哮喘诱发过程中腹腔注射CpG寡核苷酸的小鼠肺组织病理及BALF和血清TSLP表达观察

-基础研究-哮喘诱发过程中腹腔注射CpG寡核昔酸的小鼠组织病理及BALF和血清TSLP观察
王超1,董晓艳1,蒋+1,朱丹颖1,方永双1,李孟荣2
1上海市儿童医院，上海交通大学附属儿童医院，上海200062；
2温州医科大学附属第二医院，育英儿童医院
摘要：目的观察腹腔注射CpG寡核昔酸(CpG oligonucleotides,CpGODN)的急性支气管哮喘(简称哮喘、小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)血清胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)。

方法36只SPF雄性BALB/c小鼠随机分为A、B、C、D组,每组各9只。

A、B、C组用0.1%卵清百蛋白(OVA)/AL(OH)混合凝胶0.1mL于第1、4天腹腔注射致敏，第25~31天1%OVA雾化吸入激发小鼠，每日1次，每次30min,7d,制备急性哮喘模型。

B 组激Id每激发前lh,0.5mg/kg的地腹腔注射;C组激发前Id每激1h,50p g的Cp-GODN腹腔注射;D组为正常对照组，每激发均以生理盐水代替。

末次激发24h时取各组，采集眼球血后处死小鼠，收集右肺BALF,取肺组织观察肺组织炎性变化,ELISA法检测BALF,血清中TSLP。

结果A组小鼠肺组织炎症水平、超微结构明显,B、C组肺组织炎症水平、超微结构改变轻于A组,D组小鼠肺组织无炎症水平改变。

A、B、C、D组BALF中TSLP水平分别为(2.481±0.152),2.263±0.122),2.483±0.191)(2.483土
0.280)pg/mL，与A.C.D组比较,B组小鼠BALF中TSLP水平低(P均＜0.05)。

A、B、C、D组血清TSLP水平分别
为(2.739±0.127),3.028±0.142),3.556±0.102)、2.560±0.096)pg/mL,与D组比较,A、B、C组血清TSLP 水平升高(P均＜0.05),A、B、C组间两两比较,P均＜0.05。

结论腹腔注射CpGODN可减轻急性哮喘组
织炎症水平,其机制可能与CpGODN影响TLSP的生物学效应有关。

关键词:CpG寡核昔酸;胸腺基质淋巴细胞生成素;支气管哮喘
doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2020.30.011
中图分类号:R725.6文献标志码：文章编号：1002-266X(2020)30-0045-05
Lung histopathology and expression of BALF and serum TSLP in asthma mouse with
intraperitoneal injection of CpG oligonucleotides
WANG Chao1,DONG Xiaoyan,JIANG Kun,ZHU Danying,FANG Yongshuang,LI Mengrong
1Shanghai Children's Hospital,Children's Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University,
Shanghai200062,China
Abstract：Objective To observe the expression of bronchoalveolar lavage fluid( BALF)and serum thymic stromal lymphopoietin(TSLP/in asthmatic murine models with intraperitoneal injection of CpG oligonucleotides(CpGODN/.
Methods Thirty-six SPF male BALB/c mice were randomly divided into groups A,B,C and D,with9mice in each group.According to the literature,the acute asthma mouse models were induced in the groups A,B and C.The acute asth­ma model was sensitized by intraperitoneal injection of0.1%OVA/AL(OH)3mixed gel(0.1mL)on the1st and14th days,followed by atomization inhalation of1%OVA from25th to31st days,once a day for30min each time,for7consec­utive days.In the group B,0.5mg,/kg dexamethasone was intraperitoneally injected at1day and1hour before eachstimu-lation.In the group C,50p g CpGODN was intraperitoneally injected at1day and1hour before each stimulation.Group D was the normal control group,and normal saline was used for each sensitization and stimulation.Group A was asthma model group.After the last stimulation for24h,eyeball blood of each mouse was collected and then the mice were sacrificed；the right lung BALF was collected,lung tissue was taken to observe the changes of inflammatory,and the TSLP expression in BALF was detected by ELISA.Results The inflammation and ultrastructure of the lung tissues of group A significantly changed as compared with those of the groups B and C,group D did not change.The expression of TSLP in the BALF of groups A,B,C and D were(2.481±0.152),(2.263±0.122),(2.483±0.191/,and(2.483±0.280)pg/mL,re-
通信作者:李孟荣(E-mail：lmrjohn@)
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pared with groups A,C and D,the level of TSLP in BALF of mice in the group B was lower(all P< 0.05).The expression levels of TSLP in serum of groups A,B,C and D were(2.739±0.127),(3.028±0.142), (3.556±0.102)and(2.560±0.096)pg/mL,pared with the group D,the expression of TSLP in ser­um of groups A,B and C increased gradually(all P<0.05),and the pairwise comparison between groups A,B and C was statistically significant(all P<0.05).Conclusion Intraperitoneal injection of CpGODN might reduce the inflammation of lung tissues in asthmatic murine models,and the mechanism may be that CpGODN can decrease the BALF and serum TSLP expression.
Key words：CpG oligonucleotides；thymic stromal lymphopoietin；bronchial asthma
支气管哮喘(简称哮喘)是儿童常见的呼吸道慢性疾病之一，严重影响儿童的生长发育及身心健康。

哮喘的病因、发病机制及治疗方法一直是临床研究的热点。

CpG寡核昔酸(CpG oligonucleotides, CpGODN)是一类含有与微生物体内类似的、具有免疫活性的非甲基化GC序列单链脱氧寡核昔酸(ssDNA)片段的统称，具有广泛的免疫调节作用。

多项动物实验［1~3］表明，CpGODN可诱导小鼠Thl 型免疫反应，抑制Th2型免疫应答，可以有效地预防和治疗哮喘。

胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)是一种上皮源性细胞因子，与TSLP受体(TSLPR)结合而发挥生物学功能。

越来越多的研究［,］结果表明男SLP可能是启动哮喘和过敏症的关键因子，并介导过敏进程的发生、发展。

CpGODN在哮喘中的具体作用机制目前尚不明确。

CpGODN是否可以通过干预哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)及血清TSLP的表达变化，发挥其免疫调节作用？为此我们建立急性哮喘小鼠模型，观察CpGODN腹腔注射的急性哮喘小鼠BALF,血清TSLP的表达变化，现报告如下。

1材料与方法
1.1动物、试剂SPF级健康雄性Balb/c小鼠36只,~6周龄,体质量18~22g,购自中国科学院上海实验动物中心，于温州医学院实验动物中心层流实验室饲养，饲养温度25七，相对湿度70%，昼夜照明12/12h；CpGODN：硫代磷酸化CpGODN1826 (5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'),上海生工生物工程有限公司；卵清白蛋白(OVA、、地塞米松(DXM)购自美国Sigma公司；TSLP酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海朗顿生物科技公司。

1.2动物分组、哮喘诱发及CpGODN用法36只小鼠(4~6周)随机分为4组,每组各9只。

哮喘模型组(A组)、DXM干预组(B组)、CpGODN干预组(C组)用OVA致敏和激发建立小鼠急性哮喘模型：0.1%OVA/AL(OH)3混合凝胶0.1mL于第1,14天腹腔注射致敏，第25~31天1%OVA雾化吸入激发，每日1次，每次30min,连续7d;B组激发前1d 46和每次激发前1h,.5mg/kg的DXM腹腔注射;C 组激1d每激1h,50p g的CpGODN 腹腔注射。

D组为正常对照组，每次致敏和激发均以生理盐水代替。

在致敏阶段，第1次致敏后，各组小鼠表现无明显差异，在激发阶段,A组小鼠表现为烦躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐和二便失禁等症状,严重者呼吸减慢或节律不齐,动作迟缓或俯伏不动、四肢瘫软，反应迟钝；B、C组小鼠上述表现较A组明显减轻;D组小鼠均无上述症状。

1.3各组小鼠肺组织炎症水平观察末次激发24 h时，取各组小鼠，摘取眼球收集血液男000r/min 离心15min,吸取血清-80七保存。

颈椎脱臼处死小鼠男丁开胸腔，暴露肺组织，夹闭左肺门处,mL PBS缓冲液分3次于气管插管处注入，缓慢冲洗右肺，回收BALF,回收率约80%,2000r/min离心15min，取上清液-80七保存待检。

左肺组织用4%多聚甲醛固定，制备石蜡包埋切片，苏木素一伊红染色用于光镜观察；同时取左肺组织,置预冷的
2.5%戊二醛前固定,1%=酸固定，常规方法处理,透射电镜观察肺组织超微结构。

1.4各组小鼠BALF,血清TSLP检测采用ELISA法。

取各组小鼠BALF,血清，ELISA法检测TSLP,所有操作均严格按照试剂说明书进行。

以标准品的浓度为横坐标,0D值为纵坐标，在对数坐标纸上绘制标准曲线，用标准物的浓度与0D值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的0D值代人方程式,计算出样品相对浓度，再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

重复3次，取平均值。

1.5统计学方法使用SPSS23.0统计软件进行处理。

计量资料以X±s表示，方差齐性检验采用Lev-ene检验，多组样本均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA、，两两比较方差齐者用LSD (Least-significant difference)检验，方差不齐采用Dunnett'T3检验。

P<0.05为差异具有统计学。

2结果
2.1各组组织理镜可,A组
组织炎症明显，支气管周量的炎症细胞浸润，B、C组肺组织炎性细胞浸润减少，轻于A 组,D组组织无炎。

电镜下A组，
组织超微结构明显，B、C组组织超微结构类似,均轻于A组，D组肺组织超微结构明。

1、2。

图1各组小鼠肺组织HE染色(x200)
注:A1为哮喘模型组肺泡腔内活化的巨噬细胞;A2为哮喘模型组肺泡"型上皮细胞板层小体空泡化明显；B1为DXM组肺泡肺泡"型上皮细胞微绒毛基本完整;B2为DXM组肺泡隔结构基本恢复正常;C1为CpGOND肺泡"型上皮细胞结构基本恢复正常;C2为CpG治疗组电镜显示肺泡"型上皮细胞板层小体基本恢复正常;D1、D2为对照组正常的肺泡"型上皮细胞及板层体。

图2各组小鼠肺组织电镜图像(图A1、C2、D2x25000,图A2、B1、B2、C1及D1x10000)
2.2各组小鼠BALF,血清中TSLP水平比较A,
B、C、D组BALF中TSLP水平分别为(2.481±
0.152),2.263±0.122)、(2.483±0.191)、(2.483±0.280)pg/mL,与A、C、D组比较,B组小鼠BALF 中TSLP水低(P均＜0.05)o A、B、C、D组血清TSLP水平分别为(2.739±0.127),(3.028±0.142),3.556±0.102)、(2.560±0.096)pg/mL,与D组比较,A、B、C组血清TSLP水平升高(P均＜0.05),A、B、C组间两两比较,P均＜0.05。

3讨论
TSLP由Friend等⑷于1994年首次报道，是一种的白细胞介素7(IL-7)样细胞因子，属于IL-2家族，主要由上皮细胞、气滑肌细胞、角质细胞、基质细胞、成纤维细胞、肥大细胞、巨噬/单核细胞、中性粒细胞及树突细胞(DCs、表达［7,8］。

人TSLP 基因位于5q21.1体，主要存、长型2种异构体，60个氨基酸组成管编码159个氨基酸［,0］。

鼠TSLP基因定位于第18号体，由140氨基酸组成。

管人TSLP基
水平上仅有56%43%的同源性,但其生
能却非常［1,12］。

TSLP体(TSLPR)属于造血细胞因子受体家族成员，功能性TSLPR复合物是由TSLPR和IL-7R a组成。

TSLP与其特异性体TSLPR及IL-7Ra结，形成三元复，启动信号传导［8］。

TSLP-TSLPR-IL-7R a复合体可作用于种细胞系，特别是髓样DCs,上调DCs组织相容性复合物(MHC/□类、OX40配体(OX40L/ CDl34L,CD252)、CD54、CD80、CD83和CD86以及激活DC-LAMP的表达，促进DCs的成熟，从诱导CD4+T细胞(Th0)分化为Th2细胞［13］,Th2效应细胞可分泌大量炎性因子(IL-4、IL-5、IL-9和IL-13)以及GM-CSF,B细胞生成IgE,肥大细胞粒和黏液高分泌，引起气道炎气道高反性。

Th2忆细胞上MHC II类抗B细胞体结,激活激分子CD40CD40L, IgM IgE换。

TSLP还可显著抑制Treg功能,抗炎细胞因子IL-10水平降低［14］。

TSLP 处理的DCs不产生促进Thl细胞分化的细胞因子IL-12或促炎症因子TNF-a、IL-l0和IL-6,这是TSLP 构建Th2微环境的征［3］。

现, TSLP的基因启动区包含NF-k B结合位点，亦包含诱导TSLP的顺式元件,NF-k B结合位点TSLP的启动子。

人气上细胞,炎
子IL-l p和TNF-a可通过NF-k B信号途径调节
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TSLP表达［5］；能使Toll样受体兴奋的因素即可通过NF-k B途径刺激内皮细胞产生TSLP［15'16］。

本研究结果显示,哮喘组EILSA法检测BAFL中TSLP没有明显升高，与理论预计及Zhou等⑸研究献报道不符，考虑可能与造模有关及TSLPR的表达有关。

哮喘组血清中TSLP明显升高男hou等［5］也曾用EIL­SA法检测哮喘小鼠血清TSLP表达,但未检测出结果。

王淑丽等［17］报道哮喘小鼠血清TSLP表达升高，究竟是局部TSLP影响血清TSLP表达,还是血清TSLP加重局部炎症反应，尚需进一步研究。

DXM是一种强有效的糖皮质激素，能抑制多种免疫效应细胞的功能，从而抑制各种细胞因子的合成与分泌。

糖皮质激素与其受体结合后能降低NF-k B、AP-1活性,致促炎症因子如前列腺素、IL-1, IL-6、TNFa等表达减少，而抗炎症因子如IL-10,转化生长因子等表达增加,从而发挥糖皮质激素的抗炎等生物学效应［18］。

Lee等［5］报道IL-l R和TNFa 能够诱导TSLP的表达和释放，进一步研究TSLP基因启动因，发现IL-l R和TNFa可通过NF-k B途径活化TSLP启动基因，而加入核因子NF-k B阻滞剂后, TSLP表达明显减少。

因此推测，DXM抑制TSLP的合成与分泌的机制可能是通过抑制IL-1、TNFa的合成，降低NF-k B活性实现的。

本实验结果显示DXM 组BAFL中TSLP明显降低，与其余三组相比，有显著性差异，提示DXM局部作用机可能是通过降低NF-k B活性，减少IL-l R和TNFa分泌，从而抑制TSLP的表达。

但DXM组血清中TSLP水平较A、B 组明显升高，与小鼠致敏、激发时出现的症状不符,提示DXM和（或）TSLP全身同局部作用机制不同，为进一步研究DXM、TSLP在变应性疾病中的作用提供理论依据。

作为强有力的免疫反应刺激序列，CpGODN对哮喘气道炎症的抑制作用得到了广泛的关注。

多个实验模明CpGODN预及哮喘的作用。

CpGODN通过TLR9的特异性识别，可诱发信号传导途径，激活多种不同的转录因子，包括NF-k B 和激活蛋白-1（AP-1、，进而刺激B细胞增殖，诱导Thl型细胞因子如IL-12、IFN-y、IL-6、TNF-q等的分
泌，从而诱导Thl型免疫应答［，9］。

研究［5,6］发现男总使Toll样受体兴奋的因素即可通过NF-k B途径刺激内皮细胞产生TSLP。

既然CpGODN可以活化TLR9,理论上即可激活NF-k B,应该可以升高TSLP表达，加重哮喘的症状，但是我们前面已述, TSLP构建Th2免疫微环境的关键特征，是经TSLP 处理的DCs不产生促进Thl型细胞分化的细胞因子48IL-12或促炎症因子TNF-a、IL-lR和IL-6。

Tomoki 等[20]通过对静止DC、CD40L-DC、TSLP-DC基因表达谱的分析，发现TSLP能够诱导DC表达TNF超家族蛋白OX40L,后者通过与T细胞表面受体0X40相互作用,在没有IL-12的作用下促进Th2细胞的产生。

当有IL-12存在时，0X40L不能诱导产生炎症Th2细胞,失去启动炎症Th2细胞产生的能力。

CpGODN虽然可以通过激活NF-k B,诱导TSLP的表达，但是CpGODN可诱导Thl型细胞因子IL-12的分泌，使TSLP失去构建Th2免疫微环境的能力，不能产生以Th2为优势的免疫应答，由此可以推测CpGODN干预使小鼠哮喘症状减轻,部分机理可能是通过阻断TSLP介导的免疫应答实现的。

在本实验结果,CpGODN组BAFL TSLP明升高，同A组、B组比较无显著性差另IJ,血清中TSLP 升高明显，小鼠的哮喘症状反而减少，提示CpGODN 局部全身作用机制可能不；CpGODN可能抗了TSLP的生物学作用。

为CpGODN防治哮喘提供的理依及的途径。

综上所述，腹腔注射CpGODN可减轻急性哮喘小鼠肺组织炎症水平，其机制可能为影响小鼠BALF,血清TSLP的生物学效应有关。

哮喘的发病机制复杂.CpGODN在哮喘发病中的免疫活性作用可能存在多种不同的调节机制，彼此之间存在复杂的网络联系，与TSLP之间相互作用机制仍待进一步研究探讨。

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(收稿日期：2020-04-08)
-作者•编者•读者•
《山东医药》对来稿中统计学处理的有关要求
统计学分析方法的选择:对于定量资料，应根据所采用的设计类型、资料所具备的条件和分析目的，选用合适的统计学分析方法，不应盲目套用t检验和单因素方差分析;对于定性资料，应根据所采用的设计类型、定性变量的性质和频数所具备的条件以及分析目的，选用合适的统计学分析方法，不应盲目套用X检验。

对于回归分析，应结合专业知识和散布图，选用合适的回归类型，不应盲目套用简单直线回归分析，对具有重复实验数据的回归分析资料，不应简单化处理；对于多因素、多指标资料，要在一元分析的基础上，尽可能运用多元统计学分析方法，以便对因素之间的交互作用和多指标之间的内在联系进行全面、合理的解释和评价。

统计结果的解释和表达：当P<0.05（或P<0.01）时，应说明对比组之间的差异有统计学意义，而不应说对比组之间具有显著性（或非常显著性）的差别；应写明所用统计学分析方法的具体名称（如：成组设计资料的t检验、两因素析因设计资料的方差分析、多个均数之间两两比较的q检验等），统计量的具体值（如t 值，2值,F值等），应尽可能给出具体的P值；当涉及到总体参数（如总体均数、总体率等）时，在给出显著性检验结果的同时，再给出95%可信区间。

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