生化试验1

物种分布及多样性调查 一、土壤中动物的分布调查 1、选择三种类型的土壤环境 、 2、每种土壤挖三个样方：0.25×0.25×0.3m3 、每种土壤挖三个样方： × × 3、分别统计1-10cm层、11-20cm层、21-30cm层 、分别统计 层 层 层 的动物种类及其数量 4、需测定土壤的温度和酸碱度 、 结果分析： 结果分析：求出每种土壤类型的不同层次中动物数 量的平均值、标准差、 量的平均值、标准差、标准误 比较不同土壤动物种类和密度， 比较不同土壤动物种类和密度，说明环境条件
聚合酶链反应（ 聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增 ）技术体外扩增DNA PCR进行的基本条件：DNA模板、引物、dNTP、 进行的基本条件： 模板、 进行的基本条件 模板 引物、 、 TaqDNA酶、反应缓冲体系（Mg2+） 酶 反应缓冲体系（ ） PCR三个步骤： 三个步骤： 三个步骤 1、模板DNA变性：94度变成单链 、模板 变性： 度变成单链 变性 2、模板DNA和引物的复性（55度） 、模板 和引物的复性（ 度 和引物的复性 3、引物的延伸 、 引物设计： 个核苷酸； 引物设计：15-25个核苷酸；G+C（40%-60%）； 个核苷酸 （ ）； Tm=55度；引物自身形成环结构的碱基对﹤3；两 度 引物自身形成环结构的碱基对﹤ ； 条引物配对碱基数小于5 条引物配对碱基数小于
三、电泳技术 1、泳动率=Ld/Vt L：泳动距离 ：支持物的有效 、泳动率 ：泳动距离d： 长度； ： 长度；V：电压 t：通电时间 ： 泳动率与球形分子所带电荷电量成正比； 泳动率与球形分子所带电荷电量成正比；与分子大 小及介质黏度成反比。 小及介质黏度成反比。 pH小于等电点，分子带正电，向负极泳动；pH偏 小于等电点，分子带正电，向负极泳动； 偏 小于等电点 离等电点越远，分子所带电荷越多，涌动越快。 离等电点越远，分子所带电荷越多，涌动越快。 缓冲液的离子浓度过高，离子的电泳速度减慢； 缓冲液的离子浓度过高，离子的电泳速度减慢； 缓冲液的离子浓度过低，不易维持 稳定 缓冲液的离子浓度过低，不易维持pH稳定
• 细胞及其组分的分离 和纯化 –从组织中分离出不 从组织中分离出不 同类型的细胞 –方法 ： 用蛋白水解 方法： 方法 酶和钙螯合剂乙二 胺四乙酸（ EDTA） 胺四乙酸 （ EDTA ） 处理组织， 处理组织 ， 再轻度 机械破坏， 机械破坏 ， 使之成 为单细胞。 为单细胞。 –用超速离心机分离 用超速离心机分离 出细胞器和大分子 • 方法:见图 方法:
遗传学实验
果蝇幼虫唾液腺染色体标本的制作及观察
原理： 原理：果蝇幼虫的唾液 腺染色体为巨大染色体， 腺染色体为巨大染色体， 同时永久停留在分裂前 便于观察。 期，便于观察。 步骤：1、取出唾液腺 步骤： 、 三龄幼虫） 、染色： （三龄幼虫）2、染色： 醋酸洋红15分钟 分钟3、 醋酸洋红 分钟 、压 将细胞核压开， 片：将细胞核压开， 使染色体伸展出来。 、 使染色体伸展出来。4、 封蜡
离子交换剂：阳离子交换剂； 离子交换剂：阳离子交换剂；阴离子交换剂 洗脱常用：电解质浓度梯度； 梯度 洗脱常用：电解质浓度梯度；pH梯度 4、凝胶过滤：利用具有一定孔径范围的多孔凝胶 、凝胶过滤： 的分子筛作用对生物大分子进行分离。 的分子筛作用对生物大分子进行分离。 5、亲和层析：利用化学方法将可与待分离物质可 、亲和层析： 逆性特异结合的化合物（配体） 逆性特异结合的化合物（配体）连接到某种固相载 体上，并将装有配体的固相载体装柱，当大分子蛋 体上，并将装有配体的固相载体装柱， 白通过时会特异性结合， 白通过时会特异性结合，其他则被冲洗下去
Rf=溶质层析点中心到原点中心的距离 溶质层析点中心到原点中心的距离 溶剂前沿到原点中心的距离
3、离子交换层析：利用离子交换剂对需要分离的 、离子交换层析： 各种离子具有不同的亲和力而达到分离目的。 各种离子具有不同的亲和力而达到分离目的。 固定相： 固定相：离子交换剂 流动相： 流动相：电解质溶液
遗传学实验中常用的统计学方法 1、平均值 、 2、中值：最大和最小数值的平均值 、中值： 3、百分率 、 4、方差：表示总体或样本中数据的分散程度 、方差： _ S2=∑（x-x）2/n 当n＜100时，n用n-1替代 （ ） ＜ 时 用 替代 5、标准差：方差的平方根 、标准差： 6、标准误：总体中许多样本的平均数的标准差 、标准误： =√ S2/n
1、吸附层析：把吸附剂装入玻璃柱内，由于吸 、吸附层析：把吸附剂装入玻璃柱内， 附剂对不同物质的吸附力不同， 附剂对不同物质的吸附力不同，在洗脱过程中会 因移动速度不同而逐渐分离出来。 因移动速度不同而逐渐分离出来。 常用来分离： 常用来分离：非极性和极性不强的有机物 2、分配层析：利用混合物中各组分在两相中的 、分配层析： 分配系数不同而达到分离目的。（纸层析法） 。（纸层析法 分配系数不同而达到分离目的。（纸层析法） 固定相： 固定相：极性溶液 流动相： 流动相：有机溶剂
Northern blotting：检测 ：检测RNA
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转 免疫印迹（ 免疫印迹 ） 移到膜上，然后利用抗体进行检测。 移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋 可用相应抗体作为一抗进行检测， 白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的 表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
细胞学实验 1、细胞内质体的观察 、 2、人体染色体组性分析与分带技术 、 植物血细 外周血淋 胞凝集素 进入分裂 秋水仙素 中期 巴细胞 期 低渗处理 离心 置于载玻片 离心 固定 细胞团 预固定 挑选 用Giemsa染色 染色 拍照 组型分析
生化试验 一、实验仪器 1、微量移液器：枪 、微量移液器： 一般五种规格，范围： 微升 微升-5ml 一般五种规格，范围：0.5微升 2、水浴锅 、 3、琼脂糖水平电泳槽 、 4、快速混匀器 、 5、离心机 、 6、稳压稳流电泳仪 、 7、酸度计 、 8、PCR扩增仪 、 扩增仪
二、层析技术
固定相 流动相
生态学实验： 生态学实验： 一、种群密度的调查
1、总数量计算法：大型、明显易见的生物 、总数量计算法：大型、 2、样方法 、 3、标志重捕法 、 4、移除法：短期内用同一方法陆续取走一部分 、移除法： 动物，把每次取走的动物数量累加起来， 动物，把每次取走的动物数量累加起来，并作 看出被取走的动物总数会稳定在一定数量。 图，看出被取走的动物总数会稳定在一定数量。
生物大分子的分离、纯化、 生物大分子的分离、纯化、鉴定 理化性质 分子大小和形态 溶解度 电荷差异 分离纯化方法 差速离心；超滤； 差速离心；超滤； 分子筛； 分子筛；透析 盐析、萃取、分配 盐析、萃取、 层析、 层析、结晶 电泳、 电泳、等电点聚焦 电泳、 电泳、离子交换层 析 亲和层析
生物功能专一性
分光光度计 原理：光线选择性的被溶液吸收， 原理：光线选择性的被溶液吸收，不同浓度吸光不同 对于相同物质和相同波长的单色光来说， 对于相同物质和相同波长的单色光来说，溶液的光密 度与溶液浓度呈正比。 标准溶液 度与溶液浓度呈正比。C1=D1×C2/D2 C2:标准溶液 的浓度； 的浓度； 步骤：事先测定一系列不同浓度的标准管，然后以光 步骤：事先测定一系列不同浓度的标准管， 密度对标准浓度作图，得到标准曲线， 密度对标准浓度作图，得到标准曲线，测得待测物质 的光密度后，从标准曲线上查到相应的浓度数值。 的光密度后，从标准曲线上查到相应的浓度数值。 用分光光度计测叶绿体中各色素的含量 1、提取叶绿素 2、测定吸光度 3、根据公式计算 、 、 、 出叶绿素的浓度
水中污染物的检测 溶解氧（ ）： ）：衡量污染程度的指标 溶解氧（DO）：衡量污染程度的指标 碘量法：原理： 碘量法：原理：水样中加入硫酸锰及碘化钾生成 氢氧化锰沉淀，与水中溶解氧生成锰酸锰， 氢氧化锰沉淀，与水中溶解氧生成锰酸锰，再加 入浓硫酸， 入浓硫酸，使已化合的溶解氧与碘化钾发生反应 析出碘。溶解氧越多，析出的碘越多， 析出碘。溶解氧越多，析出的碘越多，溶液颜色 越深。用淀粉作指示剂， 越深。用淀粉作指示剂，用硫代硫酸钠滴定碘含 计算出溶解氧的含量。 量，计算出溶解氧的含量。 步骤：采集水样；定氧； 步骤：采集水样；定氧；滴定
DNA的凝胶电泳 DNA的凝胶电泳
2、醋酸纤维素薄膜电泳：利用醋酸纤维素薄膜做固 、醋酸纤维素薄膜电泳： 体支持物。用于蛋白质、酶的分离。 体支持物。用于蛋白质、酶的分离。 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖不含带电荷的集团， 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖不含带电荷的集团，通过氢 键形成凝胶，电泳速度快，区带整齐。主分离DNA 键形成凝胶，电泳速度快，区带整齐。主分离 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）:分离蛋白质和核酸 ） 分离蛋白质和核酸 三、生物大分子分离 1、细胞破碎：捣碎法、研磨法、匀浆法、冻融 、细胞破碎：捣碎法、研磨法、匀浆法、 超声波处理、压榨法、 法、超声波处理、压榨法、酶解法 2、提取：盐溶液、缓冲液、有机溶剂 、提取：盐溶液、缓冲液、 3、纯化：沉淀法、透析、超滤、冷冻干燥 、纯化：沉淀法、透析、超滤、
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Southern杂交 杂交 原理】 【原理】 将待检测的DNA样品固定在固相载体上 与标记的 样品固定在固相载体上,与标记的 将待检测的 样品固定在固相载体上 核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相 核酸探针进行杂交 在与探针有同源序列的固相 DNA的位置上显示出杂交信号。通过 的位置上显示出杂交信号。 的位置上显示出杂交信号品中是否有与探针同源 交可以判断被检测的 样品中是否有与探针同源 的片段以及该片段的长度。 的片段以及该片段的长度。 一．基因组DNA的限制酶切 基因组 的限制酶切 二．基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳 基因组 消化产物的琼脂糖凝胶电泳 三．DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物 从琼脂糖凝胶转移到固相支持物 四.探针标记 探针标记 五．杂交 六．洗膜与检测
如果在独立重复试验中，事件 的概率为 的概率为P， 如果在独立重复试验中，事件A的概率为 ，则 次试验中事件A恰好发生 次的概率为： 在n次试验中事件 恰好发生 次的概率为： 次试验中事件 恰好发生m次的概率为 Pn（m）=Cnpmqn-m ） 卡方检验： 卡方检验：表示理论数与实际数的差异程度 X2=∑（实得数 预期数）2 预期数） （实得数-预期数 预期数 n：子代分类数 根据n和卡方值 查出p， 和卡方值， ：子代分类数-1 根据 和卡方值，查出 ， 如果p>0.05,实际数与理论数无显著差异，实际 实际数与理论数无显著差异， 如果 实际数与理论数无显著差异 分布与理论分布符合。 分布与理论分布符合。
二、水质污染的微核检测法
实验原理：蚕豆染色体少（ 对），形体大 形体大。 实验原理：蚕豆染色体少（6对），形体大。 蚕豆发芽时对诱变剂敏感， 蚕豆发芽时对诱变剂敏感，易出现微核现象 步骤： 、 步骤：1、采集水样 2、催芽至根须长 、催芽至根须长2-3cm 3、染毒 4、复培：将染毒后的根重新培养 、 、复培： 5、制片观察 、 结果： 结果：根据微核的数量来判断污染物的毒性