六种培养料对荷叶离褶伞胞外酶活性的影响

六种培养料对荷叶离褶伞胞外酶活性的影响
李霞
【摘要】为探索培养料对荷叶离褶伞胞外酶活性的影响,测定了荷叶离褶伞菌丝在六种培养料中不同生长发育阶段胞外淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、滤纸纤维素酶活性.结果表明:6种培养料对荷叶离褶伞胞外酶活性有较大影响,对酶活性变化趋势影响较小.荷叶离褶伞在不同培养料中各生长发育阶段,其菌丝分泌的胞外酶活性
表现一定的差异,但同种酶在不同培养料中活性变化的总趋势基本一致.
【期刊名称】《耕作与栽培》
【年(卷),期】2017(000)005
【总页数】3页(P8-10)
【关键词】荷叶离褶伞;培养料;淀粉酶;羧甲基纤维素酶;半纤维素酶;滤纸纤维素酶【作者】李霞
【作者单位】贵州农业职业学院,贵州贵阳551400
【正文语种】中文
荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes)，又名荷叶蘑，粟窝，树窝，一窝羊，茅草菌，北风菌，冷香菌等，属于担子菌亚门(Basidiomycotina)，层菌纲(Hymeno-mycetes)，伞菌目(Agaricales)，白蘑科(Tricholomataceae)，离褶伞属(Lyophyllum)。

荷叶离褶伞主要分布在海拔2800～3200m的丛林中，外观优美，口感脆滑，味道鲜美，子实体含有一定量的蛋白质、氨基酸、微量元素及大量维生素和烟酸，营养物质丰富，富含多糖，脂肪含量低，具有一定的食用和药用价值
[1-2]，深受国内外广大消费者青睐，具有广阔的开发前景。

目前，国内许多学者对荷叶离褶伞野生子实体进行了组织分离、人工驯化、生物学特性、菌丝生长条件等方面的研究[3-7]，但营养生理方面相关研究报道尚少，为此，特研究了荷叶离褶伞在六种培养料上生长期间，淀粉酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、滤纸纤维素酶等胞外酶活性的变化，以期为营养生理方面相关研究及大规模人工栽培生产提供参考。

荷叶离褶伞菌种是由河西学院食用菌研究所分离、纯化得到的纯菌株，菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC No.1518，菌株号ZY48-1。

培养料配方为(w/w)：①棉籽壳62.7%，麸皮 35%，MgSO4 0.1%，KH2PO4
0.1%，白沙糖1%，石膏1%；②木屑77.7%，麸皮20%，MgSO4 0.1%，
KH2PO4 0.1%，白沙糖1%，石膏1%；③棉籽壳77.7%，麸皮20%，
MgSO40.1%，KH2PO4 0.1%，白沙糖1%，石膏1%；④棉籽壳23.7%，麸皮20%，木屑 54%，MgSO4 0.1%，KH2PO4 0.1%，白沙糖1%，石膏1%；⑤麦草77.7%，麸皮20%，MgSO4 0.1%，KH2PO4 0.1%，白沙糖1%，石膏1%；
⑥玉米颖壳77.7%，麸皮20%，MgSO40.1%，KH2PO40.1%，白沙糖1%，石
膏1%。

配方①先按配比称重棉籽壳，麸皮，充分混合，拌匀，加水后使培养料含水量达60～70%，建高1m，宽2m，长以场地为准的发酵堆。

建堆后，分别在每隔7d、5d、3d、2d、1d翻堆，共翻5次，在第三次翻堆时加入其余培养料成分。

其他
5个配方分别按配比称重，拌匀后，直接加水，使培养料含水量达65～70%。

选用17cm×33cm×0.04cm的聚丙烯塑料袋装料，每袋装干料450g，121℃高
压灭菌1.5h，冷却至室温后在超净工作台上接种，各处理接种50袋，每袋接种
15g，置于22℃培养室内暗培养。

在生长发育各阶段取样，测定菌丝的胞外酶活
性。

接种后当菌丝生长至培养袋的2/3时，开始采样测定；采样时随机从不同的培养
袋中取样，每个配方取三袋。

分别从每种栽培袋的培养料下5处取样，每袋取
20g，共取60g，混均匀后取10g置于加入100ml蒸馏水的锥形瓶中，25℃的恒温水浴准确浸提4h，用四层纱布过滤，4000r/min离心5min，上清液即为粗酶液。

取2.1中提取的粗酶液10ml置于100℃恒温水浴锅中煮沸15min，冷却后酶液
即为失活的粗酶液。

DNS试剂按照潘裕添[8]的方法配置。

半纤维素的制备在潘裕添[8]方法的基础上略有改进。

用剪刀将小麦秸秆剪成长
0.5～1.0cm小段，称取100g用4% NaOH溶液浸泡置于90℃水浴锅中浸提2h，纱布过滤后用浓盐酸调滤液使pH=4.5，再加入与滤液等体积乙醇过滤，最后用无水乙醇洗涤沉淀3～5次使PH=7，将沉淀置于45℃的烘箱中烘干，研成粉状过100目筛，即为半纤维素。

分别取0.5%可溶性淀粉溶液(pH=5.8，0.2M NaAc～HAc缓冲液)、0.5%羧甲基纤维素钠溶液(用pH4.6的0.1M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制)、1%半纤维素溶液1.5ml(pH=4.6的0.2M醋酸-醋酸钠缓冲液)加入相应对照粗酶液0.5ml，混匀，于38℃水浴锅中保温30min，取出后立即加入DNS试剂1.5ml置于沸水域
5min，冷却后加入蒸馏水21.5ml，混匀。

用722型分光光度计测540nm处OD 值。

同时取失活酶液0.5ml做对照，按上述步骤操作做对照试验。

按上述方法，
做处理后粗酶液的测定。

用蒸馏水代替粗酶液按上述步骤做空白对照，做三次重复。

取一条新华定量滤纸(1×6cm)至于试管中，加入柠檬酸缓冲液(PH=4.6,0.1M磷酸氢二钠-柠檬酸)1.0ml；再加入粗酶液1ml，在50℃水浴中保温60min，取出后
立即加入DNS试剂1.5ml，于100℃水浴中保温5min，取出冷却后加入蒸馏水
21.5ml，摇匀，用722型分光光度计测520nm处的OD值，同时取对照失活酶
滤液1ml按上述步骤操作做对照试验，用蒸馏水代替粗酶液按上述步骤做空白对照，做三次重复。

酶活力单位定义:每克干培养物30 min内改变0.1个光密度值为1活力单位(U)。

试验在2016年进行。

结果表明，荷叶离褶伞胞外淀粉酶活性在6种培养基中的变化总体趋势相同。

淀
粉酶在,6种培养基中出现的高峰期不同：麦草培养基中胞外淀粉酶活性在第三周
出现高峰为35.67±3.01U，与其他各组相比差异达到极显著水平(P<0.01)；发酵
棉籽壳，未发酵棉籽壳，玉米颖壳培养基中胞外淀粉酶活性在第八周达到高峰值分别为23.67±1.15U、29.8±1.71U、16.18±1.27U；木屑培养基在第九周出现高峰14.09±0.96U，棉籽壳与木屑混合培养基中胞外淀粉酶活性第四周出现峰值
5.88±0.94U。

从图中可知，胞外淀粉酶活性从大到小的培养基依次是：麦草培养基，未发酵棉籽壳培养基，发酵棉籽壳培养基，玉米颖壳培养基，木屑培养基，棉籽壳和木屑混合培养基。

在6种不同的培养料中羧甲基纤维素酶的活性表现出一定的差异，但变化趋势基
本相似。

在整个试验过程中羧甲基纤维素酶的活性呈上升趋势，以麦草为主的培养料中活性最高，第九周出现最高峰为37±4.34U，与其他各组差异达到极显著水平(P<0.01)，其次是未发酵的棉籽壳最大值为31.63±0.72U，发酵棉籽壳最大值为28.67±0.9U，玉米颖壳最大值为21±1.05U，、木屑最大值为17.37±0.78U，活性最小的是棉籽壳和木屑的混合培养料最大值为11.77±1.54U。

6种培养基中的半纤维素酶的活性变化表现出一定的差异，但变化的总体趋势相似。

试验第二周半纤维素酶的活性在玉米颖壳培养基中出现了第一次高峰，第四周接着出现第二次高峰，以后变化趋势有所下降；第六周半纤维素酶的活性在木屑培养基，麦草培养基，未发酵的棉籽壳培养基，棉籽壳木屑混合的培养基中均出现高峰；第
八周半纤维素酶的活性在未发酵的棉籽壳培养基出现第二次高峰；后期未发酵的棉籽壳培养基和木屑与棉籽壳混合培养基中的半纤维素酶活性还在升高。

半纤维素酶活性的最高峰值在玉米颖壳培养基出现在第二周为49.7±2.33U、在发酵的棉籽壳培养基、木屑培养基、麦草培养基、未发酵的棉籽壳培养基、棉籽壳木屑混合的培养基军出现在第六周分别37.63±2.34U、40.63±0.78U、59.77±1.94U、
48.2±0.35U、47.7±1.15U。

不同培养料对荷叶离褶伞胞外滤纸纤维素酶活性均有影响。

荷叶离褶伞生长的6种培养基滤纸纤维素酶的活性变化趋势相似。

试验第三周滤纸纤维素酶在麦草培养基中出现高峰值为66.7±1.49U，与其它各组相比，差异达到极
从荷叶离褶伞菌丝在玉米颖壳，发酵棉籽壳，木屑，麦草，未发酵棉籽壳，棉籽壳与木屑的混合物6种培养基中生长期间胞外酶的活性变化来看，6种不同培养料对荷叶离褶伞胞外淀粉酶滤纸纤维素酶，羧甲基纤维素酶，半纤维素酶，滤纸纤维素酶的活性大小均有影响，但其酶活性变化的总体趋势相似，在接种后第八周达到酶活性的最大值；麦草培养基中滤纸纤维素酶，羧甲基纤维素酶，半纤维素酶，淀粉酶的活性均比其他培养基中高。

其它胞外酶活性变化规律由于条件有限，有待以后进一步研究。

【相关文献】
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