BMI1基因在胃肠道间质瘤中的表达及其相关性

BMI1基因在胃肠道间质瘤中的表达及其相关性
许国定;蒋洪棉;朱茂光;朱世龙;苏泽;李春玲;黄海
【摘要】目的 BMI1基因在胃肠道间质瘤(GIST)发生发展中的作用尚未明确.文中探讨BMI1基因在GIST组织中的表达,并分析其与临床病理学特征的关系. 方法回顾性分析2012年8月至2015年10月就诊于南宁市第一人民医院68例GIST患者资料.采用免疫组化法检测BMI1在正常胃肠道组织和GIST组织中的表达,分析BMI1基因与GIST的各项临床病理参数之间的关系.采用Western印迹法检测BMI1蛋白的表达. 结果 GIST组织中BMI1阳性表达率显著高于非GIST组织(76.47% vs 36.84%,P<0.05). BMI1基因的蛋白表达情况在不同危险度分组之间比较的差异有统计学意义(P<0.05),且在高危险度组中阳性表达率最高(93.75%);而在不同性别、年龄、发生部位、组织学类型及是否转移组间比较差异均无统计学意义(P>0.05). BMI1阳性组肿瘤组织中增殖基因PCNA、CyclinD1 mRNA的表达量高于BMI1阴性组,促凋亡基因Caspase-7、Smac mRNA的表达量低于BMI1阴性组,抗凋亡基因Livin、p53、Bcl-2 mRNA的表达量高于BMI1阴性组
(P<0.05). 结论 BMI1蛋白在GIST组织中的表达增加,其表达量与GIST的危险度分级相关.%Objective The role of BMI1 gene in the development of gastrointestinal stromal tumor (GIST) has not yet been clarified. This study aimed to explore the expression of BMI1 gene in gastrointestinal stromal tumor,and analyze its relationship with clinical pathological features of GIST. Methods The clinical data of 68 GIST patients treated in The First People's Hospital of Nan-ning from August 2012 to October 2015 were analyzed retrospectively. The expression of BMI1 in normal gastrointestinal tissues and GIST tissues were detected with immunohistochemistry
method,and analyzed the relationship between various clinicopathological pa-rameters of GIST and BMI1. The expression of BMI1 protein was detected by Western blot. Results The positive rate of BMI1 was much higher in GIST group than in non-GIST (76.47% vs 36.84%,P<0.05). The difference in the expression of BMI1 protein between the different risk groups was statistically significant (P<0.05). The positive expression rate was the highest in the high-risk group (93.75%),but had no statistically significant difference among different genders,age,locations,histological types and whether me-tastasis (P>0.05). Expression of proliferation genes such as PCNA,CyclinD1 mRNA in BMI1 positive group were higher than those in BMI1 negative group,the expression of Pro-apoptotic genes such as Caspase-7,Smac mRNA were lower than those in BMI1 negative group,the expression of anti-apoptosis genes such as Livin,p53,Bcl-2 mRNA were higher than those in BMI1 negative group (P<0.05). Conclusion The expression of BMI1 protein was increased in GIST tissue. It is correlated with the risk classification,and is an important factor affecting the prognosis of patients.
【期刊名称】《医学研究生学报》
【年(卷),期】2018(031)006
【总页数】5页(P631-635)
【关键词】胃肠道间质瘤;BMI1;免疫组织化学
【作者】许国定;蒋洪棉;朱茂光;朱世龙;苏泽;李春玲;黄海
【作者单位】530022 南宁,南宁市第一人民医院肝胆腺体外科;530022 南宁,南宁
市第一人民医院病理科;530022 南宁,南宁市第一人民医院肝胆腺体外科;530022
南宁,南宁市第一人民医院病理科;530022 南宁,南宁市第一人民医院肝胆腺体外科;530022 南宁,南宁市第一人民医院病理科;530022 南宁,南宁市第一人民医院肝胆腺体外科
【正文语种】中文
【中图分类】R735.2
0 引言
胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)是消化道系统常见的间叶
源性肿瘤，起源于消化道的Cajal细胞[1]。

流行病学调查发现GIST的年发病率约为2/10万，占胃肠道肿瘤的1%～4%，其生理学特征和预后尚难准确评估[2-3]。

BMI1基因在多种恶性肿瘤组织中呈现异常高表达，与肿瘤患者的临床病理、恶性程度及预后密切相关[4-6]。

但该基因在GIST发生发展中的作用及分子机制仍不完全清楚。

本研究应用免疫组织化学检测了GIST患者肿瘤组织中BMI1基因的蛋白表达情况，以期了解BMI1的表达与GIST患者临床病理特征之间的相关性。

1 资料与方法
1.1 研究对象及分组回顾性分析2012年8月至2015年10月就诊于我院普外科
经术后病理明确诊断的68例GIST患者临床资料。

根据2008年美国NIH的GIST危险度分级标准分为4组：高危险度组16例、中危险度组10例、低危险度组23例和极低危险度组19例。

同期收集手术切除的GIST患者瘤旁正常的胃肠
组织标本38份。

所有患者的临床资料均完整，术前均未实施放化疗或分子靶向治疗。

2组患者的胃肠组织标本均经过2位高年资病理医师分别诊断病复查确诊。

1.2 BMI1表达检测所有胃肠组织标本均经4%甲醛固定、常规石蜡包埋，行HE
和BMI1免疫组化染色。

采用Envision两步法进行，参照检测试剂盒说明书进行。

通用型免疫组化SP试剂盒及DAB底物显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术
有限公司。

1.3 增殖、凋亡基因mRNA表达取GIST肿瘤组织及瘤旁正常组织标本，加入Trizol试剂(宁波有成生物医药科技有限公司)裂解细胞、0.2mL氯仿(武汉科昊佳生物科技有限公司)后取无色水相上层、等体积异丙醇(武汉远城科技发展有限公司，货号5484)混合并沉淀总RNA胶装块、75%乙醇(齐一生物科技有限公司，货号130106-200901)清洗RNA沉淀并室温干燥5～10 min。

紫外光吸收法测定
RNA浓度后按照反转录试剂盒(北京雅安达生物技术有限公司，货号K1622)操作
说明合成样品cDNA。

反应体系如下：buffer 2 μL、上下游引物各0.2 μL、dNTP 0.1 μL、MMLV 0.5 μL、DEPC水5 μL、RNA模板2 μL。

目标基因引物序列如下。

PCNA：5′-AGTGCAACGTACGAACTAGTC-3′，5′-GCTGACGTACCAGTCATGA-3′；CyclinD1：5′-CGATCCATGACGTAAGTCA-3′，5′-CGGTAGCAATGCAGTGATGA-3′；Caspase-7：5′-CTGATGCAGTACAAGTCGAA-3′，5′-ATCAGACAGTCGACCATGAA-3′；Livin：5′-GTACAACGTAGTACAGATAGCC-3′，5′-GTACCAGTACAACGTAGCAG-3′；Smac：5′-AGGCATGCAAATGCGTAGAA-3′，5′-CTGGATGAACGTTGAAGAA-3′；p53：5′-TGCGAACGAAATGCGATGGTA-3′，5′-ACGTGACAGTGACCTGATGA-3′；Bcl-2：5′-CGTAAGCAGTCGTGAGAA-3′，5′-GTCGATGCGTAAACGTAGCCGT-3′。

据荧光定量PCR试剂盒(成都福际生物
技术有限公司，货号QP-0201T)操作说明，进行上述目标基因mRNA扩增。

在计算机软件中获取相应PCR扩增曲线，设置BMI1阴性组中基因mRNA表达量为
标准值100，计算BMI1阳性组中目标基因mRNA的相应表达量。

1.4 Western印迹法检测BMI1蛋白的表达采用含10%胎牛血清的细胞培养基进行培养，待GIST细胞生长至85%融合时提取总蛋白，总蛋白的浓度采用二喹啉
甲酸蛋白质定量试剂盒进行测定。

1.5 结果判断在400倍视野下，随机选取10个视野，计数GIST细胞中阳性比例计算百分率，阳性细胞数<10% 记为(-)、10%～25%记为(+)、26%～50%记为(2+)、>50%记为(3+)[7]。

Western印迹法的结果用光密度来对蛋白进行表达，
蛋白的相对表达=目的蛋白/β-actin。

1.6 统计学分析采用SPSS18.0统计软件。

计数资料以n(%)形式表示，组间比较
采用χ2检验；计量资料以均数±标准差形式表达，组间比较采用独立t检验；相
关性分析采用Spearson 相关性检验。

以P≤0.05表示有统计学意义。

2 结果
2.1 一般结果 68例GIST患者中，男38例、女30例，年龄29～77岁，平均(5
3.41±10.56)岁。

肿瘤发生于胃43例、肠19例、胃肠外6例；极低危险组和
低危险组的病理组织中未见转移；中危险组中2例发生淋巴结转移；高危险度组
中6例发生转移(肝3例、淋巴结2例、肺1例)。

2.2 不同组织BMI1表达率比较 68例GIST患者中，BMI1阳性表达52例
(76.47%)，显著高于非GIST组织阳性率(36.84%)，差异有统计学意义(P<0.05)。

BMI1基因的蛋白表达情况在不同危险度分组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)，在高危险度组中阳性表达率最高(93.75%)；而不同性别、年龄、发生部位组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

免疫组化法显示，阳性信号为细胞内出现棕黄色细小颗粒，见图1。

表 1 BMI1的阳性表达与临床病理参数的关系
Table 1 The relationship between the expression of BMI1 and the clinicopathological parameters
项目nBMI的表达情况[n(%)]χ2值P值性别0.370.54 男3828(73.68) 女
3024(80.00)年龄(岁)0.930.34 ≥504133(80.49) <502719(70.37)发生部位
1.250.54 胃4331(7
2.09) 肠1916(84.21) 胃肠外65(8
3.33)危险度9.710.02 极低危险1910(52.63) 低危险2318(78.26) 中危险109(90.00) 高危险1615(93.75) 2.3 增殖基因mRNA表达 BMI1阳性组肿瘤组织中增殖基因PCNA、CyclinD1 mRNA的表达量
显著高于BMI1阴性组(P<0.05)。

见表2。

图 1 BMI1 在非GIST组织及GIST组织中的表达(SP ×400)
Figure 1 The expression of BMI1 in non-GIST and GIST (SP ×400)
表 2 不同BMI1表达的肿瘤组织中增殖基因mRNA表达量比较
Table 2 Comparison of the expression of proliferating gene mRNA in tumor tissues with different BMI1 expression
组别nPCNACyclinD1阴性组16100100阳性组
52193.27±22.68174.28±21.35t值16.3613.84P值<0.01<0.01
2.4 凋亡基因mRNA表达 BMI1阳性组肿瘤组织中促凋亡基因Caspase-7、Smac mRNA的表达量显著低于BMI1阴性组，抗凋亡基因Livin、p53、Bcl-2 mRNA的表达量显著高于BMI1阴性组，差异有统计学意义(P<0.05)。

见表3。

2.5 BMI1蛋白在GIST组织中的表达 BMI1蛋白在GIST组织中为高表达
(2.4±0.2)，明显高于非GIST组织(1.2±0.3)，差异有统计学意义(P<0.01)。

见图2。

表 3 不同BMI1表达的肿瘤组织中凋亡基因mRNA表达量比较
Table 3 Comparison of mRNA expression of apoptotic genes in tumor tissues with different BMI1 expression
组别nCaspase-7LivinSmacp53Bcl-2阴性组16100100100100100阳性组5264.28±14.09183.26±21.8470.76±15.24167.22±21.85190.42±24.38t值10.0915.177.3612.2414.76P值0.0000.0000.0000.0000.000
图 2 BMI1 蛋白在GIST组织中的表达
Figure 2 The expression of BMI1 protein in GIST
3 讨论
BMI1基因是1991年发现的原癌基因，是一种广泛表达的核蛋白，直接参与调控细胞周期、增生和衰老[8]。

其作为一个表观遗传修饰蛋白参与肿瘤干细胞的维护，在肿瘤形成和肿瘤侵袭转移起着关键作用[9-11]。

Zhang等[12]在胃癌中发现
BMI1的表达水平与淋巴结转移及肿瘤的临床分期显著相关。

Proctor等[13]在胰
腺癌细胞系中发现BMI1过表达可以导致细胞增殖能力和侵袭能力明显增强。

这些研究都提示BMI1基因在多种恶性肿瘤中呈现过度表达状态，而过度表达BMI1可上调人端粒逆转录酶的转录，使得端粒酶活性增高，阻止细胞的衰老，导致永生化。

因此，在BMI1在细胞恶性转化中起到了重要作用。

GIST是既不同于典型平滑肌肿瘤亦不同于神经鞘瘤的胃肠道最常见的间叶来源肿瘤。

Soreide等[14]对19个国家13 550例GIST患者的基本情况进行分析，结果显示该病患者的中位年龄为60.3岁，主要发生在胃部，这与本研究的结果相一致；但张文迪等[15]研究认为GIST的患病率以男性为主，这与本研究和Soreide等[14]的研究结果不相符，这可能与研究的纳入条件存在差异有关。

本课题组研究表明，随着GIST危险度的增加，BMI1基因的阳性率明显提高，这个结果与范中平
等[16]研究的结果相一致。

另外，本研究还发现BMI1基因的表达在GIST的不同
组织学类型组间比较，差异均无统计学意义。

通过对在GIST组织中BMI1表达的相关性分析发现，BMI1基因的表达与GIST的危险度呈正相关，表明 BMI1 参与
了GIST的发生、发展，并可能促进癌细胞的侵袭和远处转移，提示其表达可能对肿瘤的预后有指导意义。

相关研究已证实，BMI1基因可以抑制抑癌基因PTEN的表达，激活AKT/GSK3β信号通路，增强肿瘤细胞的侵袭能力。

我们推断BMI1基因可能是通过促进胃肠道黏膜的上皮-间充质的相互转化，从而促进GIST的转移
和侵袭，加速病情的进展，是GIST发生发展中的危险因素之一，具有较高的潜在临床应用价值。

为进一步明确BMI1蛋白表达对GIST肿瘤细胞恶性生物学行为的影响，本研究进一步对比不同BMI1蛋白表达的肿瘤细胞增殖、凋亡活性差异。

PCNA是一种仅
出现在增殖状态细胞核内蛋白质，其表达量与肿瘤细胞增殖活性呈正相关，在G0期和G1的极早期不表达，在G1晚期阶段表达逐渐增加，在S期达到峰值[17]。

CyclinD1是典型的细胞周期蛋白，属于原癌基因[18]。

目前临床上已经将PCNA、CyclinD1广泛应用于肿瘤发生发展、分级、浸润转移等方面的评价指标。

本研究
结果显示，与BMI1阴性组相比，BMI1阳性组PCNA、CyclinD1 mRNA的表达量较高，提示BMI1基因高表达可能与GIST细胞增殖密切相关。

Livin 蛋白是人
凋亡抑制蛋白家族的新成员之一，其在正常组织中低表达或不表达，在多种恶性肿瘤组织中处于高表达状态；而Caspase-7属于半胱氨酸蛋白酶家族成员，其活化
后可以导致细胞凋亡，其表达减少甚至缺失是肿瘤恶变的重要原因[19]。

Livin 通
过抑制Caspases的活性，阻断Caspase-7的信号传导通路，从而抑制细胞凋亡
的效应。

相关研究表明，细胞凋亡可能依赖于p53基因蛋白的介导，受Bcl-2基
因蛋白水平调控，两者在组织中的表达量与端粒酶活性呈显著正相关，可诱导肿瘤细胞无限增殖并增强肿瘤恶性程度[20]。

而p53 转录可上调凋亡抑制基因的表达，与凋亡抑制基因共同作用增加线粒体外膜的通透性，释放 Smac[21]；Smac 是存在于线粒体的促凋亡蛋白，能够促肿瘤细胞的凋亡，其作用在多种恶性肿瘤中已得到证实[22]。

本研究结果证实，与BMI1阴性组相比，BMI1阳性组促凋亡基因
Caspase-7、Smac mRNA的表达量较低，抗凋亡基因Livin、p53、Bcl-2 mRNA的表达量较高，证实BMI1基因高表达可抑制肿瘤细胞的正常凋亡。

本研究因未对患者进行回访，无患者预后相关的临床资料，未进行BMI1基因与GIST 瘤患者预后的生存分析。

综上所述，本研究发现BMI1蛋白在GIST组织中的表达增加，而且其表达量与GIST的危险度分级呈现正相关，其可以作为评价GIST患者病情进展程度和预后的指标，也可作为靶向治疗的新靶点。

然而，BMI1在GIST发展中的具体作用及其分子机制需要尚需进一步深入研究。

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