50ulPCR反应体系构建
标准的PCR反应体系
标准的PCR反应体系PCR的反应体积一般有：10、20、25、40、50、100μl（一般不要低于10μl，体积过少会影响扩增效率及产物得率）PCR反应体系与反应条件--------------------------------------------------------------------------------标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umolL引物各10～100mol模板DNA 01～2ugTqDNA聚合酶25ug2+ 15mmolL加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和g2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30b，常用为20b左右。
②引物扩增跨度：以200-500b为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度01～1umol或10～100mol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
PCR反应体系与反应条件
PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至100ul上述体系为100ul，实验中一般用50ul体系，即以上所有试剂减半。
也可根据Taq酶说明书上的推荐配方。
PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
A TGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
pcr反应体系的组成部分有哪些
PCR反应体系的组成部分有哪些PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增目标DNA序列。
PCR反应体系由多个关键组分组成，每个组分都扮演着重要的角色。
下面将介绍PCR反应体系的组成部分。
1. 模板DNA模板DNA是PCR反应的起点，需要扩增的目标DNA序列。
它可以是从生物样本中提取的任何DNA片段，如基因、细菌、病毒等。
PCR反应通过模板DNA的复制，扩增目标序列。
2. 引物引物是PCR反应中的两个短DNA片段，它们与目标DNA序列的两端互补。
引物的作用是提供起始点，让DNA聚合酶能够沿着目标序列合成新的DNA链。
引物的设计是PCR反应成功的关键，需要确保引物与目标序列的互补性。
3. DNA聚合酶DNA聚合酶是PCR反应中的核心酶类。
它能在适当的温度下，根据引物的互补性，在模板DNA上逐渐合成新的DNA链。
常用的DNA聚合酶是来自热液喷泉菌属（Thermus aquaticus）的热稳定酶，例如Taq聚合酶。
4. 反应缓冲液反应缓冲液是PCR反应中的重要组成部分，主要包括缓冲盐和其他稳定物质。
反应缓冲液的作用是维持反应体系的酸碱度和离子平衡，以提供适宜的环境供DNA聚合酶活性，使PCR反应能够进行顺利。
5. 镁离子镁离子（Mg2+）是DNA聚合酶活性所必需的辅助因子。
它参与到DNA链的合成过程中，稳定DNA的结构，调节酶的活性。
镁离子的浓度及其含量对PCR反应的成功与否有重要影响。
6. dNTPsdNTPs是反应体系中的四种脱氧核苷酸，分别是dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
它们是DNA合成过程中新链的构建单位。
在PCR反应中，dNTPs提供所需的碱基单元，供DNA聚合酶逐渐合成新的DNA链。
综上所述，PCR反应体系的组成部分包括模板DNA、引物、DNA聚合酶、反应缓冲液、镁离子和dNTPs。
这些组成部分相互配合，共同推动PCR反应的进行，实现对目标DNA序列的扩增，为分子生物学研究和应用提供了强有力的工具。
PCR反应体系和反应条件
PCR反应体系和反应条件引言聚合酶链反应（PCR，Polymerase Chain Reaction）是一种重要的分子生物学技术，在分子诊断、基因工程、遗传学研究等领域得到广泛应用。
PCR反应通过不断复制模板DNA序列，从而扩增目标DNA片段，实现了在较短时间内获取大量目标DNA的目的。
为了保证PCR反应的高效进行，合理设计PCR反应体系和精确控制反应条件非常重要。
PCR反应体系PCR反应体系主要包括模板DNA、引物、酶、核苷酸、缓冲液和水等成分。
1.模板DNA：PCR反应中的模板DNA可来源于基因组DNA、cDNA、重组DNA等。
模板DNA的质量和纯度对PCR反应的效果有重要影响，应注意避免可能的污染和降解。
2.引物：引物是一对具有互补性的短寡核苷酸序列，用于特异性识别并引导DNA合成酶在目标序列上进行DNA合成。
引物的选择应基于目标序列的特异性，合理设计引物的长度和碱基组成。
3.酶：PCR反应中常用的酶是热稳定DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶。
热稳定酶能够耐受高温，并且在PCR反应温度条件下能够保持其适应性。
除了Taq DNA聚合酶外，还有其他一些改良型或高效型的DNA聚合酶可根据需要选择使用。
4.核苷酸：PCR反应需要提供四种核苷酸（dNTPs），即脱氧鸟苷酸、脱氧胞苷酸、脱氧胸腺嘧啶酸和脱氧胸腺鸟苷酸。
核苷酸浓度的选择应适当，过高或过低的核苷酸浓度都可能影响PCR反应的效果。
5.缓冲液：PCR反应中的缓冲液主要是为了提供适宜的酶活性和维持反应体系的酸碱平衡。
缓冲液应根据酶的工作要求选择合适的pH值，常用的缓冲液有Tris-HCl 缓冲液、HEPES缓冲液等。
6.水：水是PCR反应的稀释剂，帮助平衡体系中的各种溶液浓度，同时提供所需的反应体积。
PCR反应条件PCR反应的条件主要包括温度和周期数。
1.温度：PCR反应通常包括三个温度阶段，即变性（解旋）、退火和延伸。
变性阶段的温度一般设定在94-98°C，以使目标DNA的双链结构解开。
PCR反应体系与反应条件
PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA 0.1～2ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2。
5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
载体构建步骤
一．载体酶切线性化（TOYOBO EcoR I）1.载体pCDNA浓度0.8 ug/ul2.酶切体系（总50ul体系）pCDNA 3ul10*H Buffer 5ulddH2O 41ulEcoR I 1ul（8U/ul）3.反应条件37°C 1h 至多2h*已经试过37°C过夜，本以为会酶切充分，但是不想把条带全切成小片段了，而且电泳后是一条宽宽的泳谱*另外，多次酶切证实，所加的酶量过多在酶切一小时的情况下仍然会出现酶切过度的情况，尽可能按照说明书上的量和时间做二．取2ul稀释成5ul于1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定有无条带及大小用大凝胶回收pcDNA（按2.5：1加入SYBR Green）电泳30min准备两支EPPendorf管，调60°C水浴锅切胶称重（1.5ml EPPendorf管重约0.82g）三．OMEGA gel purification kit回收pcDNA1.平衡柱子加200ulBuffer GPS到DNA收集柱中，静置4min，12000xg*2min，加700ulDEPC处理H2O，12000xg*2min2.溶胶按1ml/kg的比例加Binding Buffer到凝胶中3.60°C水浴7mins，迅速转移至DNA收集柱中（至多700ul，超过的再转移一次），10000xg*1min，弃收集管中的液体4.加300ulBinding Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体5.加700ulwash Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体6.加350ulwash Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体7.最大转速（>13000rpm）空转2min，弃收集管8.转移收集柱至1.5mlEPPendorf管，打开盖子静置2min9.加30ulElution Buffer静置2min，最大转速1.5min，弃收集柱10.取2ul稀释成5ul点胶*所加Elution Buffer的量是根据所纯化的产物的量来判断的，如果回收产物较多可以增加其量至50ul*纯化的理论效率为70%，如果先加一次Elution Buffer 20ul，静置2min，1000xg*1min,然后再加一次Elution Buffer20ul，静置离心。
realtimePCR和RT-PCR详解及其区别要点
real-time PCR技术的原理及应用摘要：一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）实时原理 1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念：（1）扩增曲线：（2）荧光阈值：（3）Ct值：CT值的重现性：5、定量原理：理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1）确定未知样品的 C(t)值2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记：二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化:1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer 体系的优化5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定6、其他与常规PCR相同（二）应用范围1、起始模板的测定；2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
pcr构建方法
pcr构建方法PCR，全称聚合酶链式反应，这可是个超厉害的生物技术呢。
那PCR构建到底咋做呀？咱先来说说它需要的东西。
得有模板DNA，这就像是盖房子的地基一样重要呢。
然后就是引物啦，引物就像是小向导，能带着后面的东西准确地找到要复制的地方。
还有Taq聚合酶，这个酶就像是勤劳的小工匠，专门负责把一个个的核苷酸连接起来，让DNA链不断地延长。
另外，还需要dNTP，这是构建新DNA链的原料，就像盖房子的砖头一样。
在做PCR构建的时候，第一步就是把这些东西都放到一个小管子里，这个小管子就像是一个小小的反应天地。
然后把这个小管子放到PCR仪里面。
PCR仪就像是一个魔法小盒子，它可以设定不同的温度，来控制整个反应过程。
PCR的反应过程有三步，就像一场有趣的小循环。
第一步是变性，这时候温度会变得比较高，就像给DNA洗了个热水澡，让双链DNA解开变成单链，这样引物才能和单链结合呀。
然后就是退火，温度降下来一些，引物就像小磁铁一样，迅速地和单链DNA上特定的位置结合起来。
最后就是延伸啦，温度再调整到适合Taq聚合酶工作的温度，这个小工匠就开始忙起来了，沿着引物开始合成新的DNA链。
经过好多轮这样的循环，原本很少的DNA就会被大量地复制出来啦。
这就像是一变二，二变四，四变八……不停地翻倍，最后就得到了好多好多我们想要的DNA片段呢。
不过呀，做PCR构建可不能马虎哦。
每一个环节都得小心翼翼的，就像照顾小宝贝一样。
如果引物设计得不好，就可能找不到正确的地方开始复制；要是温度设置得不对，那这个小工匠Taq聚合酶可能就不好好工作啦。
但是只要掌握了这些小要点，PCR构建就不再是神秘又复杂的事情啦，就像玩一个有趣的小实验一样，充满了惊喜和乐趣呢。
pcr反应体系组成
pcr反应体系组成PCR反应体系（PolymeraseChainReaction，简称PCR）是一种具有强大功能的分子生物学技术，可用来大量复制（复制）DNA片段。
PCR反应体系通常由若干组成部分组成，其中包括DNA模板，DNA聚合酶，引物，dNTP，DNA酶，缓冲液，阳离子缓冲液和NaCl等。
管反应体系中的每种成分都有其重要性，但它们之间的相互作用决定了PCR反应的最终结果。
DNA模板是反应体系的基础，其中必须包含数据库中的待分析基因段，以及其他可能存在的基因段。
DNA模板的量是关键，可确保PCR反应体系的有效复制。
DNA聚合酶是PCR反应的核心成分，具有将dNTP连接起来的能力，从而在模板上构建一条可编码的段。
DNA聚合酶可以是特定物种的，也可以是抗菌性物质。
如果使用抗菌性物质，反应体系中的DNA 模板将会被破坏，因此，在选择DNA聚合酶时需要加以考虑。
引物是PCR反应体系中最重要的成分之一，它是用来导向酶的寡核苷酸，由核苷酸序列组成。
有两种类型的引物：第一种是用于检测特定基因的引物，第二种是用于特定段的引物。
为了有效地开展PCR，需要两个引物，一个可与模板上的特定区域结合，另一个则与模板上的另一区域结合。
dNTP（双磷酸腺苷）是DNA的建筑块，它们是四种核苷酸的混合物，其中包括腺苷，胞苷，胸腺苷和烟酸。
在PCR反应中，dNTP起着特殊的作用，它可以配对DNA模板上的核苷酸，并与其结合。
DNA酶用于分解模板上的DNA，并将其转换成具有新功能的DNA 序列，以及电泳过程中的分子移动。
一般而言，反应体系中的DNA 酶具有降解能力和酶切能力。
它们可以用来增强PCR反应的灵敏度和特异性。
缓冲液可以维持PCR反应体系中酶活性水平。
缓冲液含有一些常见的成分，如磷酸，氯化钠，氯化钾等。
缓冲液可确保在PCR反应体系中维持正确的酸碱度，并有助于降低外界因素对DNA模板的不利影响。
NaCl（普通盐）可以提高PCR反应体系的活性，使其能够有效地催化酶-DNA复合物的形成。
pcr反应体系应包含哪些成分及用量的方法
pcr反应体系应包含哪些成分及用量的方法引言聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种常用于扩增DNA片段的技术。
在PCR反应体系中，正确的成分及其用量对于反应的成功和效果至关重要。
本文将介绍PCR反应体系中应包含的成分以及其用量的方法。
PCR反应体系成分下面是PCR反应体系中应包含的主要成分：1.模板DNA（Template DNA）：PCR反应的起点DNA。
可以是基因组DNA、cDNA或任何其他含有待扩增片段的DNA。
通常情况下，将模板DNA浓度控制在1-100ng/μl之间。
2.引物（Primers）：PCR反应需要两个特异性引物，用于定位待扩增片段的起始和终止位点。
引物的长度通常在18-30个碱基对之间，浓度在0.1-1μM范围内。
3.核苷酸三磷酸（dNTPs）：PCR反应需要四种核苷酸三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP），用于DNA链的合成。
每种核苷酸的浓度应为200-400μM。
4.缓冲液（Buffer）：PCR反应需要在特定pH条件下进行，缓冲液用于调节反应体系的pH值。
常用的缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、KCl缓冲液等。
5.Mg2+离子：Mg2+离子是DNA聚合酶的必需辅因子，用于维持DNA聚合酶的活性。
通常在反应体系中的Mg2+浓度为1-2.5mM。
6.DNA聚合酶（DNA Polymerase）：PCR反应需要一种高度稳定和高效的DNA聚合酶。
常用的聚合酶包括Taq聚合酶、Pfu聚合酶等。
聚合酶的用量需要根据不同品牌和反应体系进行调整。
除了以上主要成分外，还可以添加一些辅助成分来提高PCR反应的效果，例如：•BSA（Bovine Serum Albumin）：在特定情况下，BSA可以提高PCR反应的特异性和扩增效率。
通常的BSA浓度为0.1-1mg/ml。
•DMSO（Dimethyl Sulfoxide）：DMSO可以降低DNA的熔解温度，使PCR反应在高GC含量的区域更加稳定。
pcr反应体系的组成
pcr反应体系的组成
PCR反应体系主要由寡核苷酸（引物）、4种dNTP、Taq DNA聚合酶、靶序列DNA和PCR 反应缓冲液体系组成。
PCR反应首先需要一对引物，根据待扩增区域两端已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸引物，这一单链引物的序列将决定扩增片段特异性和长度。
PCR反应体系还包括dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）、DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必需的离子强度等。
在加热变性，使基因组双链DNA变性为单链后，通过降低温度使特异引物与互补的DNA序列特异结合（退火或复性）后，在耐热聚合酶作用下，以基因组单链DNA 为模板，从引物端开始按方向合成DNA（延伸）。
通过高温变性、低温复性和中温延伸三个阶段的一次循环，DNA的量即可以增加1倍，则30次循环后，DNA的量增加230倍。
PCR反应条件体系总结
PCR反应条件体系总结PCR技术概论聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。
过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。
PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
PCR技术简史PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于197 1年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。
PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mull is等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。
其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA 变性、复性及延伸的温度与时间。
PCR的改进与完善Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。
②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。
此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在D NA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。
这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。
标准的PCR反应体系
标准的PCR反应体系PCR反应体系与反应条件--------------------------------------------------------------------------------标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umolL引物各10～100mol模板DNA 01～2ugTqDNA聚合酶25ug2+ 15mmolL加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和g2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30b，常用为20b左右。
②引物扩增跨度：以200-500b为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度01～1umol或10～100mol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种TqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
载体构建步骤
载体构建步骤一．载体酶切线性化（TOYOBO EcoR I）1.载体pCDNA浓度0.8 ug/ul2.酶切体系（总50ul体系）pCDNA 3ul10*H Buffer 5ulddH2O 41ulEcoR I 1ul（8U/ul）3.反应条件37°C 1h 至多2h*已经试过37°C过夜，本以为会酶切充分，但是不想把条带全切成小片段了，而且电泳后是一条宽宽的泳谱*另外，多次酶切证实，所加的酶量过多在酶切一小时的情况下仍然会出现酶切过度的情况，尽可能按照说明书上的量和时间做二．取2ul稀释成5ul于1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定有无条带及大小用大凝胶回收pcDNA（按2.5：1加入SYBR Green）电泳30min 准备两支EPPendorf管，调60°C水浴锅切胶称重（1.5ml EPPendorf管重约0.82g）三．OMEGA gel purification kit回收pcDNA1.平衡柱子加200ulBuffer GPS到DNA收集柱中，静置4min，12000xg*2min，加700ulDEPC处理H2O，12000xg*2min2.溶胶按1ml/kg的比例加Binding Buffer到凝胶中3.60°C水浴7mins，迅速转移至DNA收集柱中（至多700ul，超过的再转移一次），10000xg*1min，弃收集管中的液体4.加300ulBinding Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体5.加700ulwash Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体6.加350ulwash Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体7.最大转速（>13000rpm）空转2min，弃收集管8.转移收集柱至1.5mlEPPendorf管，打开盖子静置2min9.加30ulElution Buffer静置2min，最大转速1.5min，弃收集柱10.取2ul稀释成5ul点胶*所加Elution Buffer的量是根据所纯化的产物的量来判断的，如果回收产物较多可以增加其量至50ul*纯化的理论效率为70%，如果先加一次Elution Buffer 20ul，静置2min，1000xg*1min,然后再加一次Elution Buffer20ul，静置离心。
Pfu DNA Polymerase使用说明书
Pfu DNA Polymerase使用说明书产品编号：F SL2630-500u（5u/ul）保存温度：-20℃产品内容：Components FSL2630-500u Pfu DNA Polymerase（5u/ul）100ul10×Pfu DNA Polymerase Buffer1ml 10×Pfu DNA Polymerase Buffer(含染料)1ml说明书1份注意：两种Buffer任选产品说明：该酶在75℃时可进行DNA复制，Pfu DNA聚合酶在镁存在的条件下可催化核苷酸沿5’→3’方向发生聚合反应，形成双链DNA，Pfu DNA聚合酶具有3’→5’外切酶校正活性。
当聚合反应发生碱基错配时，聚合酶的校正活性可将错配的碱基切除。
本产品在所有热稳定性聚合酶中Pfu DNA聚合酶的错误几率最低，错误率约为1×10-6/每碱基对，缺点是PCR扩增灵敏度较Taq低。
建议Pfu DNA聚合酶用于要求保真度比较高的PCR反应，引物的延伸反应以及其它一些应用，包括克隆、DNA表达、突变分析等。
Pfu DNA聚合酶产生的PCR 产物为平端，无末端磷酸化。
若要进行“T-A”克隆，可在PCR反应完了之后，加入Taq DNA 聚合酶，于72℃反应1-2小时，以便在DNA3’端附加一个“A”。
产品来源：为重组E.coli菌株，其基因组中含有来源于Pyrococcus furiosus的Pfu DNA polymerase基因。
活性定义：在75℃条件下，30分钟内催化10nmol dNTP的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量为一个活性单位。
贮存条件：10mM Tris-HCl(pH8.2,25℃),0.1mM EDTA，1mM DTT,0.1%Tween-20,0.1%Igepal 反应条件：20mM Tris-HCl(Ph8.6,25℃),10mM KCl,16mM(NH4)2SO4,2mM MgSO4,1mg/ml BSA, 0.1%Triton X-100热失活：无质量保证：本品经PCR验证，活性测定，内切核酸酶/缺刻酶测定和SDS-PAGE纯度鉴定。