提高二倍体马铃薯原始栽培种原生质体分离与分裂频率的研究

提高二倍体马铃薯原始栽培种原生质体分离与分裂频率的研究陈鹏;刘卫卫;魏彩霞;王清
【摘要】为获得较高的原生质体分离和分裂频率,试验以马铃薯二倍体原始栽培种‘47-33’‘5-19’试管苗叶片为材料,进行了原生质体游离和培养的研究.结果表明：培养21 d 的两品系试管苗叶片均在含有2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.25%离析酶,渗透压为0.35 mol/L 的酶解液中解离效果最好,原生质体产量分别为
2.31×106个/gFW和2.52×106个/gFW；在28℃酶解温度条件下缓慢摇动14 h 或1 h静置+13 h缓慢摇动的,可促进叶片原生质体的大量释放.此外,1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 2,4-D+0.4 mg/L BAP外源激素组合有利于叶片原生质体的分裂,‘47-33’‘5-19’原生质体一次分裂频率分别达到8.85%和12.56%.在0.35 mol/L渗透压的液体培养基中,‘47-33’叶片原生质体分裂更早,分裂频率达1
3.85%.研究获得了稳定的原生质体分离体系以及较好的原生质体培养条件,为马铃薯二倍体原始栽培种的体细胞融合奠定了基础.%The potato leaves from 2 kinds of diploid original cultivar ‘47-33’and ‘5-19’were used to study protoplast isolation and division.The optimum combination of enzymes to separate protoplast from 21 d cultured leaves was 2.0% cellulase+0.5% pectinase+0.25% macerozyme.The optimum osmotic pressure was 0.35 mol/L.Under the condition of the above,the protoplast yields of ‘47-33’and ‘5-19’ were 2.52×106/gFW and 2.31 ×106/gFW respectively.The release of leaf protoplasts was significantly promoted by shaking samples for 13 h after 1 h stand or by shaking samples continuously for 14 h,both at 28 ℃ condition.In addition,exogenous hormone combination of 1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 2,4-D+0.4 mg/L BAP
obviously enhanced the division of protoplast.The first division frequencies of protoplast from‘47-33’and ‘5-19’were up to 12.56% and 8.85% respectively.Furthermore,the division of protoplast of‘47-33’was earlier in the liquid medium with 0.35 mol/L osmotic pressure than solid or solid and liquid medium with same osmotic pressure.The division frequency reached to 13.85%.With this study,we ob-tained a stable protoplast isolation system and a reliable protoplast cultivation condition,which would be very useful to somatic cell fusion of potato original cultivar.
【期刊名称】《甘肃农业大学学报》
【年(卷),期】2014(000)005
【总页数】8页(P80-87)
【关键词】二倍体马铃薯;原始栽培种;分离;分裂
【作者】陈鹏;刘卫卫;魏彩霞;王清
【作者单位】甘肃农业大学作物遗传改良和种质创新重点实验室，甘肃兰州730070; 甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730070;甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730070;甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州730070;甘肃农业大学作物遗传改良和种质创新重点实验室，甘肃兰州 730070; 甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730070
【正文语种】中文
【中图分类】S532
作为我国主要粮菜兼用型作物的马铃薯，有关其耐晚疫病、耐病毒、早熟性、丰产性等性状的选育一直备受关注.近20a来，马铃薯的育种速度越来越慢，原因是可
供育种材料的匮乏及现有育种材料遗传背景的狭窄，导致很难选育出具有特异性状，并适合于当前育种目标的新品种.
自然界中，存在着不同倍性的马铃薯种质资源，在二倍体资源中包括了绝大多数的原始栽培种和野生种，是马铃薯抗病、抗虫、耐不良环境条件和其他专用型品种选育的重要基因库［1］.然而，生产上应用的普通马铃薯基本为四倍体，与野生种或原始栽培种倍性的不同而导致其杂交不亲和，难以直接利用丰富的种质资源选育高产、优质、专用型的新品种［2］.
通过细胞工程体细胞融合技术可以克服马铃薯野生种、原始栽培种与普通栽培种间由于倍性差异引起的生殖障碍，将野生种、原始栽培种的优势基因引入普通栽培种以改善相关性状.马铃薯原生质体分离及培养是利用细胞融合技术进行育种的限制
瓶颈，在过去的研究报道中，涉及到基因型、酶解液配方、渗透压及解离温度等各种影响原生质体分离的因素［2－4］，在原生质体培养研究中，也有关于培养方式、培养基类型和培养基激素配比对促进原生质体分裂的报道［3－5］.然而，所
用基因型材料的不同，往往导致原生质体解离和培养结果的大相径庭［6－9］.故
本试验通过对影响原生质体分离以及原生质体分裂的诸多因素进行研究，旨在获得一种稳定的，适合于二倍体马铃薯原始栽培种试管苗叶片的原生质体分离体系和培养体系，为下一步原始栽培种间及与双单倍体间的体细胞杂交奠定基础.
1 材料与方法
1.1 材料
二倍体马铃薯原始栽培种‘47－33NDK 15－33’‘5－19NDK 33－38’（以下简称‘47－33’‘5－19’）的块茎由内蒙古农业大学引进，将块茎经无菌处理
后培养为试管苗，通过单节切段于不含任何激素的MS培养基中继代培养.试验材
料每隔25d左右继代1次，并于25℃、2 000lx光照条件下进行16h／8h光照及黑暗交替培养，当试管苗生长到18～30d时，进行原生质体的分离及培养.
1.2 马铃薯叶片原生质体的分离
取培养21d的试管苗上部叶片1g，于超净工作台中剪碎后放入10mL酶解液中.
酶解液成分：纤维素酶 R－10（Worthington）、果胶酶（BBI）、离析酶 R－10（Yakult）、3mmol／L MES（2－（N－吗啉）乙磺酸）、2%PVP（聚乙烯吡
咯烷酮）、0.2%牛血清白蛋白、0.35mol／L蔗糖.将含有叶片的酶解液置于28℃，40r／min的恒温摇床中黑暗解离，解离期间利用数码显微镜（AE31）观察叶片
的解离状况和原生质体的状态.解离完成后利用XB－K－25型血球计数器计数并计算原生质体的产量.
纤维素酶采用3个水平（1.0%、1.5%、2.0%），离析酶采用2个水平（0，
0.25%），果胶酶采用2个水平（0.5%，0.75%）.参照以往马铃薯叶片原生质体
分离的解离酶配比进行斟酌、筛选及补充，共设立6种解离酶组合，分别为：
①1.0%纤维素酶＋0.25%离析酶＋0.5%果胶酶；②1.5%纤维素酶＋0.25%离析酶＋0.5%果胶酶；③1.5%纤维素酶＋0.25%离析酶＋0.75%果胶酶；④1.5%纤维素酶＋0%离析酶＋0.5%果胶酶；⑤2.0%纤维素酶＋0.25%离析酶＋0.5%果胶酶；
⑥2.0%纤维素酶＋0.25%离析酶＋0.75%果胶酶.将含有叶片的6种酶解液置于28℃，40r／min的恒温摇床中黑暗解离14h后，统计原生质体的产量，并观察
其状态.
在1.5%纤维素酶＋0.5%果胶酶＋0.25%离析酶酶解液组合基础上，调整酶解液渗透压为0.30、0.35、0.40、0.45mol／L，观察不同渗透压对叶片原生质体解离的效果.
在1.5%纤维素酶＋0.5%果胶酶＋0.25%离析酶，0.35mol／L渗透压的酶解液基
础上，将含有叶片的酶解液于24、26、28、30、32℃5个温度水平，40r／min
摇床转数下解离14h，统计原生质体的产量，并观察其状态.
在1.5%纤维素酶＋0.5%果胶酶，0.35mol／L渗透压的酶解液基础上，采用摇动（40r／min）、静置、先静置后摇动（40r／min）3种解离方式进行叶片原生质体解离.前两种解离方式在叶片解离6h后每隔2h检测原生质体的产量；后一种解离方式在13h的静置解离后再摇动解离1h，以及先静置解离1h后摇动13h，统计原生质体的数量并计算其产量.
将生长18、21、24、27、30d的试管苗上部叶片剪碎后放入1.5%纤维素酶＋0.5%果胶酶＋0.25%离析酶，渗透压0.35mol／L的酶解液中，于28℃、40r／min的恒温摇床中黑暗解离14情况h后统计原生质体数量并观察其状态.
1.3 原生质体的培养
酶解液经300目筛网过滤于15mL离心管中，于800r／min离心6min，去除
8～9mL上清液，将沉淀混匀后缓缓加入到8～9mL高浓度蔗糖（0.55 mol／L）的离心管中，600r／min离心5min.用移液枪将漂在高浓度蔗糖溶液表层的原生
质体吸出，MPS再次悬浮［10］，于800r／min离心6min，重复2次，沉淀物为纯化的原生质体.
将包埋原生质体的海藻酸钠薄层划分为4份，分别置于4种外源激素组合的CM
－1液体培养基［11］中，于（22±1）℃下黑暗培养，以探讨外源激素对原生质体分裂的影响.4种外源激素组合分别为：①1.0mg／L NAA＋0.5mg／L 2，4－D ＋0.4mg／L BAP；②1.0mg／L NAA＋0.5mg／L 2，4－D＋0.4 mg／L BAP＋
0.5mg／L ZT；③1.0mg／L NAA＋0.5mg／L 2，4－D＋0.5mg／L ZT；
④0.5mg／L 2，4－D＋0.5mg／L ZT.
调整‘47－33’原生质体的终密度为2×105个／mL左右，于液体、固体及固液
双层培养基（海藻酸钠薄层法）中进行培养.3种培养方式均采用CM－1培养基，并于（22±1）℃下黑暗培养.海藻酸钠薄层制作采用Borgato等［12］的方法，
固体培养采用梅兴国等［13］的方法.
将‘47－33’叶片原生质体以2×105个／mL密度分别接入CM－1＋1.0mg／L NAA＋0.5mg／L 2，4－D＋0.4mg／L BAP的液体培养基中，利用蔗糖调节液体培养基渗透压为0.25、0.35、0.45mol／L，调查渗透压对原生质体培养的影响.
通过Motic AE31型数码显微镜观察以上试验中原生质体的培养状态，每次观察至少10个视野，记载并计算原生质体第一、二次分裂的时间及分裂频率.
原生质体分裂频率（%）＝（每个视野中分裂的原生质体数／视野中原生质体总数）×100%
2 结果与分析
2.1 马铃薯原始栽培种叶片原生质体的分离
2.1.1 解离酶对原生质体分离的影响 1.0%的纤维素酶对二倍体马铃薯原始栽培种
叶片细胞的解壁效果并不理想，原生质体产量低，状态差且未解离的组织块多（表1）.随着纤维素酶浓度的增加，原生质体产量逐渐提高，并于2%时达到高峰，两个供试品系‘5－19’‘47－33’分别为2.31×106和2.52×106（表1）.此时，显微镜下几乎观察不到未解离的组织，且原生质体状态极佳（图1－1）.果胶酶对原生质体产量的增进效果依赖于纤维素酶的浓度，在1.0%纤维素浓度下，0.75%
的果胶酶明显提高了叶片原生质体产量.与0.5%果胶酶浓度相比，‘5－19’‘47－33’叶片原生质体产量分别提高了22.52%和19.20%；而在2.0%纤维素酶浓
度下，果胶酶含量的升高（0.75%）反而导致叶片原生质体产量的下降和较为严重的破碎现象.与0.5%果胶酶浓度下的原生质体产量相比，‘5－19’‘47－33’分别降低了65.80%和48.02%.试验还发现，在1.5%纤维素酶及0.5%果胶酶浓度组合下，不加离析酶比加有0.25%离析酶时获得的原生质体产量和质量更高，表明
在进行二倍体原始栽培种马铃薯叶片原生质体解离时，完全可以去除价格昂贵的离析酶.综合原生质体产量、质量及原生质体破碎情况，两个品系叶片原生质体解离
较好的酶组合为2.0%纤维素酶＋0.5%果胶酶＋0.25%离析酶，考虑到解离成本及高用量的酶液对今后原生质体培养的影响，使用1.5%纤维素酶＋0.5%果胶酶的组合可以获得满意的原生质体产量并用于原生质体的培养.
表1 解离酶组合对原始栽培种马铃薯叶片原生质体分离的影响Tab.1 Effect of enzyme combination to protoplast dissociation of original cultivar potato leaf原生质体状态，＋：一般，＋＋：较好，＋＋＋：好；原生质体破碎情况，＋：破碎较轻，＋＋＋＋：破碎严重.?
2.1.2 酶解液渗透压对原生质体分离的影响渗透压的大小显著影响叶片原生质体
的产量.在0.35 mol／L渗透压的酶解液中，叶片原生质体解离的效果最好，‘5－19’和‘47－33’的原生质体产量分别为1.14×106个／g和1.23×106个／g （表2），原生质体状态极佳.0.30mol／L渗透压的酶解液同样能够获得较高的原生质体产量，但部分原生质体随着时间的推移而破碎.具有较高渗透压（0.40、
0.45 mol／L）的酶解液不利于原生质体的解离，两品系叶片原生质体产量仅为（0.45～0.51）×106个／g和（0.61～0.67）×106个／g，解离的原生质体不圆，质量状态不佳.故原始栽培种叶片原生质体解离以0.35mol／L的渗透压最为
适宜.
2.1.3 酶解温度对原生质体分离的影响解离温度对酶的作用具有明显的效应.随着
温度的升高，解离酶的效应越来越强，叶片原生质体产量逐渐增高，并于30℃下
达到峰值，此时‘5－19’‘47－33’的原生质体产量分别为1.21×106、
1.53×106个／g（表3）.随着解离温度的继续升高（32℃），两品系叶片原生质体产量急剧下降，仅为0.76×106、0.93×106个／g.尽管原生质体产量在30℃解离温度下达到顶点，但是，酶解液中的原生质体状态明显差于28℃的原生质体，
并存在大量碎片.故两品系叶片原生质体的最适解离温度为28℃.
表2 渗透压对原始栽培种马铃薯叶片原生质体分离的影响Tab.2 Effect of osmotic pressure to protoplast dissociation of original cultivar potato leaf?
2.1.4 酶解方式和酶解时间对原生质体分离的影响对比于静置酶解，缓慢摇动的酶解方式更能有效地促进叶片原生质体的释放（表4）.就整体水平而言，缓慢摇动下叶片原生质体的平均产量比静置酶解方式提高了105.88%.从酶解14h的原生质体产量看，静置1h＋缓慢摇动13h下的产量最高，分别为1.27×106个／g和1.46×106个／g，次之为缓慢摇动（1.15×106 个／g和1.31×106个／g，静置酶解最低（0.70×106个／g和0.82×106个／g）.
表3 酶解温度对叶片原生质体产量的影响Tab.3 Effect of temperature to protoplast dissociation of original cultivar potato leaf?
酶解时间同样影响原生质体的产量.随着酶解时间的延长，叶片原生质体的产量逐渐增加，缓慢摇动酶解方式于14h时达到高峰，静置酶解于16h达到高峰，此时‘5－19’‘47－33’叶片原生质体产量分别为0.84×106个／g和0.91×106个／g.
表4 酶解方式和酶解时间对叶片原生质体分离的影响Tab.4 Effect of zymolytic manner and time to protoplast dissociation of original cultivar potato leaf?
2.1.5 试管苗继代培养时间对原生质体分离的影响试管苗生理状态显著影响叶片原生质体的解离效果.随着试管苗培养时间的延长，叶片原生质体产量呈现低－高－低的变化规律，‘5－19’‘47－33’均为继代培养21d的叶片原生质体产量最高，分别为1.25×106个／g和1.28×106个／g（表5），继代24d的试管苗叶片次之.幼嫩（培养低于18d）或生理状态较老（培养超过27d）的叶片并不是原生质体分离的良好材料，尤其当试管苗继代培养超过27d时，叶片原生质体产量急剧下降，两个品系叶片原生质体仅为（0.06～0.63）×106个／g和（0.09～
0.57）×106个／g.
表5 试管苗培养时间对叶片原生质体分离的影响Tab.5 Effect of in vitro plants cultural time to protoplast dissociation of original cultivar potato leaf?
2.2 马铃薯原始栽培种叶片原生质体的分裂
2.2.1 外源激素对原生质体分裂的影响以海藻酸钠薄层法探讨外源激素对叶片原生质体分裂的影响，当原生质体培养6d时，部分原生质体体积增大且形状椭圆，8d 后少量原生质体开始分裂（表6，图1－3）.1.0mg／L NAA＋0.5mg／L 2，4－
D＋0.4 mg／LBAP的外源激素组合有利于促进‘5－19’‘47－33’原生质体的分裂，其第1次分裂频率分别为8.85%和12.56%，说明生长素促进原生质体分裂的作用强于细胞分裂素.试验设计的所有激素组合未能刺激细胞启动第2次分裂.
表6 外源激素对叶片原生质体分裂的影响Tab.6 Effect of exogenous hormone to leaf protoplast division采用CM－1培养基，渗透压0.35mol／L.?
表7 培养方式对原生质体分裂的影响Tab.7 Effect of cultural manner to leaf protoplast division培养基中含有1.0mg／L NAA，0.5mg／L 2，4－D，
0.4mg／L BAP；渗透压0.35mol／L（47－33；CM－1培养基）.?
2.2.2 培养方式对原生质体分裂的影响将纯化后的‘47－33’原生质体以2×105个／mL的密度进行固体培养、液体浅层培养和海藻酸钠薄层培养.结果表明，固体培养基中的原生质体变化缓慢，约15d后原生质体开始变大，20d后出现一次分裂，分裂频率最低，仅为1.45%（表7）；海藻酸钠薄层中的原生质体培养6d时开始膨大，8d时产生第1次分裂；液体浅层培养的原生质体状态改变最快，培养2～3d时，原生质体逐渐增大（图1－5），3～4d出现第1次分裂（图1－6），5～6d出现第2次分裂（图1－7），且一次分裂频率最高，为1
3.85%（表7）. 2.2.3 渗透压对原生质体分裂的影响将状态良好的原生质体转入渗透压为0.25、0.35和0.45 mol／L 的液体 CM－1 中培养（CM－1 中含有 1.0 mg／L
NAA，0.5mg／L 2，4－D，0.4mg／L BAP）.发现在低渗透压（0.25mol／L）
培养基中的原生质体极易破碎，培养2d后，原生质体所剩无几.在0.45 mol／L CM－1中，尽管极少有原生质体破碎现象，可培养1d后，原生质体状态不佳；
培养3d后，大部分原生质体褐化死亡.0.35mol／L渗透压既可保持良好的原生质体状态，又能防止原生质体破碎率的增加，且推迟了原生质体的褐化时间.在3种
渗透压的CM－1培养基中，只有渗透压为0.35mol／L培养基中的原生质体产生了分裂（图1－7）.
图1 马铃薯原始栽培种试管苗叶片原生质体的分离与分裂Fig.1 Protoplast dissociation and division of original cultivar potato leaf
3 讨论
酶是原生质体解离必不可少的要素，在植物原生质体解离过程中常常采用不同浓度的纤维素酶、果胶酶和离析酶组合，有时也会采用少量的半纤维素酶来促进酶解的效果［14－15］.马铃薯原生质体解离中，即便染色体倍性相同的试管苗材料，由于基因型不同，最佳酶组合及浓度也不同.李耿光等［15］对四倍体‘小叶
子’ב多子白’杂交品系和‘乌盟601’试管苗叶片解离时，采用0.7%纤维素
酶＋0.17%半纤维素酶＋0.17%果胶酶；而李世君等［16］对四倍体克新四号、
68－62普通栽培种试管苗叶片解离则在1%纤维素酶＋0.2%离析酶下进行.周宇波等［11］在对双单倍体马铃薯试管苗叶片原生质体解离时，多采用0.8%纤维素酶＋0.2%离析酶＋0.4%果胶酶；同样是双单倍体材料，戴朝曦等［7］采用子叶和
下胚轴进行原生质体分离时，发现1%纤维素酶＋0.5%离析酶的效果更好.在以往
的研究中，二倍体马铃薯叶片原生质体解离所用的纤维素酶不高于1.0%，加有少量果胶酶或离析酶就可获得足够的原生质体用于纯化、培养或融合［10－11，17］.然而，本试验中，1.0%的纤维素酶用于解离时，原生质体产量低且质量不佳，有时甚至纯化不出原生质体，此结果进一步说明同为二倍体马铃薯（野生种、
双单倍体及原始栽培种）叶片材料，由于基因型及材料状态的差异导致解离所需的酶组合与用量不同.试验中，当纤维素酶量增加到1.5%时，原生质体产量大增，继续增加到2%时，获得的原生质体产量最高.另外，针对不同基因型材料选择适宜的酶种类也很重要，戴朝曦［7－8］等采用0.5%离析酶代替果胶酶获得了良好的原生质体解离效果，而蔡兴奎［10］用等量离析酶代替果胶酶后，发现原生质体产
量下降；本试验证明，对于原始栽培种马铃薯试管苗叶片的解离，可以省去离析酶，但不可省去果胶酶，这或许是由于不同材料细胞间质果胶成分不尽相同，导致其对果胶酶和离析酶的敏感程度不同.
影响原生质体分离的另外一个因素就是酶解时间和酶解方式.查阅相关文献，似乎
都表明二倍体马铃薯叶片比四倍体普通栽培种叶片需要更长的解离时间［3，10－11］，如二倍体马铃薯解离时，周宇波、邸宏等［3，11］发现解离14～16h原
生质体产量最高，蔡兴奎［10］表明解离12～14h产量最高.本试验发现，原始栽培种试管苗叶片游离12h时，原生质体开始大量释放，14h达到高峰，16h后原
生质体破碎严重（四倍体普通栽培种试管苗叶片缓慢摇动8h可获得足量的原生质体，数据未在本文列出）.这一结果与袁华玲［17］的结果相符.研究同时发现，试验采用的二倍体原始栽培种‘47－33’‘5－19’的最佳解离条件相同.在
0.35mol／L渗透压及28℃解离温度下采用静置1h摇动解离13h（40r／min）
或直接摇动解离14h的酶解方式均可获得高产且高质的原生质体，但前者原生质
体解离的产量高于后者；或许是由于静置的1h内，果胶酶或离析酶集中作用于剪切开来的叶片组织边缘，导致胞间层疏松而利于纤维素酶对细胞壁的解离.
自从Shepard等［18］首次报道由普通栽培种‘Russet Burbank’叶肉原生质
体培养再生了完整植株，国外学者先后进行了有关四倍体杂交品系、双单倍体及野生二倍体原生质体的培养，并获得了再生植株［19－24］.到目前为止，我国仅有几例马铃薯原生质体培养再生完整植株的报道［7，11，15－16，25］，少见马
铃薯原始栽培种原生质体分离和培养的报道.原生质体的培养与再生受多种因素的
影响［18］，如培养基组分、植物激素、渗透压调节剂及原生质体密度等.当采用
了周宇波等［11］改良培养基及其激素配比（1.0 mg／L NAA＋0.4mg／L BAP）对试验获得的原生质体培养3～4d后，发现大部分原生质体褐化死亡，经过多次
试验，未能促进叶片原生质体的分裂.可见基因型不同，原生质体培养的激素水平
也不同.在此基础上，重新设计了外源激素配比，进行了渗透压及培养方式的调整，刺激马铃薯原始栽培种叶片原生质体进行了一次分裂和二次分裂，发现1.0 mg／
L NAA＋0.5mg／L 2，4－D＋0.4mg／L BAP外源激素组合可明显促进‘5－19’‘47－33’原生质体细胞壁的重建以及细胞的再分裂.然而，细胞二次分裂后，由于原生质体的大量聚集，导致其褐化死亡，未能获得小细胞团和愈伤组织，这是本试验的不足之处.在接下来的试验中，需要调整试验方案，改善这一看似细小又
非常重要的环节，防止原生质体间的聚集及褐化，并扩大供体材料基因型的选择，以建立稳定的适合于马铃薯原始栽培种叶片原生质体培养的技术体系.
参考文献
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