益生元、益生菌对小鼠结肠炎的影响及抑制炎症癌变相关机制研究

益生元、益生菌对小鼠结肠炎的影响及抑制炎症癌变相关机制研
究
第一部分益生元对正常小鼠及急性结肠炎模型小鼠肠道菌群的影响目的:探讨益生菌(双歧杆菌、乳杆菌)、益生元(拉克替醇、乳果糖)及两者合用对正常小鼠及急性结肠炎模型小鼠肠道菌群的影响。

方法:1.研究对正常小鼠菌群的影响:C57BL/6J小鼠分为7组,除空白对照组外,其余6组分别予益生菌(双歧杆菌、乳杆菌)、标准浓度拉克替醇、高浓度拉克替醇、益生菌联合拉克替醇、乳果糖、益生菌联合乳果糖灌胃2周。

收集灌胃前、灌胃1周后、灌胃2周后粪便标本及处死后黏膜标本,送检
16SrDNA基因测序。

2.研究对急性结肠炎小鼠菌群的影响:C57BL/6J分为6组,除空白对照组外,其余均DSS建模,建模对照组不予灌胃处理,其余4组分别予益生菌(双歧杆菌、乳杆菌)、合生元(益生菌联合菊粉)、拉克替醇、益生菌联合拉克替醇灌胃,于灌胃1周后、10天后各处死一半小鼠,根据病理结果决定送检菌群。

收集灌胃前、炎症最重时、灌胃结束后的粪便标本及处死后的肠黏膜组织,送检16S rDNA基因测序。

结果:1.与其他组别比较,拉克替醇组粪便和黏膜中Akkermansia菌属丰度明显增加;乳果糖也可以促进Akkermansia的增殖,但作用不如拉克替醇明显;标准浓度拉克替醇组与高浓度拉克替醇组菌群比较无差异。

2.灌胃1周后处死的急性结肠炎小鼠与建模对照组相比,病理评分明显下降,差异有统计学意义。

3.与空白对照组相比,建模对照组拟杆菌属增加,乳杆菌属、毛螺旋菌科罗氏菌属等减少,而益生菌、拉克替醇等灌胃干预组则上述有益菌属减少不明显。

与建模对照组相比,灌胃干预组出现不同程度的双歧杆菌属、毛螺旋菌科NK4A136_group、毛螺旋菌科UCG-006等菌属的增加,理研菌科Alistipes等菌属的减少。

与非建模小鼠不同,拉克替醇对于Akkermansia的增殖作用在建模小鼠中并不明显。

4.黏膜菌群比同期粪便菌群丰度更高,且黏膜标本中脱铁杆菌科Mucispirillum增加明显。

结论:1.单用益生元亦可对肠道菌群发挥调节作用,比如促进Akkermansia生长;不同益生元调节作用有差异,拉克替醇与乳果糖相比,更明显促进Akkermansia的增殖。

2.益生菌、拉克替醇能够显著降低急性结肠炎小鼠的炎症程度。

3.急性结肠炎小鼠较空白对照小鼠有益菌属减少、有害菌属增加,补充益生菌、益生元有利于增加有益菌属比例,调节肠道菌群平衡。

第二部分双歧杆菌、布拉氏酵母菌抑制炎症癌变的相关机制研究目的:通过益生菌与细胞共培养,在细胞水平探讨益生菌抑制炎症癌变的相关机制。

方法:l.Caco-2细胞分别与双歧杆菌上清液、沉淀共培养,加入IL-6、TNF-α刺激,使用双荧光素酶报告基因实验检测相对荧光素酶活性,实验重复3次,根据实验结果选择共培养的方式。

2.Caco-2细胞、CCC-HIE-2细胞分别与双歧杆菌、布拉氏酵母菌共培养,设立空白对照组、益生菌组、IL-6组、益生菌加IL-6组、TNF-α组、益生菌加TNF-α组6个组别,检测相对荧光素酶活性的变化,并分别使用 qRT-PCR、Western Blot、ELISA、EMSA 等实验方法检测β-cateninmRNA与蛋白的含量、核蛋白中β-catenin含量、炎症因子水平、NF-κB与TCF-4的转录活性。

结果:1.Caco-2细胞与不同体积分数的双歧杆菌上清液共培养,不管是加入IL-6还是TNF-α刺
激,与非共培养组相比,相对荧光素酶活性分别出现了增加、降低或变化无统计学意义。

而Caco-2细胞与双歧杆菌沉淀共培养,与非共培养组相比,三次实验结果一致,相对荧光素酶活性均明显下降。

故选择细胞与益生菌沉淀共培养作为培养方式。

2.四种共培养组合方式显示一致的实验结果。

六个组别相比,β
-cateninmRNA表达量差异无统计学意义,蛋白水平无明显变化。

益生菌组与空白对照组相比、益生菌加IL-6组与IL-6组相比、益生菌加TNF-α组与TNF-α组相比,IL-6与TNF-α水平下调,差异有统计学意义;NF-κBDNA-蛋白结合条带明显减弱,β-catenin核蛋白表达水平下降,TCF-4DNA-蛋白结合条带明显减弱。

结论:1.与益生菌上清相比,益生菌沉淀与细胞共培养是最佳的共培养方式。

2.双歧杆菌、布拉氏酵母菌分别与Caco-2细胞、CCC-HIE-2细胞共培养,可以抑制Wnt信号通路的活性,机制为下调炎症因子水平,抑制NF-κB的转录活性,减少β-catenin的入核,抑制TCF-4的转录活性。