干细胞微生物学检测标准操作规程SOP-ZK-002

干细胞微生物学检测标准操作规程（SOP）
赛托森生物科技发展
质量管理
干细胞微生物学检测标准操作规程
一、总则
1.目的：建立针对实验室干细胞微生物学标准操作程序，用以规员工的检测操作。

2.围：适用于公司部生产干细胞的微生物学检测工作
3.责任：生产部、生产车间、质量管理部、QC检验室主任、检验员对本规程的执行负责。

4.检测依据： YY/T0188.6－1995药品检验操作规程，第6部分，微生物测定法。

二、细菌检测
1.所用检测试剂耗材及仪器
1.1液体培养基：硫乙醇培养基、离心管、一次性巴斯德管
1.2琼脂培养基：胰酪胨大豆琼脂培养基、培养皿、接种环
1.3电热恒温恒湿培养箱（温度可调25℃-37℃）、超净工作台
2.操作方法
检测过程全程需在超净工作台完成，注意无菌操作。

培养基具体配制方法详见SOP/ZK/006
液体培养基：
①取培养液待恢复室温
②将待检样本及培养基过火后拧开盖子
③利用一次性巴斯德管将样本滴入培养液中1-2ml
④将加入待检样本的培养液过火后拧紧盖子
⑤坐上标记方便记录与查看结果
⑥ 37℃培养5-7天查看结果
⑦结果鉴定：培养液浑浊为细菌污染，清澈则为未污染。

⑧做好结果记录并填写质量报告
琼脂培养基：
①取培养皿待恢复室温
②将待检样本过火后拧开盖子
③利用一次接种环将样本接种于培养液皿中
④坐上标记方便记录与查看结果
⑤将培养皿倒扣置培养箱中
⑥ 37℃培养3-5天查看结果
⑦结果鉴定：培养皿上有否出现可疑菌落，如有则为细菌污染，若培养至第5天未见可疑菌落，则未污染
⑧做好结果记录并填写质量报告
三、真菌检测
1.所用检测试剂耗材及仪器
1.1液体培养基：改良马丁培养基、离心管、一次性巴斯德管
1.2琼脂培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基、培养皿、接种环
1.3电热恒温恒湿培养箱（温度可调25℃-37℃）、超净工作台
2.操作方法
检测过程全程需在超净工作台完成，注意无菌操作。

培养基具体配制方法详见SOP/ZK/006
液体培养基：
①取培养液待恢复室温
②将待检样本及培养基过火后拧开盖子
③利用一次性巴斯德管将样本滴入培养液中1-2ml
④将加入待检样本的培养液过火后拧紧盖子
⑤坐上标记方便记录与查看结果
⑥ 26℃培养5-7天查看结果
⑦结果鉴定：培养液浑浊为真菌菌污染，清澈则为未污染。

⑧做好结果记录并填写质量报告
琼脂培养基：
①取培养皿待恢复室温
②将待检样本过火后拧开盖子
③利用一次接种环将样本接种于培养液皿中
④坐上标记方便记录与查看结果
⑤将培养皿倒扣置培养箱中
⑥ 26℃培养3-5天查看结果
⑦结果鉴定：培养皿上有否出现可疑菌落，如有则为细菌污染，若培养至第5天未见可疑菌落，则未污染
⑧做好结果记录并填写质量报告
四、支原体检测
支原体快速法：
①所有操作均在室温（22-28℃）下进行
②打开检测板，在孔中加入40 μL Reaction Buffe A
③第一个孔加入10 μL阴性对照，其他孔加入10 μL待测样品或阳性对照
④轻轻混匀，室温孵育5分钟
⑤所有孔中均加入40 μL Reaction Buffe B
⑥轻轻混匀，室温孵育4分钟
⑦每孔加入5μL Stop Solution，轻轻混匀
⑧可在30分钟观察样品颜色的变化或进行拍照保存：
结果分析
如果待测样品的颜色深于阴性对照，表明样品被支原体污染
如果待测样品的颜色与阴性对照相同，表明样品没有支原体污染
⑨做好结果记录并填写质量报告
支原体ELISA法：
①编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照 2 孔、阳性对照 2 孔、空白对照 1 孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）
②加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50µl。

然后在待测样品孔先加样品稀释液40µl，然后再加待测样品10µl。

加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀
③温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟
④配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用
⑤洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干
⑥加酶：每孔加入酶标试剂50µl，空白孔除外
⑦温育：操作同 3
⑧洗涤：操作同 5
⑨显色：每孔先加入显色剂A50µl，再加入显色剂B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分钟
⑩终止：每孔加终止液50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）
测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。

测定应在加终止液后 15 分钟以进行。