AKF-PD通过MAPK信号通路抑制肝星状细胞收缩

AKF-PD通过MAPK信号通路抑制肝星状细胞收缩
黄家明;胡薇;林晔;邱荣锋;温建军
【摘要】目的:探讨氟非尼酮(fluorofenidone,AKF-PD)对内皮素-1(endothelin-1,ET-1)诱导的肝星状细胞(hepaticstellate cell,HSC)收缩的影响及对收缩纤维平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达的影响.方法:通过凝胶收缩实验确定AKF-PD对HSC收缩的作用,通过Western Blot法检查AKF-PD对收缩纤维α-SMA、ERK及磷酸化ERK蛋白表达的影响.结果:ET-1使胶原凝胶面积显著缩小,而AKF-PD抑制ET-1诱导的胶原凝胶面积缩小.AKF-PD抑制ET-1诱导的α-SMA和p-ERK蛋白表达.结论:AKF-PD可通过阻断ERK-MAPK信号通路调控α-SMA表达,抑制肝HSC收缩从而达到降低门脉压的作用.
【期刊名称】《赣南医学院学报》
【年(卷),期】2014(034)001
【总页数】4页(P18-21)
【关键词】氟非尼酮;内皮素-1;肝星状细胞;平滑肌肌动蛋白;门脉高压
【作者】黄家明;胡薇;林晔;邱荣锋;温建军
【作者单位】赣州市人民医院消化内科;赣南医学院,江西赣州341000;赣州市人民医院消化内科;赣州市人民医院消化内科;赣州市人民医院消化内科
【正文语种】中文
【中图分类】R657.3+4
门脉高压是肝硬化的主要表现之一，与大多数的肝硬化并发症如:食管胃底静脉曲张破裂出血、腹水、肝肾综合征、肝肺综合征、肝性脑病等直接相关［1］，后者是肝硬化导致死亡的主要原因。

因此降低门静脉高压对治疗肝纤维化以及减少患者并发症具有重要意义。

目前研究认为血管因素在门脉高压的形成中发挥了关键作用。

在肝脏内，肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的收缩是肝窦血管管径变化的主要因素［2］。

活化HSC通过表达平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin，α-SMA)［3-4］、L 型电压门控Ca2+通道［5］等发挥收缩作用。

慢性炎症诱导肝窦内皮细胞表达内皮素-1(endothelin-1，ET-1)，后者通过G蛋白信号通路刺激肌球蛋白轻链激酶磷酸化肌球蛋白轻链，与α-SMA结合启动HSC收缩。

此外，ET-1也可以通过L 型Ca2+调控通道使细胞内Ca2+浓度升高，导致HSC收缩。

氟非尼酮(fluorofenidone，AKF-PD)是一种吡啶酮类化合物，体外动物实验研究表明它在多种大鼠肝纤维化模型中能够抑制胶原纤维合成、促进胶原纤维的降解，发展抗肝纤维化作用。

临床前药效学研究结果显示:AKF-PD在二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化模型、四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型、猪血清诱导的大鼠肝纤维化模型以及血吸虫感染小鼠肝纤维化模型中，均有显著降低脾脏重量与大鼠重量的比值，间接表明AKF-PD可以降低门脉高压。

目前有关AKF-PD降低门脉高压的机制尚不明确，本文将探讨AKF-PD是否通过抑制HSC收缩发挥降门脉压作用。

1 材料和方法
1.1 材料 AKF-PD购自深圳东阳光实业发展公司;HSC由中南大学遗传国家重点实验室捐赠;ET-1(E7764)、α-SMA(A5228)、β-actin(A1978)购自Sigma-Aldrich 公司;鼠尾胶原(354236)购自BD Biosciences公司;ERK(8544)、p-ERK(4370)购
自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法
1.2.1 AKF-PD对肝星状细胞收缩的作用通过胶原凝胶收缩试验研究AKF-PD对HSC收缩的作用。

用2%BSA/PBS在37℃孵育培养板2 h后，冲洗并干燥培养板。

用PBS和1 M NaOH调节鼠尾胶原的pH值。

将2μL胶原加入到各个培养板中。

37℃孵育培养板1 h。

将消化后的HSC接种于培养板上。

孵育过夜后细胞已贴壁，使用不含血清培基孵育3 h。

轻轻将凝胶边缘与培养板分开。

将不同浓度AKF-PD 加入相应培养板中，15 min后加入ET-1。

24 h后照相并计算凝胶面积［6］。

1.2.2 AKF-PD 对α-SMA、总 ERK 及 p-ERK 表达的影响将细胞悬液接种于6孔
板中，分为正常组、模型组、AKF-PD 400 μg·mL-1组。

24 h后，弃去培养基，加入不含血清的DMEM同步化细胞。

12 h后，在AKF-PD 400μg·mL-1组加入AKF-PD。

24 h后，在模型组、AKF-PD 400μg·mL-1组中加入ET-1。

24 h后收集细胞，通过Western Blot法检测α-SMA、总ERK及p-ERK蛋白表达量［7］。

1.3 统计方法所有计量资料均用x±s表示，运用SPSS 16.0统计软件进行分析处理。

首先对数据进行正态分布及方差齐性检验，符合正态分布(P＞0.20)及方差齐(P＞0.10):多组间比较采用单因素方差分析的LSD法进行多重比较;不符合正态分
布或方差不齐:将数据进行秩转换后，进行多组间两两比较，P＜0.05为差异有统
计学意义。

2 结果
2.1 AKF-PD对肝星状细胞收缩的影响如图1，图2所示，在正常组中，胶原凝胶的面积缩小(31.6±5.9)%;ET-1刺激后，胶原凝胶的面积缩小(54.6±4.5)%。

加入
不同浓度的AKF-PD后，ET-1诱导的HSC收缩受到抑制，200μg·mL-1 AKF-PD 使胶原凝胶面积缩小(50.4±6.0)%，400 μg·mL-1 AKF-PD使胶原凝胶面积缩小(35.4±3.1)%，800 μg·mL-1 AKF-PD 使胶原凝胶面积缩小(26.6 ±3.8)%。

2.2 AKF-PD对α-SMA表达的影响如图3，图4所示，ET-1刺激下，HSC内α-SMA表达较正常组显著升高;AKF-PD干预后，α-SMA表达较模型组明显下降。

图1 AKF-PD抑制肝星状细胞收缩所致胶原凝胶缩小
图2 AKF-PD抑制肝星状细胞收缩所致胶原凝胶缩小百分比
图3 AKF-PD抑制HSC内α-SMA表达
图4 AKF-PD抑制HSC内α-SMA表达相对水平
2.3 AKF-PD对总ERK及p-ERK表达的影响通过上面的实验我们知道AKF-PD可以抑制ET-1诱导的α-SMA表达，我们进一步研究AKF-PD通过什么机制抑制α-SMA表达。

如图5、图6所示，ET-1刺激可以显著增加p-ERK表达水平，而AKF-PD可以抑制ET-1对p-ERK的刺激作用。

图5 AKF-PD抑制HSC内p-ERK表达
图6 AKF-PD抑制HSC内p-ERK表达相对水平
3 讨论
AKF-PD是一种新型的吡啶酮类化合物，它不仅在肾纤维化模型中具有显著的抗纤维化作用［8-10］，而且在肝纤维化模型中具有显著的抗纤维化作用［11］。

研究认为，AKF-PD的抗纤维化作用与抑制TGF-β信号通路、MAPK信号通路及炎症反应等有关［9，11-12］。

前期动物实验研究表明，AKF-PD 可以降低门脉高压，但是有关其降低门脉压作用机制尚不清楚。

门脉高压的病理生理基础是肝内血流阻力的增加，这一过程涉及肝脏结构、细胞以及细胞因子的复杂变化。

其中，HSC收缩通过改变肝窦血管内径调节肝窦内血流在门脉高压的形成中发挥主要作用。

在炎症因子刺激作用下，内皮细胞表达并释放ET-1，后者与HSC上的G蛋白偶联受体结合后，一方面通过Rho激酶信号通路调节细胞收缩［13-16］，另一方面也可以通过调节细胞内Ca2+浓度诱导细胞收缩。

此外，ET-1也可以通过ERK/MAPK信号通路调节参与细胞收缩的蛋白表达
来调控细胞收缩［17］。

我们采用胶原凝胶收缩试验观察AKF-PD对HSC收缩的影响。

将HSC接种于胶原上后，细胞收缩牵拉胶原导致胶原面积减小，通过胶原面积大小就可以反映细胞收缩力。

在本实验中，ET-1刺激导致胶原面积显著缩小，说明ET-1可诱导HSC 收缩;在AKF-PD的干预下，胶原面积较模型组增加，说明AKF-PD可抑制ET-1对HSC收缩，并且AKF-PD对HSC收缩的抑制作用与浓度相关。

因此，AKF-PD 降低门脉高压与抑制HSC收缩有关。

α-SMA是HSC内主要的参与细胞收缩的结构蛋白之一［18］。

在本实验中，ET-1刺激可显著诱导HSC表达α-SMA，而 AKF-PD干预可阻断 ET-1对α-SMA表达的诱导作用。

这说明AKF-PD可通过调节α-SMA表达发挥抑制HSC收缩的作用。

研究认为ET-1通过ERK-MAPK信号通路调节α-SMA蛋白表达［17］。

我们通过检测磷酸化ERK表达量来判断AKF-PD是否通过ERK-MAPK信号通路调控α-SMA蛋白表达。

Western Blot结果显示，模型组的磷酸化ERK表达量较正常组显著升高，说明ET-1确实可通过ERK-MAPK信号通路诱导α-SMA表达;AKF-PD干预后，磷酸化ERK表达较模型组显著下降，说明AKF-PD可阻断ERK-MAPK信号通路，进而抑制α-SMA表达，从而发挥抑制HSC收缩的作用。

HSC收缩是门脉高压形成的主要因素之一。

AKF-PD可通过阻断ERK-MAPK信号通路调控α-SMA表达，抑制HSC收缩从而达到降低门脉压的作用。

这为临床应用AKF-PD治疗门脉高压患者提供了理论依据。

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