丹芎瘢痕涂膜TLC鉴别方法的改进
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化疗阳 性 组 药 物 选 环 磷 酰 胺 （ 下 简 为 称 CTX） ： 200mg / 瓶，上海华联制药有限公司。批号： 012034 号。 根据临床人用药量为 400 ～ 2000mg，计算体外细胞浓 度 为 55. 56μg / mL。 临 用 时 配 所 需 CTX 浓 度 555. 6μg / mL（ 96 孔 板，扩 大 10 倍） 及 5. 56mg / mL （ 6 孔板，扩大 100 倍） 。 1. 3 主要试剂 RPMI-1640 （ 每升含 20% 小牛血清、
丹芎瘢痕涂膜为 外 用 药，治 疗 深 Ⅱ 度 烧 烫 伤 创 面 已愈合瘢痕尚未形成、或瘢痕形成初期，用于减轻和辅 助治疗烧烫伤创面愈合后的瘢痕增生，具有活血化瘀、 软坚、止痒。其主要成分为丹参、当归、川芎、桃仁、红 花、山慈姑、五味子、苦参、乳香（ 制） 、没药（ 制） 、冰片、 甘草． 在实际工作中，笔者按照国家药典标准对丹芎瘢 痕涂膜中丹参的薄层色谱鉴别方法进行检验，受展开 剂的影响，结果重现行差，所显斑点时常不好，有时出 现重叠现 象，容 易 导 致 错 误 结 论。 为 此，笔 者 通 过 试 验，对标准方法进行改进，色谱结果令人满意，并对其 内容进行补充，使标准叙述更明确。 1 药理作用
收稿日期： 2010 － 03 － 10 作者简介： 陈宇（ 1978 － ） ，女，辽宁锦州人，讲师，学士，研究方向： 生药
学。
图 1 薄层色谱图
辽宁中医杂志 2010 年第 37 卷第 11 期
·2215·
抗癌扶正方对人肝癌细胞 SMMC-7721 的 P53 基因表达的调控作用
叶丽红，皮文霞，程海波，俞晶华，张 旭，章永红
释至刻度，摇匀，放置过夜，精密量取上清液 50mL，水 浴挥散溶剂至 3mL，滴加乙醚 20mL，边加边搅拌，定量 转移至 50mL 棕 色 瓶 中，加 乙 醚 约 40mL，超 声 处 理 30min，放冷，加乙醚稀释至刻度，摇匀，放置 3h，精密 量取上清液 25mL，水浴挥散溶剂至约 1mL，用氯仿 － 无水乙醇（ 4∶ 1） 的混合溶液溶解，定量转移至 2mL 的 容量瓶中作为供试品，照薄层色谱法（ 中国药典 2000 年版二部） 试 验，吸 取 对 照 品 溶 液 丹 参 酮 Ⅱ A3mL 和 6mL，供试品 6mL 分别点于同一硅胶 G 板上，以石油 醚（ 60 ～ 90℃ ） － 苯 － 乙酸乙酯（ 15 ∶ 15 ∶ 2） 为展开剂， 欲饱和 15min 后展开，大约展开距离 10cm 后，取出晾 干，立即检视（ 供试品溶液与对照品溶液在相同位置 斑点颜色相同均为粉红色斑点） 。 3. 3 改进方法（ 2） 取样品 20g，精密称定，逐步滴加 乙醚 50mL，边加边搅，定量转移至 100mL 棕色容量瓶 中，加乙醚 90mL，超声处理约 30min，放冷，加乙醚稀 释至刻度，摇匀，放置过夜，精密量取上清液 50mL，水 浴挥散溶剂至 3mL，滴加乙醚 20mL，边加边搅拌，定量 转移至 50mL 棕 色 瓶 中，加 乙 醚 约 40mL，超 声 处 理 30min，放冷，加乙醚稀释至刻度，摇匀，放置 3h，精密 量取上清液 25mL，水浴挥散溶剂至约 1mL，用氯仿 － 无水乙醇（ 4∶ 1） 的混合溶液溶解，定量转移至 2mL 的 容量瓶中作为供试品，照薄层色谱法（ 中国药典 2000 年版二部） 试验，吸取对照品溶液丹参酮 ⅡA 2mL 和 4mL，供试品 6mL 分别点于同一硅胶 G 板上，以石油 醚（ 60 ～ 90℃ ） － 1. 2 二氯乙烷 － 乙酸乙酯（ 15∶ 1∶ 1） 为 展开剂，欲 饱 和 15min 后 展 开，大 约 展 开 距 离 10cm 后，取出晾干； 立即检视（ 供试品溶液与对照品溶液在 相同位置斑点颜色相同均为粉红色斑点，将薄层板放 于 CS920 薄层扫描仪，中，在波长 480nm 下，分别对照 品和供试品进行扫描） 。 3. 4 结果 由以上色谱图 1 － 1，1 － 2 可见，按标准方 法检验，丹参酮 AⅡ与杂质分不开，再次试验，杂质斑 点位置不变，结果不稳定，重现性不好，图 1 － 3 显示改 进方法所显斑点分离效果好，无重叠现象，结果明确。 我们又取不同批次的样品三批，按改进方法进行多次 实验，样品溶液与对照品溶液所显斑点位置与颜色一 致，且结果稳定，重现性好。
临床前动物试验结果提示： 本品能抑制大鼠烧伤 性、豚鼠创伤性瘢痕组织成纤维细胞、纤维细胞、毛细 血管增生，缩小瘢痕面积，降低胶原纤维含量，减少炎 症细胞浸润，提高热致痛小鼠痛阈，延长小鼠温浴反应 后尾回缩潜伏期； 减少右旋糖酐致小鼠皮肤瘙痒次数 及持续时间，提高豚鼠对组胺的耐受量； 抑制大鼠棉球 肉芽组织增生及混合致炎剂致小鼠耳肿胀； 增加皮肤 微循环血流量。 2 仪器与试剂
·2214·
辽宁中医杂志 2010 年第 37 卷第 11 期
丹芎瘢痕涂膜 TLC 鉴别方法的改进
陈 宇，刘海英
（ 辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032）
关键词： 丹芎瘢痕涂膜； TLC 鉴别； 改进 中图分类号： R284. 1 文献标识码： A
文章编号： 1000 － 1719（ 2010） 11 － 2214 － 02
博士，从事内科的教学、临床及科研工作，着重研究内科杂病 及肿瘤的中医药防治。 通讯作者： 章永红（ 1951 － ） ，教授，博士研究生导师，博士，从事内科的 教学，临床及科研工 作，着 重 研 究 内 科 杂 病 及） 方法（ 3） 与方法（ 2） 相比将展开剂由石油醚
（ 南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210029）
摘 要： 目的： 探讨国医大师经验方“抗癌扶正方”的抗肝癌作用及机制。方法： 提取抗癌扶正方，针对人肝癌细胞 SMMC-7721，经过细胞培养、MTT 法、流式细胞仪检该方对肝癌细胞生长抑制率的影响及对突变型 P53 基因表达的调控作 用。结果： 抗癌扶正方具有良好的抑制肝癌细胞生长作用，尤其以 1mg / mL，10mg / mL 剂量组的效果最佳，作用程度与化 疗药物类似。此方可以下调凋亡抑制基因突变型 P53 的表达。结论： 抗癌扶正方能够抑制人肝癌细胞 SMMC-7721 活性。 其机理在于降低肝癌凋亡抑制基因的表达，促进细胞凋亡的产生。
关键词： 抗癌扶正方； 人肝癌细胞 SMMC-7721； 生长抑制率； 突变型 P53 基因 中图分类号： R285. 5 文献标识码： A 文章编号： 1000 － 1719（ 2010） 11 － 2215 － 03
Inhibiting Effect and Mechanism of Kangai Fuzheng Prescription（ ALC） for Human Hepatoma SMMZ-7721 Cell and Expression of P53
Key words： Kangai Fuzheng Prescription； Hepatoma cell of SMMZ-7721； Growth inhibiting rate； Mutation gene P53
根据导师周仲瑛教授在临床治疗中常用的药物及 配伍，选用漏芦 10g，泽漆 10g，当归 10g 等，组成“抗癌 扶正方”。从细胞实验角度，针对人肝癌细胞 SMMC7721，通过细胞培养以及分光光度计、流式细胞仪检测 “抗癌扶正方”对肝癌细胞生长抑制率及对 P53 基因表 达的调控 的 影 响。 从 而 探 讨“抗 癌 扶 正 方 ”的 抗 肝 癌 的作用及机制。 1 实验材料 1. 1 细胞 人肝癌细胞 SMMC-7721 购自中科院上海 细胞所，复苏后使用。 1. 2 药物 抗癌扶正方的药物均购自我校中西医结 合门诊，由南京中医药大学中药学院中药鉴定及药物
化学实验室 皮 文 霞 副 教 授 鉴 定 并 制 成“抗 癌 扶 正 方 ” 药液。根据预实验的结果，将原配浓度 1. 18g / mL，配 制 成 细 胞 培 养 所 需 10μg / mL，100μg / mL，1mg / mL， 10mg / mL，100mg / mL，1g / mL，高温灭菌后，置 4℃ 冰箱 中保存、备用。
4讨论
（ 1） 方法（ 2） 在方法（ 1） 的基础上进行了除杂质提
收稿日期： 2010 － 03 － 17 基金项目： 江苏省自然科学基金项目（ BK2007240） ； 国家科技支撑计划
（ 2006BAI11B08 － 01） 作者简介： 叶丽红（ 1967 － ） ，女，副教授、副主任医师，硕士研究生导师，
仪器： CS920 薄层扫描仪（ 日本岛津） ： 丹参酮ⅡA 由辽宁省药检所提供； 薄层板： 硅胶 G 板 10cm × 20cm 自制，试剂： 均为分析纯； 样品： 丹芎瘢痕涂膜（ 鞍山制 药有限公司） 。 3 方法与结果 3. 1 标准方法 取样品 20g，精密称定，逐步滴加乙 醚 50mL，边 加 边 搅，定 量 转 移 至 100mL 棕 色 容 量 瓶 中，加乙醚 90mL，超声处理约 30min，放冷，乙醚稀释 至刻度，摇匀，放置过夜，精密量取上清液 50mL，水浴 挥散溶剂至约 1mL。用氯仿 － 无水乙醇（ 4∶ 1） 的混合 溶液溶解，定量转移至 2mL 的容量瓶中作为供试品． 照薄层色谱法（ 中国药典 2000 年版二部） 试验，吸取 对照品溶液丹参酮ⅡA 3mL 和 6mL，供试品 6mL 分别 点于同一硅胶 G 板上，以石油醚（ 60 ～ 90℃ ） － 苯 － 乙 酸乙酯（ 15∶ 15∶ 2） 为展开剂，展开，大约展开距离 10cm 后，取出晾干，立即检视。（ 供试品溶液与对照品溶液 在相同位置斑点颜色相同均为粉红色斑点） 。 3. 2 改进方法（ 1） 取样品 20g，精密称定，逐步滴加 乙醚 50mL，边加边搅，定量转移至 100mL 棕色容量瓶 中，加乙醚 90mL，超声处理约 30min，放冷． 加乙醚稀
YE Li-hong，PI Wen-xia，CHENG Hai-bo，YU Jing-hua，ZHANG Xu，ZHANG Yong-hong （ Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，Jiangsu，China）
Abstract： Objective： To Probe the anticancer effect of Kangai Fuzheng Prescription which is from national experienced expert" Zhou Zhongying" ． Methods： Applying Kangai Fuzheng Prescription and human hepatoma SMMZ-7721 cell to cell experiment，detecting the growth inhibiting rate． Detecting the expression of P53 by flowcytometry． Results： It is shown that Kangai Fuzheng Prescription has function to inhibit human hepatoma SMMZ-7721 cell and to decrease the expression of gene inhibitor P53 ． Conclusion： Kangai Fuzheng Prescription could inhibit the growth rate of human hepatoma SMMZ-7721． The mechanism maybe decrease expression of apoptosis gene，promote apoptosis．
丹芎瘢痕涂膜为 外 用 药，治 疗 深 Ⅱ 度 烧 烫 伤 创 面 已愈合瘢痕尚未形成、或瘢痕形成初期，用于减轻和辅 助治疗烧烫伤创面愈合后的瘢痕增生，具有活血化瘀、 软坚、止痒。其主要成分为丹参、当归、川芎、桃仁、红 花、山慈姑、五味子、苦参、乳香（ 制） 、没药（ 制） 、冰片、 甘草． 在实际工作中，笔者按照国家药典标准对丹芎瘢 痕涂膜中丹参的薄层色谱鉴别方法进行检验，受展开 剂的影响，结果重现行差，所显斑点时常不好，有时出 现重叠现 象，容 易 导 致 错 误 结 论。 为 此，笔 者 通 过 试 验，对标准方法进行改进，色谱结果令人满意，并对其 内容进行补充，使标准叙述更明确。 1 药理作用
收稿日期： 2010 － 03 － 10 作者简介： 陈宇（ 1978 － ） ，女，辽宁锦州人，讲师，学士，研究方向： 生药
学。
图 1 薄层色谱图
辽宁中医杂志 2010 年第 37 卷第 11 期
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抗癌扶正方对人肝癌细胞 SMMC-7721 的 P53 基因表达的调控作用
叶丽红，皮文霞，程海波，俞晶华，张 旭，章永红
释至刻度，摇匀，放置过夜，精密量取上清液 50mL，水 浴挥散溶剂至 3mL，滴加乙醚 20mL，边加边搅拌，定量 转移至 50mL 棕 色 瓶 中，加 乙 醚 约 40mL，超 声 处 理 30min，放冷，加乙醚稀释至刻度，摇匀，放置 3h，精密 量取上清液 25mL，水浴挥散溶剂至约 1mL，用氯仿 － 无水乙醇（ 4∶ 1） 的混合溶液溶解，定量转移至 2mL 的 容量瓶中作为供试品，照薄层色谱法（ 中国药典 2000 年版二部） 试 验，吸 取 对 照 品 溶 液 丹 参 酮 Ⅱ A3mL 和 6mL，供试品 6mL 分别点于同一硅胶 G 板上，以石油 醚（ 60 ～ 90℃ ） － 苯 － 乙酸乙酯（ 15 ∶ 15 ∶ 2） 为展开剂， 欲饱和 15min 后展开，大约展开距离 10cm 后，取出晾 干，立即检视（ 供试品溶液与对照品溶液在相同位置 斑点颜色相同均为粉红色斑点） 。 3. 3 改进方法（ 2） 取样品 20g，精密称定，逐步滴加 乙醚 50mL，边加边搅，定量转移至 100mL 棕色容量瓶 中，加乙醚 90mL，超声处理约 30min，放冷，加乙醚稀 释至刻度，摇匀，放置过夜，精密量取上清液 50mL，水 浴挥散溶剂至 3mL，滴加乙醚 20mL，边加边搅拌，定量 转移至 50mL 棕 色 瓶 中，加 乙 醚 约 40mL，超 声 处 理 30min，放冷，加乙醚稀释至刻度，摇匀，放置 3h，精密 量取上清液 25mL，水浴挥散溶剂至约 1mL，用氯仿 － 无水乙醇（ 4∶ 1） 的混合溶液溶解，定量转移至 2mL 的 容量瓶中作为供试品，照薄层色谱法（ 中国药典 2000 年版二部） 试验，吸取对照品溶液丹参酮 ⅡA 2mL 和 4mL，供试品 6mL 分别点于同一硅胶 G 板上，以石油 醚（ 60 ～ 90℃ ） － 1. 2 二氯乙烷 － 乙酸乙酯（ 15∶ 1∶ 1） 为 展开剂，欲 饱 和 15min 后 展 开，大 约 展 开 距 离 10cm 后，取出晾干； 立即检视（ 供试品溶液与对照品溶液在 相同位置斑点颜色相同均为粉红色斑点，将薄层板放 于 CS920 薄层扫描仪，中，在波长 480nm 下，分别对照 品和供试品进行扫描） 。 3. 4 结果 由以上色谱图 1 － 1，1 － 2 可见，按标准方 法检验，丹参酮 AⅡ与杂质分不开，再次试验，杂质斑 点位置不变，结果不稳定，重现性不好，图 1 － 3 显示改 进方法所显斑点分离效果好，无重叠现象，结果明确。 我们又取不同批次的样品三批，按改进方法进行多次 实验，样品溶液与对照品溶液所显斑点位置与颜色一 致，且结果稳定，重现性好。
临床前动物试验结果提示： 本品能抑制大鼠烧伤 性、豚鼠创伤性瘢痕组织成纤维细胞、纤维细胞、毛细 血管增生，缩小瘢痕面积，降低胶原纤维含量，减少炎 症细胞浸润，提高热致痛小鼠痛阈，延长小鼠温浴反应 后尾回缩潜伏期； 减少右旋糖酐致小鼠皮肤瘙痒次数 及持续时间，提高豚鼠对组胺的耐受量； 抑制大鼠棉球 肉芽组织增生及混合致炎剂致小鼠耳肿胀； 增加皮肤 微循环血流量。 2 仪器与试剂
·2214·
辽宁中医杂志 2010 年第 37 卷第 11 期
丹芎瘢痕涂膜 TLC 鉴别方法的改进
陈 宇，刘海英
（ 辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032）
关键词： 丹芎瘢痕涂膜； TLC 鉴别； 改进 中图分类号： R284. 1 文献标识码： A
文章编号： 1000 － 1719（ 2010） 11 － 2214 － 02
博士，从事内科的教学、临床及科研工作，着重研究内科杂病 及肿瘤的中医药防治。 通讯作者： 章永红（ 1951 － ） ，教授，博士研究生导师，博士，从事内科的 教学，临床及科研工 作，着 重 研 究 内 科 杂 病 及） 方法（ 3） 与方法（ 2） 相比将展开剂由石油醚
（ 南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210029）
摘 要： 目的： 探讨国医大师经验方“抗癌扶正方”的抗肝癌作用及机制。方法： 提取抗癌扶正方，针对人肝癌细胞 SMMC-7721，经过细胞培养、MTT 法、流式细胞仪检该方对肝癌细胞生长抑制率的影响及对突变型 P53 基因表达的调控作 用。结果： 抗癌扶正方具有良好的抑制肝癌细胞生长作用，尤其以 1mg / mL，10mg / mL 剂量组的效果最佳，作用程度与化 疗药物类似。此方可以下调凋亡抑制基因突变型 P53 的表达。结论： 抗癌扶正方能够抑制人肝癌细胞 SMMC-7721 活性。 其机理在于降低肝癌凋亡抑制基因的表达，促进细胞凋亡的产生。
关键词： 抗癌扶正方； 人肝癌细胞 SMMC-7721； 生长抑制率； 突变型 P53 基因 中图分类号： R285. 5 文献标识码： A 文章编号： 1000 － 1719（ 2010） 11 － 2215 － 03
Inhibiting Effect and Mechanism of Kangai Fuzheng Prescription（ ALC） for Human Hepatoma SMMZ-7721 Cell and Expression of P53
Key words： Kangai Fuzheng Prescription； Hepatoma cell of SMMZ-7721； Growth inhibiting rate； Mutation gene P53
根据导师周仲瑛教授在临床治疗中常用的药物及 配伍，选用漏芦 10g，泽漆 10g，当归 10g 等，组成“抗癌 扶正方”。从细胞实验角度，针对人肝癌细胞 SMMC7721，通过细胞培养以及分光光度计、流式细胞仪检测 “抗癌扶正方”对肝癌细胞生长抑制率及对 P53 基因表 达的调控 的 影 响。 从 而 探 讨“抗 癌 扶 正 方 ”的 抗 肝 癌 的作用及机制。 1 实验材料 1. 1 细胞 人肝癌细胞 SMMC-7721 购自中科院上海 细胞所，复苏后使用。 1. 2 药物 抗癌扶正方的药物均购自我校中西医结 合门诊，由南京中医药大学中药学院中药鉴定及药物
化学实验室 皮 文 霞 副 教 授 鉴 定 并 制 成“抗 癌 扶 正 方 ” 药液。根据预实验的结果，将原配浓度 1. 18g / mL，配 制 成 细 胞 培 养 所 需 10μg / mL，100μg / mL，1mg / mL， 10mg / mL，100mg / mL，1g / mL，高温灭菌后，置 4℃ 冰箱 中保存、备用。
4讨论
（ 1） 方法（ 2） 在方法（ 1） 的基础上进行了除杂质提
收稿日期： 2010 － 03 － 17 基金项目： 江苏省自然科学基金项目（ BK2007240） ； 国家科技支撑计划
（ 2006BAI11B08 － 01） 作者简介： 叶丽红（ 1967 － ） ，女，副教授、副主任医师，硕士研究生导师，
仪器： CS920 薄层扫描仪（ 日本岛津） ： 丹参酮ⅡA 由辽宁省药检所提供； 薄层板： 硅胶 G 板 10cm × 20cm 自制，试剂： 均为分析纯； 样品： 丹芎瘢痕涂膜（ 鞍山制 药有限公司） 。 3 方法与结果 3. 1 标准方法 取样品 20g，精密称定，逐步滴加乙 醚 50mL，边 加 边 搅，定 量 转 移 至 100mL 棕 色 容 量 瓶 中，加乙醚 90mL，超声处理约 30min，放冷，乙醚稀释 至刻度，摇匀，放置过夜，精密量取上清液 50mL，水浴 挥散溶剂至约 1mL。用氯仿 － 无水乙醇（ 4∶ 1） 的混合 溶液溶解，定量转移至 2mL 的容量瓶中作为供试品． 照薄层色谱法（ 中国药典 2000 年版二部） 试验，吸取 对照品溶液丹参酮ⅡA 3mL 和 6mL，供试品 6mL 分别 点于同一硅胶 G 板上，以石油醚（ 60 ～ 90℃ ） － 苯 － 乙 酸乙酯（ 15∶ 15∶ 2） 为展开剂，展开，大约展开距离 10cm 后，取出晾干，立即检视。（ 供试品溶液与对照品溶液 在相同位置斑点颜色相同均为粉红色斑点） 。 3. 2 改进方法（ 1） 取样品 20g，精密称定，逐步滴加 乙醚 50mL，边加边搅，定量转移至 100mL 棕色容量瓶 中，加乙醚 90mL，超声处理约 30min，放冷． 加乙醚稀
YE Li-hong，PI Wen-xia，CHENG Hai-bo，YU Jing-hua，ZHANG Xu，ZHANG Yong-hong （ Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，Jiangsu，China）
Abstract： Objective： To Probe the anticancer effect of Kangai Fuzheng Prescription which is from national experienced expert" Zhou Zhongying" ． Methods： Applying Kangai Fuzheng Prescription and human hepatoma SMMZ-7721 cell to cell experiment，detecting the growth inhibiting rate． Detecting the expression of P53 by flowcytometry． Results： It is shown that Kangai Fuzheng Prescription has function to inhibit human hepatoma SMMZ-7721 cell and to decrease the expression of gene inhibitor P53 ． Conclusion： Kangai Fuzheng Prescription could inhibit the growth rate of human hepatoma SMMZ-7721． The mechanism maybe decrease expression of apoptosis gene，promote apoptosis．