翘嘴鳜快肌和慢肌糖代谢相关基因的表达分析

翘嘴鳜快肌和慢肌糖代谢相关基因的表达分析
李泓江;刘婉;刘大志;钟艺文;谭进;刘小燕
【摘要】采用荧光定量PCR技术,检测翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)快肌和慢肌中与糖代谢相关的16个基因的表达情况,并比较其表达差异性,分析翘嘴鳜肌肉糖代谢调控特点.结果显示:在快肌和慢肌中,与葡萄糖摄取和磷酸化相关的基因存在显著性差异表达的各有4个;与糖原代谢相关的基因有显著性差异表达的有2个;PI3K、MAPK5、MAPK63个基因在快肌中的相对表达量极显著高于在慢肌中的,表明与这3个基因相关的葡萄糖的摄取和利用快肌强于慢肌;而MEF2α、PGC-1α、PGC-1β、PDK1、MAPK4、GYS1、GSK3β7个基因在慢肌中的相对表达量显著高于快肌,表明与这7个基因相关的葡萄糖的摄取和利用慢肌强于快肌.
【期刊名称】《湖南农业大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2019(045)001
【总页数】4页(P78-81)
【关键词】翘嘴鳜;快肌;慢肌;糖代谢;基因表达
【作者】李泓江;刘婉;刘大志;钟艺文;谭进;刘小燕
【作者单位】湖南农业大学动物科学技术学院,湖南长沙 410128;湖南农业大学动物科学技术学院,湖南长沙 410128;湖南省桃江县农业局,湖南益阳 413400;长沙学院生物与环境工程学院,湖南长沙 410003;湖南农业大学动物科学技术学院,湖南长沙 410128;湖南农业大学动物科学技术学院,湖南长沙 410128
【正文语种】中文
【中图分类】S917.4
葡萄糖的代谢主要为机体提供能量，在机体正常的生长和发育过程中糖代谢的反应是必不可少的。

肌肉组织作为葡萄糖摄取的主要部位，同时也是糖代谢的重要组织，对维持机体血糖平衡起着至关重要的作用[1]。

在营养研究领域中，鱼类对糖的利
用和调控成为当前的热点问题。

在葡萄糖摄取、转运过程中，参与因子主要有肌细胞增强因子2(MEF2)、激活因
子1α(PGC–1α)、激活因子1β(PGC–1β)[2]、蛋白激酶B(AKT1)、磷脂酰肌醇
3(PI3K)等。

进入细胞内的葡萄糖先被磷酸化生成6–磷酸葡萄糖(G6PC)，己糖激
酶(HK)、丝裂原活化蛋白激酶因子(MAPK)、PDK1与3，4，5–三磷酸磷脂酰肌
醇一起激活相邻的AKT分子，促进对葡萄糖的利用。

葡萄糖磷酸变位酶(PGM)既
参与糖原合成，也参与糖原分解，糖原合成酶1(GYS1)是骨骼肌合成糖原的限速酶，糖原合成激酶3(GSK3)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，调控糖原合成酶(GS)
的活性，共同参与糖原的代谢。

翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)是一种名贵经济食用鱼，生长速度快，肉质细嫩，口感鲜美，营养价值丰富，蛋白质含量较高[3]；也是水产市场的紧俏产品和水产养殖
业中的重要养殖品种之一。

本研究中，通过分析翘嘴鳜快肌和慢肌中与糖代谢相关基因的表达差异，了解其肌肉糖代谢的水平和机制，旨在为解鱼类机体能量代谢提供依据。

试验用鱼取自湖南省常德市兴达鳜鱼养殖场。

取体质量约500 g的健康成体翘嘴
鳜6尾，分别解剖获取快肌和慢肌组织样本，装在2 mL冻存管，置于液氮中带回实验室，–80 ℃冰箱保存，备用。

利用Trizol试剂提取翘嘴鳜快肌和慢肌的总RNA；利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性；用超微量分光光度计检测RNA样品的纯度及浓度，提取的总RNA样品
的OD260 nm/OD280 nm为1.8~2.0，OD260 nm/OD280 nm为2.0~2.2。

按PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反转
录试剂盒说明书，将快肌和慢肌组织的总RNA进行去基因组DNA及反转录成cDNA。

获得的cDNA用无菌水稀释10倍，置于–40 ℃冰箱保存，备用。

根据杨丽萍等[4]筛选出的16个相对表达量较高的基因，设计荧光定量引物(表1)。

利用实时荧光定量PCR的内参基因RPL–13对数据进行矫正。

按SYBR Premix
Ex TaqTM I(Perfect Real Time)试剂盒说明书，进行实时定量PCR反应。

运用Bio–Rad CFX Manager将数据导出至Excel 2007后进行初步处理，按照
2–ΔΔCt计算目的基因的表达量[5]；运用SPSS 16.0对所得表达丰度数据进行单
因素方差分析(One–Way ANOVA)；用最小显著差数法(LSD)进行多重比较；用Graphpad prism对各组数据进行处理并作图，标注具有差异性的基因。

如图1所示，与葡萄糖摄取相关的5个基因中，MEF2α、PI3K、PGC–1α、PGC–1β在快肌和慢肌中表达量的差异有统计学意义(P<0.05)，其中PI3K、PGC–1α和PGC–1β 3个基因在快肌和慢肌中的差异极显著(P<0.01)；MEF2α、PGC–1α和PGC–1β在慢肌中的表达量高于快肌；AKT1在快肌和慢肌中表达的差异无统计学意义。

如图2所示，与葡萄糖磷酸化相关的基因中，PDK1、MAPK4、MAPK5、
MAPK6在快肌和慢肌中表达量的差异有统计学意义(P<0.01)；其中PDK1、MAPK4在慢肌中的表达量高于快肌，而MAPK5和MAPK6在快肌中的表达量高于慢肌；HK1和G6PC在快肌和慢肌中表达量的差异无统计学意义。

如图3所示，与糖原代谢相关的基因中，GYS1和GSK3β在快肌和慢肌中表达量
的差异有统计学意义(P<0.05)，其中GSK3β的差异极显著(P<0.01)；GYS1和GSK3β在慢肌中的表达量高于快肌；PGM1、GYG1和GS在快肌和慢肌中表达
量的差异无统计学意义。

在快肌和慢肌组织与葡萄糖摄取相关的基因中，PGC–1α是一类能重塑肌纤维类
型的重要因子，它参与了葡萄糖摄取、肝脏糖异生、线粒体生成、肌肉类型转换等多种代谢过程[6–7]。

有研究[8–9]发现，在草鱼肝胰脏、肾脏、肌肉、心脏等10
个组织中均可以检测到PGC–1α的表达，PGC–1α和PGC–1β属于PGC–1调控
因子，在各器官广泛表达且发挥不同的作用。

蛋白激酶B(AKT1)与多条细胞信号
通路有重要的关系，其中PI3K/AKT信号通路是摄取葡萄糖的主要途径[10–11]。

研究[12]发现，AKT1在肝脏、皮肤、肌肉和心脏等组织中均有表达，其中在肝脏和皮肤中的表达量显著高于其他组织，而其他组织之间的表达量的差异无统计学意义。

MEF2α参与葡萄糖转运，在鱼类肌肉中存在较高表达[13]。

本研究中，
MEF2α和PGC–1α在翘嘴鳜的慢肌中表达量高于快肌，验证了PGC–1α和
MEF2α之间相互作用，共同促进肌肉葡萄糖的摄取。

进入细胞内的葡萄糖先被磷酸化生成6–磷酸葡萄糖(G6PC)，这是由HK催化的活化葡萄糖过程，肌肉中HK的活性受到G6PC的强烈反馈抑制，HK和G6PC相互作用，促进葡萄糖磷酸化的发生。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)对于细胞周期的运行和基因表达具有重要调控作用。

研究[14]发现，通过阻断下游的MAPK可以更
彻底更有效的治疗糖尿病并发症。

本研究中，MAPK4、MAPK5和MAPK6在翘
嘴鳜快肌和慢肌中存在差异表达，表明翘嘴鳜快肌和慢肌糖代谢过程具有差异。

PDK1是PI3K激酶的下游分子，在PI3K/AKT信号通路中，与3,4,5–三磷酸磷脂
酰肌醇一起激活相邻的AKT分子，启动PI3K/AKT信号通路，促进对葡萄糖的摄
取和利用。

本研究中，PDK1基因在慢肌中的表达显著高于快肌，预示着翘嘴鳜慢肌对葡萄糖的摄取和利用强于快肌。

研究[15–16]发现，鱼类在摄食或者注射葡萄糖之后，会表现出持续较高的肝糖原水平，而肌糖原的变化却不显著，在罗非鱼[17]和虹鳟[18]中也有相似的研究结果。

在对草鱼[19]、异育银鲫[20]和金头鲷[21]等鱼类的糖耐量研究中发现，鱼的肝糖
原显著下降，预示着糖原的蓄积在不同鱼类具有不同的特征。

本研究中，GYS1和
GSK3β这2种与糖原合成相关的基因在慢肌中的表达都高于快肌。

由于翘嘴鳜慢
肌糖原含量高于快肌，本研究结果证明慢肌在翘嘴鳜糖原储存和代谢中起着重要的作用。

葡萄糖磷酸变位酶(PGM)通过促进6–磷酸葡萄糖转变为1–磷酸葡萄糖而促进糖原合成。

本研究结果表明，PGM在翘嘴鳜慢肌和快肌中表达量的差异无统计学意义，预示着翘嘴鳜肌肉糖原合成代谢与其他鱼类具有一定差异性，其具体原因，有待进一步研究。

【相关文献】
[1] 查爱云，孙子林．糖代谢与骨骼肌的关系[J]．国际内分泌代谢杂志，2009，29(2)：104–106．
[2] MOSS F P，LEBLOND C P．Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats [J]．The Anatomical Record：Advances in Integrative Anatomy & Evolutionary Biology，1971，170(4)：421–435．
[3] 成嘉，褚武英，张建社．鱼类肌肉组织发生和分化相关基因的研究进展[J]．生命科学研究，2010，14(4)：355–362．
[4] 杨丽萍，秦超彬，郑文佳，等．鱼类的葡萄糖感知与糖代谢调节研究进展[J]．水产学报，2014，38(9)：1639–1649．
[5] 张驰宇，徐顺高，黄新祥．一种新颖简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法的建立[J]．生
物化学与生物物理进展，2005，32(9)：883–888．
[6] CHU W，CHENG J，ZHU X，et al．Identification and characterization of
follistatin-related protein-1 involved in the regulation of chinese perch skeletal muscle hyperplasia[J]．Current Molecular Medicine，2016，16(6)：596–604．
[7] CHU W Y，ZHANG F L，SONG R，et al．Proteomic and microRNA transcriptome analysis revealed the microRNA- SmyD1 network regulation in skeletal muscle fibers performance of Chinese perch[J]. Scientific Reports，2017，7：16498．
[8] 刘品．草鱼PGC–1α基因的克隆及其表达的研究[D]．杨凌：西北农林科技大学，2011．
[9] 吉红，刘品，李杰，等．草鱼PGC–1α基因的表达及饲喂n–3 HUFAs对其影响[J]．水产
学报，2010，34(9)：1327–1334．
[10] 牛国梁，张树友．PI3K/AKT信号传导通路与肿瘤[J]．现代生物医学进展，2010，10(20)：3994–3996，3990．
[11] FRANKE T F，HORNIK C P，SEGEV L，et al. PI3K/AKT and apoptosis：size
matters[J]．Oncogene，2003，22(56)：8983–8998．
[12] PLAS D R，TALAPATRA S，EDINGER A L，et al．Akt and Bcl-xL promote growth factor-independent survival through distinct effects on mitochondrial physiology[J]. Journal of Biological Chemistry，2001，276：12041– 12048．
[13] 易潭．黄鳝MEF2基因家族克隆及其表达分析[D]．长沙：湖南农业大学，2015．
[14] AWAZU M，ISHIKURA K，HIDA M，et al. Mechanisms of mitogen-activated protein kinase activation in experimental diabetes[J]．Journal of the American Society of Nephrology，1999，10(4)：738–745．
[15] WILSON R P．Utilization of dietary carbohydrate by fish [J]．Aquaculture，1994，124：67–80．
[16] HEMRE G I，MOMMSEN T P，KROGDAHL A. Carbohydrates in fish nutrition：effects on growth，glucose metabolism and hepatic enzymes[J]．Aquaculture Nutrition，2002，8(3)：175–194．
[17] 刘含亮，孙敏敏，王红卫，等．注射葡萄糖对吉富罗非鱼血浆生化指标、胰岛素和糖酵解关键酶的影响[J]．中国水产科学，2012，19(5)：813–820．
[18] BAÑOS N，BARÓ J，CASTEJÓN C，et al．Influence of high carbohydrate enriched diets on plasma insulin levels and insulin and IGF-1 receptors in trout[J]．Regulatory Peptides，1998，77(1/3)：55–62．
[19] 赵万鹏，刘永坚，潘庆，等．草鱼摄食后血糖和肝糖原质量分数的变化[J]．中山大学学报(自然科学版)，2002，41(3)：64–67．
[20] 蔡春芳，刘影，陈立侨，等．异育银鲫口服不同剂量葡萄糖后的代谢反应[J]．水生生物学报，2003，27(6)：602–606．
[21] PERES H，GONCALVES P，OLIVA-TELES A．Glucose tolerance in gilthead seabream(Sparusaurata) and European seabass(Dicentrarchuslabrax)[J]. Aquaculture, 1999，179(1/4)：415–423．。