加入橄榄油乳化液5 mL和0.025 mol/L pH 7.5磷酸缓冲液3 mL，再于A瓶中加入95%乙醇15 mL，同时置于40℃水浴5 min，然后在两瓶中各加入发酵上清液1 mL，100 r/min振荡反应15 min后，在B瓶中立即加入95%乙醇15 mL终止反应，加酚酞指示剂2滴，用0.05 mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至微红色为终点。

酶活力定义为：40℃、pH 7.5的条件下，1 mL酶液中，每分钟催化油脂水解产
生1 μmol游离脂肪酸的脂肪酶的量称为1个脂肪酶活力单位(U/mL)。

2.1 培养基配方优化
2.1.1 单因素试验
2.1.1.1 不同碳源对酵母产酶的影响
在基础发酵培养基中，分别以6 g/L的蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、橄榄油、可溶性淀
粉、α-乳糖、β-环糊精为单一碳源，以3 g/L的蔗糖和3 g/L的橄榄油、3 g/L的麦芽糖和3 g/L的橄榄油、3 g/L的葡萄糖和3 g/L的橄榄油、3 g/L的可溶性淀粉和3 g/L的橄榄油、3 g/L的α-乳糖和3 g/L的橄榄油、3 g/L的β-环糊精和3 g/L的橄榄油为复合碳源，pH自然，于120 r/min、25℃培养48 h后，测定培养液中脂肪酶酶活，结果如图1所示。

由图1可以看出，该酵母菌在无橄榄油存在时，亦可产生少量的脂肪酶，以橄榄油为单一碳源进行诱导获得的发酵液脂肪酶酶活最高。

向单一碳源中添加橄榄油组成复合碳源均可以提高发酵液的酶活，但增加幅度不大，说明酵母优先利用的是非油脂碳源。

因此，培养基选择6 g/L的橄榄油作为最适碳源。

2.1.1.2 不同氮源对酵母产酶的影响
在基础发酵培养基中，以6 g/L的橄榄油作为唯一碳源，分别以8 g/L的蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、牛肉膏、尿素为单一氮源，并两两组合(1∶1)形成复合氮源(见表1)，pH自然，于120 r/min、25℃培养48 h后，测定培养液中脂肪酶酶活，结果如图2所示。

由图2可以看出，2号发酵液的酶活显著高于其他单一氮源的发酵液，说明酵母膏有利于酵母细胞分泌脂肪酶。

2号发酵液与其他复合氮源发酵液比较，添加有酵母膏的6号、10号、11号、12号发酵液的酶活较其他复合氮源发酵液的酶活高，但均低于2号发酵液，可能是因为这几种发酵液中酵母膏的质量浓度(4 g/L)均低于2号培养基(8 g/L)，说明酵母膏的质量浓度对酵母细胞产酶影响较大。

因此，培养基选择8 g/L的酵母膏为最适氮源。

2.1.1.3 表面活性剂对酵母产酶的影响
微生物脂肪酶大多为胞外酶，脂肪酶在胞内合成并向外环境中分泌时，会受到细胞壁的阻碍，从而影响发酵液的酶活。

表面活性剂可以与细胞壁上的脂蛋白结合，破坏细胞壁的结构，使其通透性增大，从而利于脂肪酶的分泌[16]。

在基础发酵培养
基中，以6 g/L的橄榄油为碳源，以8 g/L的酵母膏为氮源，分别添加5%的不同种类的表面活性剂，pH自然，于120 r/min、25℃培养48 h后，测定培养液中
脂肪酶酶活，结果如图3所示。

由图3可以看出，添加吐温-20的发酵液检测不出脂肪酶酶活，可能是因为此种表面活性剂对酵母生长或产酶有较强的抑制作用；不含表面活性剂的发酵液与添加PVA的发酵液的酶活相差不大，说明PVA对酵母产酶没有明确作用；Triton X-100可以在一定程度上促进酵母细胞产酶，但不如吐温-80的效果好。

因此，选择吐温-80 作为最适表面活性剂。

2.1.1.4 Ca2+对酵母产酶的影响
酶的活性与其构象有关，无机离子与酶结合后，若能稳定酶的构象则可以激活酶的活性，否则会有抑制作用。

在基础发酵培养基中，以6 g/L的橄榄油为碳源，以8 g/L的酵母膏为氮源，考察分别添加1 g/L的CaCO3、1 g/L的CaCl2对柱状假
丝酵母产酶的影响，并与不含Ca2+的培养基比较，结果如图4所示。

由图4可以看出，3种培养基中，添加CaCO3的发酵液酶活最低，与空白组相比，酶活降低30.51%，添加CaCl2的发酵液酶活最高，与空白组相比，酶活高
17.34%。

说明CaCl2可以在一定程度上促进酵母细胞产酶。

Ca2+通道广泛存在
于各种生物组织的细胞膜中，对细胞的功能调节起着重要的作用，其中对于细胞膜通透性的调节非常关键。

Ca2+浓度越高，线粒体膜的膜电位越高，使 ADP磷酸
化为 ATP为细胞增殖提供能量，从而促进菌株的生长和发酵[17]。

因为CaCl2是强电解质，所以完全解离的Ca2+能增加细胞膜通透性，促进酶的释放，同时提高膜电位供给细胞生产和发酵所需的能量；而CaCO3不溶于水，Ca2+不易释放到
培养基中，且还会与培养基中的酸性成分作用，改变培养环境，从而影响酵母的产酶。

因此，选择向培养基中加入1 g/L的CaCl2作为激活剂。

2.1.2 正交试验
根据单因素试验结果，选择正交表L16(45)，对橄榄油、酵母膏、吐温-80及CaCl2做四因素四水平的正交试验，正交试验因素水平见表2，正交试验结果与分析见表3，方差分析见表4。

由表3极差分析可知， 4个因素对酵母产酶的影响主次顺序为A>B>C>D。

由表
4可知，橄榄油、酵母膏对酵母产酶影响显著(P<0.05)，而吐温-80及CaCl2添加量影响不显著(P>0.05)。

酵母细胞发酵产酶的最佳工艺条件为A1B1C3D2，即橄
榄油6 g/L、酵母膏9 g/L、吐温-80 1%、CaCl2 0.5 g/L，在此条件下配制培养
基并进行验证试验，3个平行样的发酵液酶活平均可达到(10.67±0.05)U/mL。

由此，确定了发酵培养基的最佳配方为橄榄油6 g/L、酵母膏9 g/L、吐温-80 1%、CaCl2 0.5 g/L、K2HPO4 2 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L、pH自然。

2.2 培养条件的优化
2.2.1 培养基初始pH对酵母产酶的影响
培养基的酸碱环境对微生物的产酶甚至生长有较大的影响。

配制不同pH的最佳发酵培养基，于120 r/min、25℃培养48 h后，测定发酵液酶活，结果如图5所示。

由图5可以看出，该株酵母细胞在偏酸性的条件下均可产酶，且培养基初始pH为5.2时，可以获得最大酶活。

2.2.2 培养时间对酵母产酶的影响
采用最佳发酵培养基(pH 5.2)对酵母细胞进行培养(120 r/min，25℃)，每隔2 h
取样1次，共取24组(包括0 h时的发酵液)，测定发酵液在波长为420 nm时的OD值。

从发酵10 h开始，每隔5 h取样1次，测定发酵液酶活，共取8组，结果如图6、图7所示。

由图6可以看出，柱状假丝酵母在培养10 h后开始进入对数生长期，培养25 h
后进入稳定期。

由图7可以看出，发酵液酶活随培养时间的延长而升高，并在培
养25 h时达到最大值；培养时间超过25 h，发酵液酶活开始下降，可能是因为细
胞在通过对数生长期后，分泌一些次级代谢产物抑制了脂肪酶的活性；培养45 h 后，细胞开始进入衰亡期，活细胞数目开始减少，但脂肪酶活性略有上升，可能是因为细胞死亡破裂后，释放了滞留在细胞内未完全分泌出的脂肪酶。

因此，选择培养25 h的发酵液进行后续试验。

2.2.3 摇床转速对酵母产酶的影响
培养基的溶氧量通过摇床转速进行控制。

考察了最优发酵培养基(pH 5.2)在25℃、不同摇床转速下，培养25 h后发酵液的酶活，结果如图8所示。

由图8可以看出，随着摇床转速的提高，发酵液的酶活显著增大，当摇床转速为150 r/min时，发酵液酶活达到14.33 U/mL。

这说明酵母合成并分泌脂肪酶需要氧气的参与，摇床转速越快，培养基与氧气的接触面积越大，因而溶解的氧气也越多。

在一定范围内(60～120 r/min)，摇床转速与溶氧量呈正相关，当摇床转速较
高(>120 r/min)时，提高摇床转速对溶氧量的增加影响不大，转速过高(>150
r/min)还会导致“出液”的发生。

因此，对于60 mL容量的小瓶发酵，选择摇床
转速为150 r/min。

2.3 验证试验
在最佳培养基配方(橄榄油6 g/L、酵母膏9 g/L、吐温-80 1%、CaCl2 0.5 g/L、
K2HPO4 2 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L、pH自然)和最优培养条件(培养基初始
pH 5.2，培养时间25 h，摇床转速150 r/min)下进行柱状假丝酵母细胞的发酵产酶研究，重复培养5批，发酵液平均酶活在(15.00±0.05)U/mL，RSD为2.34%，表现出良好的稳定性。

(1)本试验对一株柱状假丝酵母菌的产酶条件行了优化，确定最佳培养基配方为橄
榄油6 g/L、酵母膏9 g/L、吐温-80 1%、CaCl2 0.5 g/L K2HPO4 2 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L、pH自然；最优培养条件为培养基初始pH 5.2、培养时间25 h、摇床转速150 r/min。

在最适产酶条件下，重复发酵5批后发酵液的平均
酶活在(15.00±0.05)U/mL，RSD为2.34%，重复性较好。

(2)该株酵母菌可以油脂为单一碳源，且酶活高于其他试验碳源的酶活，在油脂诱导下，脂肪酶伴随细胞的生长而产生，但在有其他碳源存在时，酵母菌优先利用其他碳源。

当前研究的微生物脂肪酶以碱性居多，本试验研究的酵母菌生存环境为酸性，并在pH 5.2时产酶效果最好，意味着其产生的脂肪酶为酸性脂肪酶，对油脂水解产生的游离脂肪酸将会有一定程度的抵抗作用。

此外，该菌培养25 h后即可获得最佳产酶效果，发酵周期短，既能节约成本，又能提高单位时间产酶量，适用于工业化生产。