免疫组化原理及流程介绍ppt课件

⑥ 使用全血清抗体稀释不够
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〔4〕阳性对照染色良好，检测的 阳性标本呈阴性反响。
最常见的缘由是：
标本的固定和处置不当
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本卷须知：
• 1.苏木素复染时间需求探求，尤其要思索阳 性染色的位置。
• 2.切片脱蜡和水化要充分；加反响液时要覆 盖组织充分；每次加 液前甩干洗涤液，但 又防止干片 。
1.防止脱片；2.使抗原 抗体结合更稳定。
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详细做法：
甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围 残留血清，直接参与已稀释的一抗〔1： 250、500、1000〕后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，冰箱中取出后需37 ℃复温 45 min。
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6.二抗孵育
大一点
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5.一抗孵育
一抗:可以特异结合底物，就是识别出 我们想要检测的东西。一抗和底物结 合与否用肉眼是看不出来的。
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• 一抗孵育条件在免疫组化反响中最重要， 包括孵育时间和抗体浓度。
• 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度， 其中4度效果最正确；孵育时间：这与温度、 抗体浓度有关，普通37度1-2h，然后4度过 夜和从冰箱拿出后37度复温45min。详细条 件还要探求。
4)80% ethanol 2 minutes；
详
5)70% ethanol 2 minutes；
细 操
6)distilled water:5 min；
作
7)PBS 洗 3 ×3 min。
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2.细胞通透与封锁内源性过氧化 酶
(1)细胞通透
目的是使抗体可以充分地进入胞内进 展结合反响。普通用Triton X-100、蛋 白酶k等通透液。
常用的修复方法从强到弱普通分 为三种，高压修复、微波修复、胰 酶修复。
酶消化方法 普通用于细 胞内抗原
运用高频电磁波 翻开蛋白质间的 交联键
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详细操作〔微波修复〕：
1) 将切片放入 0.01 M 柠檬酸钠缓冲 溶液〔pH6.0〕后，在微波炉里高火 4 min 至沸腾后，取出，冷却至室温， 再加热，约4次，每次间隔补足液体， 防止干片。
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• 3.以下缘由能够导致片子着色不均匀： • ① 脱蜡不充分。可以 60 ℃烤 20 min，立刻放入新颖
的 二甲苯中； • ② 水化不全。应经常配制新颖的梯度乙醇； • ③ 抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂； • ④ 抗体孵育时，切片放倾斜； • ⑤ 抗体孵育后 PBS 冲洗不充分。 • ⑥ 制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。
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二 免疫组化的原理
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是 指带显色剂标志的特异性抗体在组织 细胞原位经过抗原抗体反响和组织化 学的呈色反响，对相应抗原进展定性、 定位、定量测定的一项新技术。
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它把免疫反响的特异性、组织化学的可 见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括 荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大 作用，在细胞、亚细胞程度检测各种抗原 物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原 体以及受体等)。
阳性对照： 用知抗原阳性的切片与待检
标本同时进展免疫细胞化学染色。 对照切片呈阳性结果，标为阳性 对照。
阴性对照：
用确证不含知抗原的标本作对照， 应呈阴性结果，称阴性对照。其实这 只是阴性对照中的一种，阴性对照还 应包括空白、替代、吸收和抑制实验。
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免疫组化染色实验组与对照组结果分析表
阳性 阴性 替代 实验 对照 对照 对照 组
1
－－
－－
结论
操作错误
2
＋＋
＋＋
非特异性反应
3
＋＋－－
阴性对照含定位Ag
4
－－
－ ＋ 阴性对照不含定位Ag
5
＋－
＋ ＋ 受检组织非特异性染色
6
＋－
－ － 受检组织不含定位Ag
7
＋－－＋
受检组织含定位Ag
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阳性对 阴性对 替代对 实验
照
2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。
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3. 抗原修复 暴露抗原决议簇
由于组织中部分抗原在甲醛或多聚 甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交 联及醛基的封锁作用，从而失去抗原 性；经过抗原修复，使得细胞内抗原 决议簇重新暴露，提高抗原检测率。
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抗原修复的主要方法:
1）染色未完全严格按照操作步骤进行 2）漏加一种抗体，或抗体失活
3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性 4）底物中所加H2O2 量少或失活 5）复染或脱水剂使用不当
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〔2〕一切切片呈阳性反响，其缘由：
①切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。 ②缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确，
1．阳性染色特点 ① Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质 具有构造性。〔非特异性染色 细胞与 组织无区别〕 ② 染色强度不同：颜色深浅不一〔非 特异性染色 弥散性均匀〕。
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2．组织切片制造过程的影响 ① 固定不良—非特异性染色，显示不均。 ② 边缘枯燥—非特异性染色〔常见〕，加 抗体时勿干片。
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SP染色法的特点:
灵敏特异性低，本钱低。
详细操作：
1〕 参与 SP 复合液后放入 37 度烤箱中 30 min。 2〕 用 PBS 洗 5 次×5 min。
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8.显色
在免疫组化中，由于抗原抗体所构 成的复合物本身没有颜色，不能直 接察看，只能借助于其他某些化学 基团的显色作用，是复合物显色， 有利于显微镜下察看。
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三 免疫组化的根本流程
1.脱蜡与水化
22..细细胞胞通通透透、、封封 锁锁内内源源性性过过氧氧化化 物物酶酶
3.抗原修复、暴 露抗原决议簇
4.封锁非特异性 蛋白
5.一抗孵育 6.二抗孵育 7.SP 反响
8.显色
9.复染、脱水、 透明、封片
1.脱蜡与水化
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• 主要内容
一.免疫组化的开展简史 二.免疫组化的原理 三.免疫组化的根本流程 四.免疫组化的结果分析
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一.开展简史
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1941年 Coons 首先用荧光素标志抗体—检测 肺组织内的肺炎双球菌获得胜利。 60年代 Akanke建立酶标抗体技术——铁蛋白 标志Ab技术。 70年代 Stemberger 改良上述技术，建立辣 根过氧化物酶——抗体过氧化物酶〔PAP〕技 术，使免疫细胞化学得到广泛运用。
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通常在过氧化物酶〔HRP〕法中，显 色剂为DAB。
DAB(3,3-二氨基联苯胺显色液)
配法:DAB
50mg
0.05M TB 100ml
30%H2O2 30-40ul
ABC 法 SP法 PAP法
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9、复染、脱水、透明、封片
复染：目的是构成细胞轮廓，从而更好 地对目的蛋白进展定位，经常用的试剂为苏 木素。
80年代 Hsu 等建立了抗生物素—生素 〔ABC〕法之后，免疫金—银染色法、半 抗原标志法、免疫电镜技术相继问世。 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免 疫细胞化学分类方法迅速开展。 2000年 各种免疫组化技术更加成熟，使免 疫组化技术成为当今生物医学中形状、功 能代谢综合研讨的一项有力工具。其运用范 围深达医学各个学科，是目前生命科学任务 者应该掌握的根本技术之一。
3．人工假象与特异性结果显示不在同一 平面上。
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▲染色失败的几种缘由：
染
(1)所染的全部切片均为阴性结
色
果，包括阳性对照在内。
失
败
(2)一切切片均呈阳性反响
的
能
(3)一切切片背景过深
够
情
(4)阳性对照染色良好，检测的
况
阳性标本呈阴性反响
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(1) 所有切片呈阴性
脱蜡与水化的目的是确保抗体等其他 试剂可以充分与组织中抗原等结合发生 反响。假设脱蜡和水化不全易出现局灶 性反响和浸洗不全，而产生非特异性背 景着色。
1)60 ℃×20 min→Xylene：2 ×10 minutes；
2)100% absolute ethanol： 2 ×5 minutes；
3)95% ethanol 2 minutes；
• 3) 透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min
• 4) 封片：中性树胶。
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四 免疫组化结果分析
免疫组化结果的判别原那 么1：.必需设对照。 2.抗原表达必需在特定部位。 3.阴性结果不能视为抗原不表达。
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实验分析的相关引见
详细操作：
1)将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min×5 次； 2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，参与已 稀释的二抗后放入 37℃恒温烤箱中 30 min。 3)用 PBS 洗 5 次×5 min
7.SP反响
SP染色法即链霉素抗生物素蛋白 生 物素过氧化酶衔接法。
该法是ABC法根底上的进一步改良， 使卵白素与链霉〔而非生物素〕结合， 而后再结合PO基。
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(2)封锁内源性过氧化酶
其主要目的是降低内源性过氧化 物酶的活性。在传统的ABC法和SP 法中，免疫组化反响结果容易遭到 内源性过氧化物酶的干扰，必需用 过氧化氢等进展灭活。
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详细操作:
1)用封锁通透液浸润切片 30 min〔RT 避 光〕。 其配法是用预热 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加 400 ul的30％H2O2。
• 2) 脱水：50% ethanol (1-2) min;70% ethanol (1-2) min ;95% ethanol 〔1-2〕 min； 95% ethanol 〔1-2〕 min； 100% absolute ethanol: (1-2) min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。
片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸 酒精中数秒〔一定动作要快〕后拿出流水 振洗，在放入氨水中返蓝即可。
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• 1) 用 PBS 3 次×3min 后，用双蒸水洗 5 min；加一 大滴苏木素染液，〔胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋 白染 20 s 〕，自来水冲洗，双蒸水洗 5 min，再用 PBS 返蓝 5 min。
二抗:可以和一抗结合，并带有可以被 检测出的标志(如带荧光、放射性、化 学发光或显色基团〕，作用是检测一抗。
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• 二抗孵育条件：二抗普通室温或37度 30min-1h，详细时间需求探求。
• 但在免疫组化中我们普通先把二抗浓度和 孵育时间先定下，然后去探求一抗浓度和孵 育时间。
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洗涤不彻底。 ③运用已变色的呈色底物溶液，或呈色反
响时间过长。 ④抗体温育的时间过长。 ⑤H2O2 浓度过高，呈色速度过快且 粘
附剂太厚。
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（3）所有切片背景过深
① 内源性过氧化酶没有完全阻断 ② 切片或涂片过厚 ③ 漂洗不够 ④ 底物呈色反应过久
⑤ 蛋白质封闭不够或所用血清溶血
免疫组化原理及流程引见免疫组化原理及流程引见免疫组化原理及流程引见免疫组化原理及流程引见阳性阳性对照对照阴性阴性对照对照替代替代对照对照实验实验组组结论结论11操作错误操作错误22非特异性反应非特异性反应33阴性对照含定位阴性对照含定位agag44阴性对照不含定位阴性对照不含定位agag55受检组织非特异性染色受检组织非特异性染色66受检组织不含定位受检组织不含定位agag77受检组织含定位受检组织含定位agag免疫组化染色实验组与对照组结果分析表免疫组化原理及流程引见从表上可以看出只需从表上可以看出只需6677实验结果有实验结果有意义
照
照
组
结论
6
＋
－
－
பைடு நூலகம்
－ 受检组织不含定位Ag
7
＋
－
－
＋
受检组织含定位Ag
• 从表上可以看出，只需6，7实验结果有 意义。1～5均因对照组的结果已否认Ab 的特异性或因IHC技术操作存在错误等而 使实验结果失去意义，必需反复实验或 换用 Ab.
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★除上述对照结果分析之外，还必 需从以下几个方面综合评价：
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• 4.一抗的清洗：
〔1〕单独冲洗，防止交叉反响呵斥污染。 〔2〕温顺冲洗，防止切片的零落。引荐 用浸洗方式； 〔3〕冲洗的时间要足够，才干彻底洗去 结合的物质。
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• 5.PBS的PH和离子强度的运用。
2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。
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4.封锁特异性蛋白
组织切片上有些剩余的位点可以与一 抗非特异性结合，呵斥后续结果的假 阳性。 封锁血清普通是和二抗同一来源的，血 清中有一些动物本身的抗体，预先能和 组织中有交叉反响的位点发生结合。
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详细操作：
将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在 组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入 5%羊血清 〔与二抗来源一致〕后放入湿盒中,室温 (约 30℃)下10～30min。