血液透析导管中残留单体二苯基甲烷二异氰酸酯的检测

血液透析导管中残留单体二苯基甲烷二异氰酸酯的检测
黄元礼;孙雪;柯林楠;王春仁
【摘要】背景:目前,含聚氨酯医疗器械的质量控制文件和技术标准中均未明确残留单体二苯基甲烷二异氰酸酯(diphenylmethane diisocyanate,MDI)的控制指标及检测方法,考虑到MDI对人体具有致癌的潜在风险,为控制该类产品的安全有效性,应及早建立质量标准.目的:建立测量血液透析导管中残留单体MDI的测试方法,分析该产品的MDI溶出量对人体是否存在风险.方法:取血液透析导管样品用乙酸乙酯加热回流,采用气相色谱法分析MDI含量.色谱条件为:DB-5 MS色谱柱(30
m×0.25 mm),起始温度60℃,保持5min,然后以15℃/min升至280℃,保持6min;进样口温度280℃;检测器:FID,温度280℃;载气:氦气,99.999％.结果与结论:MDI在4.970-99.40 mg/L(r=0.999 64)范围线性关系良好;平均加标回收率为100.9％,相对标准偏差(RSD)=3.2％(n=6).3批样品的MDI残留量低于可耐受接触量.该方法灵敏、快速、准确、专属性强,可为血液透析导管的质量标准研究提供依
据.%BACKGROUND:In the current quality control file or technical standards of the hemodialysis catheter,the indicators of the component contents and detection methods of the residual diphenylmethane diisocyanate (MDI) monomer are undefined.To ensure the safety and effectiveness of these products,we should try to establish and improve the quality standards.OBJECTIVE:To establish a method for determination of the residual MDI monomer in a hemodialysis catheter by gas chromatography (GC),and to analyze the bio-security of the MDI.METHODS:Samples collected in the hemodialysis catheter were heated to reflux with ethyl acetate and the residual MDI content was analyzed by the GC.The GC
separation was performed on a DB-5 MS column (30 mx0.25 mm),the temperature of which rose by program.The initial temperature was
60 ℃,maintained for 5 minutes,rose to 280 ℃ with a rate of 15 ℃/min,and maintained for 6 minutes.The temperature of the Injector and FID detector was both 280 ℃.Carrier gas was 99.999％ nitrogen.RESULTS AND CONCLUSION:The linearity was achieved in the range of 4.970-99.40 mg/L (r=0.999 64) for MDI.The mean recovery rate was 100.9％ with the relative standard deviation of 3.2％ (n=6).The residue of MDI monomer in the three batches of samples was lower than the tolerable
exposure.Therefore,it is a sensitive,rapid,accurate,specific method that can be used for the quality control of the residual MDI monomer in the hemodialysis catheter.
【期刊名称】《中国组织工程研究》
【年(卷),期】2018(022)006
【总页数】5页(P927-931)
【关键词】血液透析导管;气相色谱;残留单体;二苯基甲烷二异氰酸酯;生物材料【作者】黄元礼;孙雪;柯林楠;王春仁
【作者单位】中国食品药品检定研究院医疗器械所,北京市102629;中国食品药品检定研究院医疗器械所,北京市102629;中国食品药品检定研究院医疗器械所,北京市102629;中国食品药品检定研究院医疗器械所,北京市102629
【正文语种】中文
【中图分类】R318
0 引言 Introduction
二苯基甲烷二异氰酸酯(diphenylmethane diisocyanate，MDI)在工业上广泛用于制造硬质泡沫、热塑性聚氨酯弹性体、涂料、粘合剂、弹性纤维、建筑材料等。

由MDI合成的聚氨酯是医疗器械产品用到的重要材料之一[1-3]。

MDI因2个异氰酸酯基团在苯环上的位置不同，有4,4'-MDI，2,4-MDI和2,2'-MDI等异构体。

制备聚氨酯所用MDI以4,4'-MDI为主。

4,4'-MDI以气体形态存在时，具有一定的毒性，会刺激皮肤、眼睛和呼吸道，引起人类哮喘、过敏性肺炎和上呼吸道炎症等疾病。

在外源性代谢活化的作用下，MDI会引起大鼠伤寒沙门氏杆菌TA100突变，不存在活化的情况下不会引起突变；但MDI增加了姐妹染色单体互换的频率和人淋巴细胞染色体畸变，因此MDI具有致突变性。

有研究表明，亚慢性毒性、慢性毒性、致癌性试验中，MDI均有毒性反应，其气体对小鼠的最小安全剂量(No observed adverse effect level，NOAEL)为0.19 mg/m3 [4-5]。

4,4'-MDI分子式为(C6H4NCO)2CH2，带有两个异氰酸酯基(-N=C=O)，化学结构如图1。

MDI固体形态时，通过对小鼠重复给药发现，4,4'-MDI在与血液接触后，会迅速分解，主要降解产物为4,4'-二氨基二苯甲烷(4,4'-MDA)，分子式为
C13H14N2，化学结构如图2。

国际癌症研究机构(IARC)将MDI分级为3，即对人体不具备致癌性，而MDA的分级为2B，即可能对人体致癌。

国内外对MDI的研究主要放在环境中MDI对人体的影响，医疗器械中MDI的测量未见报道。

近年来，血液透析患者不断增多，血液透析技术发展迅速，据相关资料显示，血液透析患者已经超过30万人。

血管通路是保证血液透析治疗可以实施
的先决条件，同时也是血液透析治疗造成患者并发症甚至死亡的重要原因[6-7]。

血液透析导管是一种埋置于人体体内，辅助血液透析治疗的一种医疗器械。

埋置血液透析导管建立血管通路进行血液透析是近年来临床常用的一项技术。

由于需要使用血液透析导管的患者属重症患者，对有毒有害物质的代谢能力低，因此，评价产品中的MDI很有必要。

实验使用的静脉导管依照其使用说明，埋置周期为30 d，每周透析3次，每次持续4 h。

导管主要材质为聚氨酯，其可能出现的残留单体为4,4'-MDI。

采用乙酸乙酯对静脉导管进行浸提，检测MDI的溶出量，并假设全部MDI降解为MDA 时，MDA的含量是否会对人体造成危害。

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计建立评价测试方法。

1.2 时间及地点于2016年5月在中国食品药品检定研究院完成。

1.3 材料乙酸乙酯(色谱纯，购自DikmaPure公司)；4,4'-MDI对照品(批号40701，纯度99.2%，购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)。

岛津GC-2010气相色谱仪；Sartorius CP225D 电子天平；回流装置；一次性使用血液透析导管套件(国产)。

1.4 实验方法
1.4.1 色谱条件色谱柱：DB-5 MS 30 m×0.25 mm；柱温60 ℃，保持5 min，然后以15 ℃/min升至280 ℃，保持6 min，运行时间26 min；进样口温度280 ℃；检测器：FID，温度280 ℃；进样量1 μL，分流比5︰1；载气：氦气，99.999%；气流量：氦气1.5 mL/min，氢气40 mL/min，空气400 mL/min。

1.4.2 浸提液制备将3个批号的样品中含有MDI的管路部分取出，切碎至约1 cm，分别称量质量，将样品置于回流装置中，加入150 mL乙酸乙酯，加热回流4 h。

停止加热后，冷却回流装置并立取出滤液，将滤液用乙酸乙酯定容至150
mL，作为可提取物待测溶液。

1.4.3 对照品溶液制备精密称取4,4'-MDI对照品适量，用乙酸乙酯配成质量浓度
为2.485 g/L的对照品储备液，临用前稀释至适当浓度，备用。

1.5 主要观察指标 4,4'-MDI在乙酸乙酯浸提液中的含量。

2 结果 Results
2.1 专属性实验分别取上述对照品溶液、供试品溶液进行测试，色谱图见图3。

4,4'-MDI出峰位置未见干扰峰，专属性良好。

2.2 线性关系考察取对照品储备液，依次稀释成标准系列溶液，质量浓度范围为4.970-99.40 mg/L，R=0.999 64，线性关系良好。

2.3 重复性及系统适用性考察依据《中华人民共和国药典》2015版(四部)，气相
色谱法，取对照品适量用乙酸乙酯溶解并稀释制成质量浓度约为10 mg/L的溶液，取1 μL，注入气相色谱仪，记录色谱图，相对标准偏差(RSD)=1.76%，理论塔板数=819 338，拖尾因子=1.001，分离度>10，结果符合系统适用性要求。

图1 4,4'-二苯基甲烷二异氰酸酯(4,4'-MDI)化学结构图Figure 1 The chemical structure of 4,4'-diphenylmethane diisocyanate
图2 4,4'-二氨基二苯甲烷(4,4'-MDA)化学结构图Figure 2 The chemical structure of 4,4'-diaminodiphenylmethane
图3 空白溶剂(A)、4,4'-MDI对照品(B)、血液透析导管供试品溶液(C)的气相色谱
图Figure 3 Gas chromatograms of blank (A), reference substance(B), and sample (C)
表1 4,4'-二苯基甲烷二异氰酸酯(4,4'-MDI)的回收率Table 1 Recovery of 4,4'-diphenylmethane diisocyanate表注：MDI：二苯基甲烷二异氰酸酯。

高标待测液含量(mg/L) 溶液体积(mL) MDI总量(mg) 标准溶液质量浓度(g/L）投入量(mL) 回收率(%) 均值(%) 相对标准偏差(%)96.021 14.403 6.0 96.6 1502.485
100.9 3.2中标97.567 14.635 6.0 98.2 34.728 5.209 2.0 104.8低标
34.514 5.177 2.0 104.2 16.717 2.508 1.0 100.9 16.6812.5021.0 100.7
表2 三个批次样品的4,4'-MDI测试含量Table 2 Residue of 4,4'-diphenylmethane diisocyanate in three batches of samples表注：MDI：二苯基甲烷二异氰酸酯。

批号质量浓度(mg/L) 样品含量(mg/套)批号1 52.936 2.647批号2 51.424 2.571批号3 29.412 1.471
2.4 最低检出限及最低定量限取对照品逐级稀释，至主峰与噪音峰面积之比为
3/1(即信噪比S/N=3/1)时，得到最低检出限(LOD)=0.615 mg/L，同理可得
S/N=10时，最低定量限(LOQ)=2.051 mg/L。

2.5 加样回收率实验取质量浓度为2.485 g/L的标准溶液6.0，2.0，1.0 mL，乙酸乙酯定容至150 mL，分别加入3个回流瓶中，加热回流4 h。

停止加热后，冷却回流装置并立取出滤液，将滤液用乙酸乙酯定容至150 mL，作为待测液，每个瓶中取2份按上述色谱条件进样，计算回收率及相对标准偏差。

平均回收率为100.9%，相对标准偏差为
3.2%，结果见表1。

2.6 样品含量测定取3个批次的样品，按上述浸提液制备方法制备，得到供试品溶液，按上述色谱条件进行检测。

根据谱图，按照外标法计算质量浓度，结果见表2。

3 讨论 Discussion
3.1 研究对象的选择随着透析事业的发展，血液透析导管的应用日益普及。

有统计表明，在美国约27%的血液透析患者采用血液透析导管作为长期的血管通路[8-9]。

血液透析导管中的管路部分是由聚氨酯制成。

聚氨酯材料因其特殊的化学结构、良好的机械性能、生物相容性和血液相容性，用于医学领域已经有50余年的历史[10]，涉及的医疗器械包括人工心脏瓣膜、人工肺、骨粘合剂、人工皮肤、烧伤敷
料、绝缘线、缝线、导管、人工血管、输液管路等[11-12]。

聚氨酯合成采用MDI，合成后的产品有可能存在MDI残留，MDI与水反应会产生对人体有害的物质MDA，MDA属于芳香胺类物质，可经一系列活化作用使人体的DNA发生结构及功能变化，具有致癌性[13]。

透析患者的免疫功能、代谢能力相对较差，如摄入过多致癌物质，会加重患者的病情，导致患者出现更多并发症。

因此考察血液透析导管中MDI残留量是否安全是十分有必要的。

3.2 研究方法的选择目前，检测MDI的常用方法有分光光度法、气相色谱方法、气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱方法、离子交换色谱法、毛细管电泳法等[14]。

分光光度法测试的原理是通过氧化异氰酸酯形成重氮盐，再发生偶氮显色反应[15-17]，但检测限较高，不适合对MDI单体残留的检测。

气相色谱法是检测异氰酸酯类化合物的经典方法[18-23]，该方法具有操作简单、分析速度快、分离效
果好、灵敏度高及适用范围广等特点。

气质联用法具有气相色谱法的高分离效果，又具有质谱准确鉴别化合物的特点，目前已经广泛应用[24-26]。

高效液相色谱法
同样是一项高效、快速的分离技术，现在使用非常广泛。

液相色谱法检测异氰酸酯主要分为衍生化和直接检测[27-32]，但考虑到MDI本身不稳定，衍生化过程造成的测试误差，液相色谱法的测试回收率并不高。

离子交换法和毛细管电泳法检测MDI近年来发展迅速[33-34]，但资料较少，普及性不高。

此次实验结合国标《GB 18583-2001室内装饰装修材料胶粘剂中有害物质限量》中的方法，采用气相色谱法检测MDI单体残留量，该方法满足实验需求。

浸提介质的选择：MDI溶于苯、甲苯、氯苯、硝基苯、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、
二噁烷等，参考《GB 18583-2001室内装饰装修材料胶粘剂中有害物质限量》中对MDI含量检测的方法，选择乙酸乙酯作为浸提溶液。

浸提方式选择：参考《GB 18583-2001室内装饰装修材料胶粘剂中有害物质限量》
中对MDI含量检测的方法，以及《GB//T 16886.12-2005 医疗器械生物学评价
第12部分：样品制备与参照样品》
3.3 测试结果的分析美国毒物和疾病登记署(ATSDR)及美国国家卫生基金会(NSF)
评估了MDA的毒性[28]。

ATSDR未给出非经口途径致癌性的每日安全剂量(minimal risk level，MRL)，但给出了短期每日安全剂量值，根据小鼠重复给药
12周得到的最小安全剂量值为8.3 mg/(kg•d)，采用不确定因子
100(100=10×10，10为物种间差异，10为人体间差异)，最小安全剂量值/100，计算得到短期每日安全剂量值为0.08 mg/(kg•d)。

在经口途径致癌性研究中，NSF依据美国环保署(U.S.EPA)在2005年发布的对致
癌物质的风险评价指导原则，通过动物实验建立评估数学模型可得到MDA的BMDL10(出现10%肝癌发病率的基准剂量可信下限)为0.67 mg/(kg•d)，依据此
数值可得致癌斜率因子为0.15 mg/(kg•d)。

通过以上2种数据，选取最低限量值作为MDA的可耐受摄入量TI值，即0.08 mg/(kg•d)。

采用GB/T 16886.17-2005《医疗器械生物学评价第17部分：可沥滤物允许限量的建立》中公式推导，可耐受限量TE=TI×m×UTF，
UTF=CEF×PEF，m代表医疗器械接触群体的体质量，以体质量70 kg计，CEF
为多器械因子，缺省值为0.2。

PEF为比例接触因子，PEF=nexp/nuse，nexp代表一种器械接触类别的天数，nuse代表器械的使用时间，该产品埋置于人体接触30 d，使用1个月后更换即nexp=30，nuse=30，故PEF=1，即UTF=0.2。

采
用更严格的可耐受摄入量TI值计算可耐受限量TE值，则TE值应大于
0.08×70×0.2=1.12 mg/d，即33.6 mg/使用周期/套。

此次实验MDI在乙酸乙酯中溶出最高值2.647 mg/套，考虑到溶剂为乙酸乙酯，同时采用回流的方式对MDI进行提取，提取条件较为严苛，此时，若溶出MDI
全部分解成MDA，数值较低，因此可认为该产品MDI溶出量在安全范围内。

3.4 研究展望随着近年来人们对聚氯乙烯材料安全性的担忧，含聚氨酯材料的医
疗器械产品数量随之增多，但聚氨酯材质的安全性评价较少，早期研究多在机械性能及生物相容性等方向，对聚氨酯的残留单体MDI研究较少，现有对MDI的研
究主要集中于食品及建材领域，由于食品及建材领域与人体的接触途径不同，其对聚氨酯的单体残留研究并不完全适用于医疗器械。

因此在现有基础上，进一步研究用于医疗器械领域的聚氨酯的生物安全性评价十分必要。

该实验选取一种医疗器械进行研究，相对于聚氨酯在医疗器械领域的使用范围，还有很大差距，因此在后续的研究中，应补充产品的种类，丰富实验数据，完善评价医用聚氨酯中MDI生物安全性的方法。

作者贡献：实验设计和实验实施为第一、二作者，资料收集为第一作者。

第一作者成文，第三、四作者审校。

经费支持：该文章接受了“国家重点研发计划(2016YFC1101202)”的资助。

所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。

伦理问题：文章的撰写与编辑修改后文章遵守了国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。

文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。

作者声明：第一作者黄元礼对于研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。

论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

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4 参考文献 References
[1]中蓝晨光化工研究设计院有限公司. 2014～2015年世界塑料工业进展[J]. 塑料
工业,2016,44(3):1-46.
[2]张丽. 我国聚氨酯产业现状分析及展望(待续)[J]. 化学工业,2015,33(1):15-18.
[3]张丽. 我国聚氨酯产业现状分析及展望(续完)[J]. 化学工业,2015,33(Z1):12-22.
[4]4,4'-Methylenediphenyl diisocyanate and polymeric 4,4'-methylenediphenyl diisocyanate. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum. 1999;71 Pt 3:1049-1058.
[5]Concise International Chemical Assessment Document
27,DIPHENYLMETHANE DIISOCYANATE (MDI), WHO, 2000.
[6]Schwab SJ. Hemodialysis vascular access: the Achilles' heel remains. Kidney Int. 2007;72(6):665-666.
[7]Cornelis T, Usvyat LA, Tordoir JH, et al. Vascular access vulnerability in intensive hemodialysis: a significant Achilles'heel. Blood Purif.
2014;37(3):222-228.
[8]US Renal Data System: USRDS 2002 Annual Data Report.Bethesda, National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, 2002, chapt 4.
[9]2003 annual report: ESRD clinical performance measures project. Am J Kidney Dis. 2004;44(2 Suppl 1):A5-6, S1-92.
[10]李绍雄,刘益军.聚氨酯树脂及其应用[M].北京:化学工业出版社,2004:305.
[11]李汾.医用聚氨酯弹性体[J].科技情报开发与经济, 2001,11(4):95-96.
[12]潘才元.功能高分子[M].北京:科学出版社,2006.
[13]钟金汤.偶氮染料及其代谢产物的化学结构与毒性关系的回顾与前瞻[J].环境与职业医学,2004,21(1):58-62.
[14]徐德珍,贺一训. 偶氮染料中微量芳香胺类的分析方法现状[J].印染,1996(3):26-30.
[15]杨晓芬,李军湘.N-氯代丁二酰亚胺8-羟基喹哪啶分光光度法测定水中苯胺类化合物的方法研究[J].内蒙古石油化工, 2002,27(1):25-26.
[16]马立斌,宋春娟.甲萘酚代替萘乙二胺测定水中苯胺类化合物[J].河北工业科技,2000,17(4):21-22.
[17]杨晓芬,赵美萍,李元宗,等.水中苯胺类化合物的分光光度法测定[J].分析化
学,2002,30(5):540-543.
[18]Longo M, Cavallaro A. Determination of aromatic amines at trace level by derivatization with heptafluorobutyric an hydride and gas Chromatography-electron-capture negative-ion chemical ionization analysis spectrometry. J Chromatogr A.1996;753:91-100.
[19]Kataoka H. Derivatization reactions for the determination of amines by gas chromatography and their applications in environmental analysis. J Chromatogr A.1996;733(1-2):19-34.
[20]Schmidt TC, Less M, Haas R, et al. Gas chromatographic determination of aromatic amines in water samples after solid-phase extraction and derivatization with iodine. I.Derivatization. J Chromatogr A. 1998;810(1-2):161-172.
[21]海勇,田树盛.致癌芳香胺的检测[J].印染助剂,2005,22(9):42-45.
[22]Huang M, Tai C, Zhou Q, et al. Preparation of polyaniline coating on a stainless-steel wire using electroplating and its application to me determination of six aromatic amines using headspace splid-phase micrextraction. J Chromatogr A. 2004;1048(2):257-262.
[23]Kataoka H. Derivatization reactions for the determination of amines by gas chromatography and their applications in environmental analysis. J Chromatogr A. 1996;733(1-2):19-34.
[24]Brede C, Skjevrak I, Herikstad H. Determination of primary aromatic amines in water food simulant using solid-phase analytical derivatization followed by gas chromatography coupled with mass spectrometry. J Chromatogr A. 2003;983(1-2):35-42.
[25]Singh V, Gupta M, Jain A, et al. Determination of aromatic primary amines at microg l(-1) level in environmental waters by gas chromatography-mass spectrometry involving N-allyl-n'-arylthiourea formation and their on-line pyrolysis to aryl isothiocyanates. J Chromatogr
A. 2003;1010(2):243-253.
[26]Chang WY, Sung YH, Huang SD. Analysis of carcinogenic aromatic amines in water samples by solid-phase microextraction coupled with high-performance liquid chromatography. Analytica Chimica Acta. 2003; 495(1):109-122.
[27]陈为都,王小妹,黄仲立. IPDI 及MDI 型聚氨酯预聚体中游离二异氰酸酯含量测定[J].聚氨酯工业,2009,24(2):43-46.
[28]姚洁,胡晓佳,王庆印,等.4,4'-二苯甲烷二异氰酸酯的高效液相色谱分析[J].化学通报, 2008(6):457-460.
[29]栾杨,李翎,王晓云,等.高效液相色谱测定车间空气中4,4'-二苯甲烷二异氰酸酯[J].中国公共卫生, 1999,15(10):937-938.
[30]姚洁,王公应.4,4'-二苯甲烷二异氰酸酯的HPLC分析[J].天然气化工,
2005,30(5): 68-70.
[31]张敏,雷兴红. 涂料中游离甲苯二异氰酸酯的气相色谱测定法[J].环境与健康杂志,2003,20(6):364-365.
[32]郭巧珍,杜振霞. UPLC-MS/MS测定二苯甲烷二异氰酸酯[J]. 质谱学报,2011, 32(2):112-116.
[33]Zhu Y, Wang M, Du H, et al. Organic analysis by ion chromatography. 1. Determination of aromatic amines and aromatic diisocyanates by cation-exchange chromatography with amperometric detection. J Chromatogr A. 2002;956(1-2):215-220.
[34]黄甫.苯胺及其衍生物的毛细管电泳行为研究[J].理化检验化学分
册,2003,39(12): 696-699.。