细胞与医学遗传学实验：7基因组DNA提取与PCR扩增技术
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基因组DNA提取与PCR扩 增技术
基因组DNA提取
目的
❖ 基因组DNA的制备是基因分析的前提。 ❖ 本实验要求掌握基因组DNA提取的基本方法。
原理
DNA
核内DNA 真核细胞，以核蛋白体形式存在 线粒体DNA 裸露，不与组蛋白结合
真核细胞基因组DNA提取
裂解：使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程 纯化：去除体系中的其他成分、多糖、脂类及其他不需要
Primer 1(上游):5’-ATGGCAAGCCAACGCCACTT-3’ Primer 2(下游):5’-CGTGGTTACTAGCACAGAGAGTTC-3’
3、无菌d3H2O 4、模板DNA：为本次实验所提取的全基因组
DNA 和病人基因组DNA
操作
❖ 超纯水 ❖ 引物1 ❖ 引物2 ❖ 模板DNA ❖ Taq酶等
的核酸（RNA）等生物大分子的过程
原理
基因组DNA纯化试剂盒：在高盐的状态下， DNA纯化树脂UltraPureTM专一性地吸附DNA；而 在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。
器材与试剂
❖ 台式高速离心机、水浴恒温箱、移液枪、塑料离 心管等
❖ 试剂盒（纯化树脂、GN结合液、漂洗液、无水乙 醇、离心纯化柱 ）、超纯水
实验目的
❖ 本实验以所提取的全基因组DNA为模板，以线粒 体基因上一段核苷酸为靶目的片段，扩增出 924bp的扩增产物。通过本次实验，学习并掌握 PCR 反应的基本原理与实验技术。
器材和试剂
器材 PCR扩增仪，台式离心机，加样枪及枪头等
器材与试剂
试剂 1、Taq聚合酶Mix：Taq DNA 聚合酶、dNTP 、Mg2＋ 2、引物：
注意事项
❖ 一般情况下，纯净的DNA OD260/OD280比值约为1.8。 若样品中含蛋白质，则比值下降，必要时需重新抽提。
❖ DNA用TE溶解，可增加DNA的稳定性，便于长期保存。 （也可用超纯水代替，如杂交时不能用TE，可能是与缓 冲体系相冲突）
PCR扩增技术
实验原理
聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR） 又称PCR扩增技术，是一种高效、快速、特异的 体外DNA聚合程序。
操作
1、培养细胞（Hela）一瓶，PBS洗涤一次。 2、加入PBS 0.5 ml，将细胞悬液转移至2ml 离心管（细胞刮、吸管） 3、向细胞悬液中加入1ml纯化树脂（使用前充分混匀），颠倒混匀5-6次，室
温3min。其间要颠倒混匀1次，5000r/min离心×3sec收集沉淀；(吸水纸) 4、用1mlGN结合液将纯化树脂悬浮，颠倒混匀， 5000r/min离心×3sec，收
❖ 溶液反应温度升至72℃，在Taq酶作用下，以四种dNTP 为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和 退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。
❖ 如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性 和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复 过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA 而参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增。经过 25～35个循环，DNA扩增倍数可达106～109。
10.5ul 0.5ul 0.5ul
1ul 12.5ul
总体积25ul
混匀后，瞬时离心后，放入PCR仪
操作
PCR扩增条件的设定：
设置PCR扩增仪的热盖温度为100℃
❖ 预变性：94℃5min ❖ 循环： 94℃变性30s
56℃退火30s 30个循环 72℃延伸40s ❖ 末次延伸：72℃ 10min ❖ 4 ℃保存
原理：体外模拟DNA的体内复制过程。 简述为：
在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板 DNA，四种脱氧核苷酸（dNTP），和耐热Taq聚 合酶及两个合成的DNA引物（上游、下游），有 Mg2+存在。
实验原理
❖ 加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是 所谓变性阶段。
❖ 降低溶液温度，使合成引物在低温（56℃）与模板DNA互 补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。
树脂上（不能粘在管壁上），室温下放置3min，12000r/min离心×2min。 10、将离心管内的超纯水重新吸出，仍加至纯化树脂上（不能粘在管壁上）
，室温下放置2min,A所含有的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具 有吸收紫外光的性质，吸收高峰在260nm处，所 以，可用紫外分光光度法测定DNA的浓度。
注意事项
❖ PCR技术非常敏感，可使一个DNA分子得以扩增，故应 严格操作，防止污染
❖ 装有PCR试剂的微量离心管打开之前，应先在微量离心 机上作瞬时离心使液体沉积于管底。
集沉淀； 6、用0.5ml漂洗液漂洗纯化树脂2次，颠倒混匀， 5000r/min离心×3sec，收
集沉淀； 7、用0.8ml无水乙醇悬浮，装入离心纯化柱，12000r/min离心×1min，弃乙
醇液； 8、空柱再12000r/min离心×1min，进一步弃乙醇液； 9、取离心好的纯化柱套入一干净的1.5ml离心管中，加入50ul 超纯水于纯化
基因组DNA提取
目的
❖ 基因组DNA的制备是基因分析的前提。 ❖ 本实验要求掌握基因组DNA提取的基本方法。
原理
DNA
核内DNA 真核细胞，以核蛋白体形式存在 线粒体DNA 裸露，不与组蛋白结合
真核细胞基因组DNA提取
裂解：使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程 纯化：去除体系中的其他成分、多糖、脂类及其他不需要
Primer 1(上游):5’-ATGGCAAGCCAACGCCACTT-3’ Primer 2(下游):5’-CGTGGTTACTAGCACAGAGAGTTC-3’
3、无菌d3H2O 4、模板DNA：为本次实验所提取的全基因组
DNA 和病人基因组DNA
操作
❖ 超纯水 ❖ 引物1 ❖ 引物2 ❖ 模板DNA ❖ Taq酶等
的核酸（RNA）等生物大分子的过程
原理
基因组DNA纯化试剂盒：在高盐的状态下， DNA纯化树脂UltraPureTM专一性地吸附DNA；而 在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。
器材与试剂
❖ 台式高速离心机、水浴恒温箱、移液枪、塑料离 心管等
❖ 试剂盒（纯化树脂、GN结合液、漂洗液、无水乙 醇、离心纯化柱 ）、超纯水
实验目的
❖ 本实验以所提取的全基因组DNA为模板，以线粒 体基因上一段核苷酸为靶目的片段，扩增出 924bp的扩增产物。通过本次实验，学习并掌握 PCR 反应的基本原理与实验技术。
器材和试剂
器材 PCR扩增仪，台式离心机，加样枪及枪头等
器材与试剂
试剂 1、Taq聚合酶Mix：Taq DNA 聚合酶、dNTP 、Mg2＋ 2、引物：
注意事项
❖ 一般情况下，纯净的DNA OD260/OD280比值约为1.8。 若样品中含蛋白质，则比值下降，必要时需重新抽提。
❖ DNA用TE溶解，可增加DNA的稳定性，便于长期保存。 （也可用超纯水代替，如杂交时不能用TE，可能是与缓 冲体系相冲突）
PCR扩增技术
实验原理
聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR） 又称PCR扩增技术，是一种高效、快速、特异的 体外DNA聚合程序。
操作
1、培养细胞（Hela）一瓶，PBS洗涤一次。 2、加入PBS 0.5 ml，将细胞悬液转移至2ml 离心管（细胞刮、吸管） 3、向细胞悬液中加入1ml纯化树脂（使用前充分混匀），颠倒混匀5-6次，室
温3min。其间要颠倒混匀1次，5000r/min离心×3sec收集沉淀；(吸水纸) 4、用1mlGN结合液将纯化树脂悬浮，颠倒混匀， 5000r/min离心×3sec，收
❖ 溶液反应温度升至72℃，在Taq酶作用下，以四种dNTP 为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和 退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。
❖ 如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性 和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复 过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA 而参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增。经过 25～35个循环，DNA扩增倍数可达106～109。
10.5ul 0.5ul 0.5ul
1ul 12.5ul
总体积25ul
混匀后，瞬时离心后，放入PCR仪
操作
PCR扩增条件的设定：
设置PCR扩增仪的热盖温度为100℃
❖ 预变性：94℃5min ❖ 循环： 94℃变性30s
56℃退火30s 30个循环 72℃延伸40s ❖ 末次延伸：72℃ 10min ❖ 4 ℃保存
原理：体外模拟DNA的体内复制过程。 简述为：
在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板 DNA，四种脱氧核苷酸（dNTP），和耐热Taq聚 合酶及两个合成的DNA引物（上游、下游），有 Mg2+存在。
实验原理
❖ 加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是 所谓变性阶段。
❖ 降低溶液温度，使合成引物在低温（56℃）与模板DNA互 补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。
树脂上（不能粘在管壁上），室温下放置3min，12000r/min离心×2min。 10、将离心管内的超纯水重新吸出，仍加至纯化树脂上（不能粘在管壁上）
，室温下放置2min,A所含有的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具 有吸收紫外光的性质，吸收高峰在260nm处，所 以，可用紫外分光光度法测定DNA的浓度。
注意事项
❖ PCR技术非常敏感，可使一个DNA分子得以扩增，故应 严格操作，防止污染
❖ 装有PCR试剂的微量离心管打开之前，应先在微量离心 机上作瞬时离心使液体沉积于管底。
集沉淀； 6、用0.5ml漂洗液漂洗纯化树脂2次，颠倒混匀， 5000r/min离心×3sec，收
集沉淀； 7、用0.8ml无水乙醇悬浮，装入离心纯化柱，12000r/min离心×1min，弃乙
醇液； 8、空柱再12000r/min离心×1min，进一步弃乙醇液； 9、取离心好的纯化柱套入一干净的1.5ml离心管中，加入50ul 超纯水于纯化