中成药抑制成纤维细胞胶原沉积的作用研究

中成药抑制成纤维细胞胶原沉积的作用研究*
杨
剑，韩立峰，邵
睿，张鹏，郝
佳，常艳旭，高秀梅，王
涛
（天津中医药大学中医药研究院，天津
301617）
*基金项目：天津市科技重大专项与工程项目（20ZXGBSY00050）。

作者简介：杨剑（1987-），女，博士，副研究员，主要研究方向为特发性肺纤维化的药理及制剂研究。

通讯作者：王
涛，E-mail ：******************.cn
·新型冠状病毒肺炎·
2020年初新型冠状病毒肺炎（简称新冠肺炎）的突发给中国人民健康和经济发展带来了巨大打
击。

该疫情被世界卫生组织列为国际关注的公共突发卫生事件。

短短两个月事件造成全国7万余人感染，3000余人死亡，疫情波及30个国家，引起了世界范围的恐慌。

近年世界范围多次出现病毒性呼吸道传播
疾病，包括2003年严重急性呼吸综合征
（SARS ）、2009年H7N9流感、2012年中东呼吸综合征（MERS ）等相关疫情。

疾病发生频率逐渐加快，病毒变异迅速，从常规抗病毒化学药物、疫苗研发规律来看，临床有效治疗药物缺乏，治疗手段难以及时跟进。

如何发挥中医药防疫抗病能力成为中医药研究者的重要课题。

在新型冠状病毒感染后，体液中迅速大量产生多种细胞因子，形成细胞因子风暴，导致人体免疫系统紊乱，引起急性呼吸窘迫综合征、多器官衰竭等症[1]。

细胞因子风暴需药物及时干预，以避免过多的组织液肺部渗出，影响呼吸功能[2]。

大量临床证据证实，病毒侵染呼吸系统，造成肺损伤后可引起肺纤维化。

SARS 流行期间，有45％的患者在感染后1个月肺部表现出“毛玻璃”外观。

跟踪病例研究显示，有27.8％的SARS 幸存者肺功能下降，肺纤维化程度增加。

肺纤维化是病毒性肺炎患者恢复期的常见后遗症，缺乏有效临床治疗药物。

本研究收集了多种上市中成药，筛选抗成纤维细胞胶原沉积活性药物，为病毒感染肺损伤者的愈
后干预提供科学依据。

1
实验部分
1.1仪器与材料KO-250E 超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；IKA RV 10旋转蒸发仪，德国IKA 公司；Milli-Q 超纯水制备仪，Millpore 公司；超声裂解仪，宁波新芝生物科技有限公司；DC300F 倒置相差显微镜，德国Leica 公司；多功能酶标仪，Tecan 公司；倒置显微镜，日本Nikon 公司；NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞株及MRC5人源成纤维细胞株均来自ATCC ；转化生长因子-β1（TGF-β1），R&D system 公司；SB431542，美国Selleck 公司；DMEM 培养基、胎牛血清均购于美国Gibco 公司；1%青/链霉素，美国HyClone 公司；乙醇、二甲基亚砜（DMSO ）等化学试剂均为分析纯，天津康科德科技有限公司。

1.2中成药提取收集多种上市中成药，粉碎后（喷雾剂使用原料）以10倍70%乙醇溶液（W/V ）超声提取30min ，4000g 离心10min ，离心半径为150mm ，吸取上清液，40℃减压浓缩至干，干燥粉末以100mg/mL 浓度溶于DMSO 中，备用。

1.3成纤维细胞胶原含量检测参考文献方法[3]，收集对数生长期细胞，以1×105/mL 将鼠源胚胎成纤维NIH-3T3细胞，人源肺成纤维化MRC5细胞接种到96孔板中，以含10%胎牛血清的DMEM 完全培养基在37℃，5%CO 2环境下培养，过夜后更换为无血清培养基。

同步化24h 后，用TGF-β1（5ng/mL ）处理48h 为模型组，用TGF-β1+SB431542（TGF-β1抑制剂，终浓度5μmol/L ）作为阳性药组，TGF-
摘要：[目的] 病毒侵染呼吸系统，造成肺损伤后可引发肺纤维化。

这一过程通常与肺部成纤维细胞募集、胶原沉积，细胞外基质重塑等病理过程相关，临床缺乏有效治疗药物。

实验旨在寻求能有效抑制胶原沉积的中成药。

[方法] 通过天狼星红法，就人源肺成纤维细胞和鼠源胚胎成纤维细胞的两种胶原沉积模型，对已上市的多种中成药进行了筛选。

[结果] 发现多种中成药提取物对鼠源胚胎成纤维细胞、人源肺成纤维化细胞的胶原沉积均有抑制作用。

[结论] 提示这些中成药有较好的临床应用前景，为后期新型冠状病毒肺炎康复治疗提供用药选择依据。

关键词：中成药；成纤维细胞；胶原沉积；新型冠状病毒肺炎中图分类号：R511
文献标志码：A
文章编号：1672-1519（2020）06-0618-05
DOI ：10.11656/j.issn.1672-1519.2020.06.06
表1
中成药对人源肺成纤维细胞胶原沉积的
抑制作用（x ±s ）
Tab.1Inhibition effect of Chinese patent medicine on collagen deposition of human-derived lung fibroblasts
（x ±s ）组别
相对胶原沉积率
[A 540nm （给药组）/A 540nm （阳性药组）]
空白对照组（Control ）0.99±0.02模型组（TGF-β1） 1.24±0.02阳性药组（TGF-β1+SB ） 1.06±0.06给药组（清喉利咽颗粒）0.97±0.10*给药组（止嗽定喘丸） 1.11±0.01***给药组（清金止嗽化痰丸）0.99±0.06**给药组（六神丸）
0.71±0.07**给药组（复方一枝黄花喷雾剂）
1.05±0.08*给药组（复方芩兰口服液）0.97±0.11*给药组（八宝丹胶囊）0.83±0.07**给药组（痰热清胶囊）0.89±0.14*给药组（蒲地蓝消炎片） 1.16±0.02*给药组（通宣理肺片） 1.09±0.05**给药组（清瘟解毒片）
1.05±0.05**
注：与模型组（TGF-β1）比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。

注：Control 为空白对照组，TGF-β1为模型组，TGF-β1+SB 为阳性药
组；bar 值为50μm 。

图2鼠源胚胎成纤维细胞胶原沉积模型构建Fig.2
Murine-derived fibroblast collagen deposition model
TGF-β1+SB
TGF-β1
Control 注：Control 为空白对照组，TGF-β1为模型组，TGF-β1+SB 为阳性药
组；bar 值为50μm 。

图1人源肺成纤维细胞胶原沉积模型构建
Fig.1Human-derived lung fibroblast collagen deposition
model
TGF-β1+SB
TGF-β1Control
β1+100μg/mL （终浓度，DMSO 浓度为0.1%）不同中成药提取物为给药组，空白对照组直接加培养基100μL 培养。

48h 后弃去孔中培养基，并用200μL PBS 洗涤细胞3次，用-20℃冰甲醇固定过夜后，200μL PBS 洗涤3次，每孔加入100μL 天狼星红试剂，室温避光放置4h ，弃去游离的天狼星红，每孔用200μL 的0.01%乙酸洗涤3次后风干，加入200μL 0.1mol/L NaOH ，振荡1h 后应用多功能酶标仪在540nm 处进行吸光度的测定。

相对胶原沉积率=A 540nm （给药组）/A 540nm （阳性药组）。

包括模型组、阳性药组、空白对照组、给药组在内的每组样品都平行进行了4次复孔实验。

1.4统计学方法使用SPSS 20.0统计软件，实验数据用均数±标准差（x ±s ）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA ），两两比较采用Dunnett 检验，P <0.05为差异有统计学意义。

2实验结果
2.1成纤维细胞胶原沉积模型构建及中药提取物对细胞活力的影响肺成纤维细胞贴壁同步化后，通过TGF-β1诱导48h ，经天狼星红染色，镜下可见明显胶原沉积。

阳性对照药，TGF-β1抑制剂SB431542（SB ，终浓度5μmol/L ）可有效降低胶原沉积（人源肺成纤维细胞胶原沉积模型，见图1；鼠源胚胎纤维细胞胶原沉积模型，见图2），说明本实验体系建立成功。

各中成药提取物在本实验设计浓度下，镜下未见细胞形态及密度明显改变。

2.2中成药提取物对MRC5人源肺成纤维细胞胶
原沉积的影响与空白对照组相比，TGF-β1诱导人源肺成纤维细胞胶原沉积量上升约1.3倍，TGF-β1抑制剂SB431542（终浓度5μmol/L ）处理后能有效降低胶原沉积至正常水平。

在100μg/mL 浓度下，清喉利咽颗粒、止嗽定喘丸、清金止嗽化痰丸（天津中新药业乐仁堂制药厂，生产批号分别为0780974、15502235和0790104），六神丸（上海雷允上药业有限公司，生产批号为190601），复方一枝黄花喷雾剂（贵州百灵企业集团，生产批号为20200115），复方芩兰口服液（黑龙江珍宝岛药业股份有限公司，生
产批号为B36200206001），八宝丹胶囊（厦门中药厂，生产批号为190630），痰热清胶囊（上海凯宝药
业股份有限公司，生产批号为2001102），蒲地蓝消炎片、通宣理肺片、清瘟解毒片（天津中新药业隆顺榕制药厂，生产批号分别为190082、250001和220002）等11种中成药提取物能有效抑制胶原沉积（见表1，图3）。

2.3中成药提取物对NIH/3T3鼠源胚胎成纤维细
胞胶原沉积的影响与空白对照组相比，TGF-β1诱
导鼠源胚胎成纤维细胞胶原沉积量上升约1.2倍，TGF-β1抑制剂SB431542（终浓度5μmol/L ）处理后能有效降低胶原沉积至正常水平。

在100μg/mL 浓度下，牛黄清心丸局方（天津中新药业达仁堂制药厂，生产批号190622），清喉利咽颗粒、止嗽定喘
表2中成药对鼠源胚胎成纤维细胞胶原沉积的
抑制作用（x ±s ）
Tab.2
Inhibition effect of Chinese patent medicine on
collagen deposition of murine -derived lung fibroblasts （x ±s ）
组别
相对胶原沉积率
[A 540nm （给药组）/A 540nm （阳性药组）]
空白对照组（Control ） 1.06±0.03模型组（TGF-β1） 1.25±0.03阳性药组（TGF-β1+SB ） 1.00±0.04给药组（牛黄清心丸局方） 1.09±0.06*给药组（清喉利咽颗粒）0.97±0.10*给药组（止嗽定喘丸）0.96±0.05**给药组（八宝丹胶囊） 1.01±0.06**给药组（痰热清胶囊）0.80±0.02***给药组（清热解毒口服液） 1.10±0.06*给药组（清开灵注射液） 1.02±0.08**给药组（清瘟解毒片）
1.03±0.10*
注：与模型组（TGF-β1）比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。

注：bar 值为50μm 。

图3
中成药提取物对人源肺成纤维细胞胶原沉积的抑制作用
Fig.3
Inhibitory effect of Chinese patent medicine extract on collagen deposition of human-derived lung fibroblasts
丸（天津中新药业乐仁堂制药厂，生产批号分别为0780974和15502235），八宝丹胶囊（厦门中药厂，
生产批号为190630），痰热清胶囊（上海凯宝药业股份有限公司，生产批号为2001102），清热解毒口服液、清开灵注射液（神威药业集团，生产批号分别为1912271和20011601），清瘟解毒片（天津中新药业隆顺榕制药厂，生产批号为220002）等8种中成药提取物能有效抑制胶原沉积（表2，图4）。

3讨论
在肺部炎症的损伤修复阶段，巨噬细胞调节炎症反应，并分泌转化生长因子TGF-β1和血小板衍生生长因子等，刺激成纤维细胞增殖，造成胞外基质重塑，胶原蛋白过度沉积，这个过程如果不加以药物干预，将发展为不可逆的肺纤维化，肺部会出现“毛玻璃”“蜂窝煤”状，导致呼吸困难甚至衰竭，严重影响患者生活质量。

注：bar 值为50μm 。

图4
中成药提取物对鼠源胚胎成纤维细胞胶原沉积的抑制作用
Fig.4
Inhibitory effect of Chinese patent medicine extract on collagen deposition of murine-derived lung
fibroblasts
TGF-β1TGF-β1+SB 牛黄清心丸局方清喉利咽颗粒止嗽定喘丸
八宝丹胶囊痰热清胶囊清热解毒口服液清开灵注射液
清瘟解毒片
TGF-β1TGF-β1+SB 清喉利咽颗粒止嗽定喘丸清金止嗽化痰丸
六神丸复方一枝黄花喷雾剂复方芩兰口服液八宝丹胶囊痰热清胶囊
蒲地蓝消炎片通宣理肺片清瘟解毒片
目前，美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗肺纤维化的药物仅有吡非尼酮（细胞因子抑制剂）和尼达尼布（酪氨酸激酶抑制剂）[4]，但这两种药物临床用量大，治疗成本高，且易出现耐药性，患者依从性差。

目前为止，中国尚无治疗肺纤维化药物上市。

中医认为，肺纤维化属于“肺痹”和“肺痿”的范畴，其病机在于气阴两虚，并兼有痰、瘀、热之邪。

气滞而痰凝，脾虚而聚湿，阻于肺腔。

中医治疗以益气养阴为主，活血化瘀为辅，补肺生津，标本兼治。

临床证实，血府逐瘀汤、丹参饮合二陈汤、桑白皮汤[5]等具有一定临床治疗效果。

本研究从已上市中成药出发，寻找能有效抑制胶原沉积、阻碍肺纤维化发生发展的药物，以满足肺纤维化治疗的临床药物需求。

在对纤维化考察的细胞水平实验中，人源肺成纤维细胞（MRC-5）和鼠源胚胎成纤维细胞（NIH-3T3）为体外实验常用的两种细胞系[6-7]。

在纤维化的发展过程中，一部分纤维细胞分化为肌成纤维细胞，产生并积聚过量的胶原蛋白，胶原蛋白沉积会破坏肺部组织结构和功能，引发纤维化[8-9]。

本实验所涉及的两种细胞模型，均首先通过TGF-β诱导活化后用天狼星红染色法检测细胞内胶原沉积，确定模型诱导成功，以此作为肺纤维化中胶原沉积的细胞模型。

研究结果表明，清喉利咽颗粒、止嗽定喘丸、八宝丹胶囊、痰热清胶囊、清瘟解毒片5种中成药提取物，对鼠源、人源肺成纤维化细胞的胶原沉积均有抑制作用，提示这些上市中成药有应用于治疗肺纤维化的前景。

进一步对所有有效中成药组成药味进行分析，结果发现，黄芩、甘草、连翘、桔梗等饮片使用频率较高，通过文献查阅，对这4味药所含有的化学成分进行了整理，与本研究发现一致，如黄芩中的黄芩苷、黄芩素，甘草中的甘草酸[8]、甘草次酸，连翘中的连翘苷元、牛蒡子苷，桔梗根中的皂苷类成分等对纤维化有缓解作用[10-17]。

本研究正在持续进行，下一步将针对活性中成药开展体内研究，以明确其药效物质及作用机制，为临床治疗肺纤维化提供科学依据。

致谢：多家中药制药企业无私提供检测样品，在此表示衷心地感谢!由于时间仓促，本次仅报道了部分结果，后续研究将陆续报道，为疫情防控提供中医科技支撑。

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（收稿日期：２０２０－０３－０６）（本文编辑：马英，于春泉）
Study of the effect of marketed Chinese patent medicine on inhibiting collagen deposition in fibroblasts models
YANG Jian ，HAN Lifeng ，SHAO Rui ，ZHANG Peng ，HAO Jia ，CHANG Yanxu ，GAO Xiumei ，WANG Tao （ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＴｉａｎｊｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０１６１７，Ｃｈｉｎａ）
Abstract ：[Objective]The respiratory system infected by virus normally causes lung injury ，subsequently followed by pulmonary fibrosis.This process is related to several pathological processes ，such as recruitment of lung fibroblasts ，collagen deposition and extracellular matrix remodeling.Currently ，there is no effective therapeutic drugs in the clinic.This experiment was aim to get the marketed Chinese patent medicine with the effect of collagen deposition inhibiting.[Methods]In this paper ，we screened marketed Chinese patent medicines by Sirius Red staining method using collagen deposition models of human 鄄derived lung fibroblasts and murine 鄄derived fibroblasts.[Results]A few marketed medicines with significant inhibition in collagen deposition both in embryonic fibroblast of mice and human fibroblasts models were screened out.[Conclusion]The results suggest that these marketed Chinese patent medicines are expected to have more promising clinical applications ，and provide the basis for drug selection for the later COVID 鄄19rehabilitation treatment.
Keywords ：Chinese patent medicine ；fibroblasts ；collagen deposition ；COVID 鄄19
天津中医药大学校长张伯礼教授凯旋之际赋诗《归辞》
·消息·
···································
编者按：4月8日，武汉解除离汉离鄂通道管控，标志着湖北省和武汉市疫情防控斗争取得阶段性重要成果。

自1月27日随中央指导组驰援武汉以来，天津中医药大学校长张伯礼院士连续73天奋战在江城疫情防控和医疗救治第一线。

在胜利凯旋之际，回首两个多月的战“疫”经历，激动不已，感慨良多，赋诗一首，在祝愿伟大祖国山河无恙、春满华夏，英雄的武汉人民云开月明、平安康宁的同时，也表达了对家乡的思念之情。

4月16日校长张伯礼院士及团队凯旋回家！
归辞
山河春满尽滌殇，家国欢聚已无恙。

两月敢忘江城苦，十万白甲鏊战茫。

黄鹤一眺三镇秀，龟蛇两岸千里黄。

降魔迎来通衢日，班师辞去今归乡。