绿色荧光蛋白在蛋白质研究中的应用
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— — — — — — — — — — — 收稿日期 ： ２００６－ １０－ １９ 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目（Ｎｏ． ３０４７００４９） 作 者 简 介 ： 段 青 （１９８５—） ， 女 ， 本 科 ， Ｅ － ｍａｉｌ： ｄｕａｎ－
ｑｉｎｇ３６＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ ； 王 倩 （１９８３ — ）， 女 ， 博 士 生 ； 祁 庆 生 （１９６６—）， 男， 教授， 联系作者， Ｅ－ ｍａｉｌ： ｑｉｑｉｎｇｓｈｅｎｇ＠ｓｄｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
Ｂａｉｒｄ等［４］ 发现， 虽然 ＧＦＰ 有紧密的桶状结构 和形成发光基团所必需的复杂的翻译后修饰， 当 对 ＧＦＰ 的 Ｎ 端和 Ｃ 端部分交换重排并以一段间隔 重 新 连 接 时 ， ＧＦＰ 仍 然 具 有 荧 光 。并 且 ， ＧＦＰ 的 某些位点可以耐受整段蛋白质的插入， 在结合金 属 离 子 的 黄 色 荧 光 蛋 白（ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＹＦＰ）（ＧＦＰ 的突变体）的 １４５ 位插入锌指结构能够使 荧光强度多倍提高。Ｈｕ 等［５］ 提出了双分子荧光互 补 实 验 （ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ， ＢｉＦＣ）的概念， 用互补的荧光片段标记不同蛋白质 来研究 ｂＺＩＰ 和 Ｒｅｌ 转录因子家族的相互作用， 确 定了相互作用位置和信号传递对作用位点的调节 等， 证明了双分子荧光互补实验在蛋白质相互作
２５８５－ ２５８８
●小综述
《生命的化学》２００７ 年 ２７ 卷 １ 期 ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２００７， ２７（１）
· ４９ ·
图 １ 绿色荧光蛋白的结构及发光基团
荧 光 定 量 测 定 的 方 法 ［２］。 ２． ＧＦＰ 在蛋白质相互作用和构象变化研究中的应 用
蛋白质相互作用是生物学研究很重要的一个 方面， 采用如免疫共沉淀、化学交联、片段层析 等技术， 已经了解了许多蛋白质的相互作用以及 结构基础。但这些生化技术离体研究不能反映活 细胞内蛋白质相互作用的情况以及动力学问题。 一种活细胞内蛋白质相互作用的研究方法是蛋白 质 片 段 互 补 测 定 法 （ｐｒｏｔｅｉｎ－ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａ－ ｔｉｏｎ ａｓｓａｙ， ＰＣＡ）［３］。将 标 记 蛋 白 在 某 个 位 点 打 开 ， 用片段分别与两个靶蛋白融合。如果靶蛋白相互 作用， 则标记蛋白片段靠近并重新折叠恢复活性。
参考文献
［ １ ］ Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ ＲＪ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ， ２００５， ９（２）： １９５－ ２０１ ［ ２ ］ 卢 丽 丽 等． 糖 苷 合 成 酶 ， 生 物 化 学 与 生 物 物 理 进 展 ， ２００６，
３３（４）： ３１０－ ３２０ ［ ３ ］ Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ ＬＦ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， １９９８， １２０： ５５８３－ ５５８４ ［ ４ ］ Ｊａｈｎ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ， ２００３， ４２（３）： ３５２－ ３５４
摘 要 ： 绿 色 荧 光 蛋 白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＧＦＰ）自 发 现 以 来 ， 由 于 具 有 自 发 荧 光 等 特 性 ， 在 分 子 生 物 学 和 细 胞 生 物 学 领 域 得 到 广 泛 应 用 。 ＧＦＰ 作 为 一 种 报 道 分 子 ， 在 研 究 蛋 白 质 相 互 作 用 和 构 象 变 化 、 检 测 蛋 白 质 表 达、蛋白质和细胞荧光示踪中， 起到了重要的作用。该文通过对绿色荧光蛋白特性的分析， 介绍其作为荧光标 记在蛋白质研究中的应用， 并展望进一步的研究前景。 关键词： 绿色荧光蛋白； 荧光标记； 基因标记物； 蛋白质研究 中 图 分 类 号 ： Ｑ２９１， Ｑ５０３
· ４８ · 文章编号： １０００－ １３３６（２００７）０１－ ００４８－ ０４
《生命的化学》２００７ 年 ２７ 卷 １ 期 ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２００７， ２７（１）
●Ｍｉｎｉ Ｒｅ ｖｉｅ ｗｓ
绿色荧光蛋白在蛋白质研究中的应用
段 青 王 倩 祁庆生
（ 山 东 大 学 微 生 物 技 术 国 家 重 点 实 验 室 ， 济 南 ２５０１００ ）
［ ５ ］ Ｊａｈｎ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）， ２００４， （３）： ２７４－ ２７５ ［ ６ ］ Ｈｏｎｄａ Ｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００６， ２８１（３）： １４２６－ １４３１ ［ ７ ］ Ｖａｕｇｈａｎ ＭＤ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， ２００６， １２８（１９）： ６３００－ ６３０１ ［ ８ ］ Ｓｕｇｉｍｕｒａ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， ２００６， ７０ （５）：
用研究中的可行性。 荧光互补不仅在蛋白质相互作用中有所应用，
Ｊｅｏｎｇ 等［６］ 以 与 底 物 结 合 时 会 有 典 型 构 象 变 化 的 麦芽 糖 结 合 蛋 白 （ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＭＢＰ）为 模 型， 将 ＭＢＰ Ｃ 端和 Ｎ 端分别与 ＧＦＰ 片段融合。 结果证明加入底物的一组显示出比对照组更强的 荧 光 ， 由 此 提 出 ｓｐｌｉｔ－ ＧＦＰ 在 观 察 蛋 白 质 构 象 变 化中的应用。
２４３－ ２５１ ［１４］ Ｆｅｎｇ ＨＹ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００５， ２８０（４４）： ３７０８８－ ３７０９７ ［１５］ Ｄｉｏｎ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ， ２００１， １８（３）： ２１５－ ２２３ ［１６］ Ｄｉｏｎ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ， ２００１， １８（６）： ４５７－ ４６４ ［１７］ Ｋｉｍ ＹＷ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００４， ２７９（４１）： ４２７８７－ ４２７９３ ［１８］ Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ Ｆ ｅｔ ａｌ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２００１， ５７： ６４７－ ６５２ ［１９］ Ｇｏｙａｌ Ｋ ｅｔ ａｌ． Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ， ２００２， ４０７（１）： １２５－ １３４ ［２０］ Ｍｕｌｌｅｇｇｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ． Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ， ２００６， ４５ （１６）：
另 外 ， 重 要 的 荧 光 成 像 技 术— ——荧 光 共 振 能 量 转 移 ［ ７］ （ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ， ＦＲＥＴ）， 利 用 ＧＦＰ 及 其 突 变 体 ， 实 现 了 定 时 、 定 量、定位、无损伤地在活细胞内检测大分子构象 变 化 和 蛋 白 质 相 互 作 用 。 最 近 ， Ｐｅｄｅｌａｃｑ 等［８］ 经 过突变得到一种 ＧＦＰ 超折叠体。这种 ＧＦＰ 超折叠 体不论是在单独表达还是融合表达时都不容易产 生荧光的减弱， 将有望用于 ＦＲＥＴ 技术的改进。 ３． ＧＦＰ 在蛋白质表达中的应用 ３．１ ＧＦＰ 与 蛋 白 质 可 溶 性 表 达 利 用 大 肠 杆 菌 进行蛋白质大量表达时， 常常会造成蛋白质错误 折叠和聚集沉淀。已有的增加蛋白质可溶性表达 的方法包括： 靶蛋白与溶解性好的蛋白质融合表 达、靶蛋白与促折叠剂及伴侣蛋白共表达、低温 表达、改善培养条件等。但这些方法并不适用于 所有情况， 因为没有从本质上改变控制蛋白质折 叠和可溶性的因 素 。Ｗａｌｄｏ 等［９］ 利 用 ＧＦＰ 只 有 在 自身折叠正确的情况下才产生荧光的特性和能在 基因水平操作的优点， 将随机突变后的目的蛋白 以 Ｃ 端 同 ＧＦＰ 融 合 ， 在 大 肠 杆 菌 中 构 建 表 达 文 库。荧光筛选和 ＳＤＳ 验证表明， ＧＦＰ 的 折 叠 和 发 光基团的形成与上游蛋白质的正确折叠及可溶性 直 接 相 关 。此 后 ， Ｐｅｄｅｌａｃｑ 等［１０］ 进 一 步 利 用 ＧＦＰ 指 示 筛 选 到 可 溶 性 提 高 的 甲 基 转 移 酶 、 ＮＤＰ 激 酶 ， 并 通 过 Ｘ 光 衍 射 实 验 得 到 了 进 化 的 ＮＤＰ 激 酶 的 结 构 。ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ 等［１１］ 利 用 这 种 方 法 ， 通 过 易 错 ＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ－ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ）增 加 了 ＴＥＶ 蛋 白 酶 在 大 肠 杆 菌 中 的 可 溶 性 表 达 。 Ｋａｗａｓａｋｉ 等 ［１２］ 将 Ｔ－ ＰＣＲ（ｔａｇｇｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ ＰＣＲ）扩 增 与 ＧＦＰ 标 记 筛 选 方 法 相 结 合 ， 从 小 鼠 Ｖａｖ 蛋 白 中 克 隆 到 ４ 个可溶结构域。
针对 ＧＦＰ 折叠报告系统存在的问题， 比如在 蛋白质定向进化中， 蛋白质可能从内部隐蔽核糖 体结合位点错误起始翻Baidu Nhomakorabea而形成截短的蛋白质， 以及这种报告系统不适用于由于缓慢聚集而形成 的 不 溶 性 蛋 白 质 ， Ｃａｂａｎｔｏｕｓ 等［１３］ 在 ＧＦＰ 折 叠 报
经过环化、氧化后形成的咪唑环， 在钙离子激发 下 产 生 绿 色 荧 光 ［１］。
通 常 ， ＧＦＰ 在 完 整 并 形 成 正 确 构 象 时 能 够 产 生荧光， 这个性质使得它在蛋白质研究中具有极 其重要 的 作 用 。ＧＦＰ 被 广 泛 地 用 作 指 示 分 子 ， 通 过与靶蛋白的基因融合， 来研究蛋白质相互作 用、构象变化， 蛋白质折叠效率与可溶性， 蛋白 质 的 表 达 以 及 细 胞 定 位 等 。 作 为 报 道 分 子 ， ＧＦＰ 具有很多优点， 如实现了活细胞内基因表达和定 位、荧光为蛋白质的内在属性、荧光发射无种属 依赖性、检测时不需要附加辅助因子、具有高度 稳 定 性 等 。 另 外 ， 细 胞 内 ＧＦＰ 的 检 测 也 比 较 简 单， 如利用紫外灯、荧光显微镜、荧光激活细胞 分选仪等， 现有报道利用实时定量 ＰＣＲ 进行 ＧＦＰ
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
能 将 很 快 被 实 现 。最 近 ， 糖 苷 酶 的 突 变 酶— ——糖 苷合成酶被应用于合成糖蛋白和 鞘 糖 脂 ， ［７，２０］ 不 仅 成功地解决了长期以来糖蛋白和鞘糖脂难以合成 或合成产量低、难以大量获得的难题， 同时也扩 大了糖苷酶的应用范围。随着分子生物学技术在 糖苷酶领域的进一步应用， 糖苷酶的作用将会继 续延伸， 更多的新酶将会不断涌现， 极大地丰富 其合成的糖类及药物分子的种类， 推动糖生物学 和制药业的迅速发展。
１２１０－ １２１７ ［ ９ ］ Ｋｉｍ ＹＷ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， ２００６， １２８（７）： ２２０２－ ２２０３ ［１０］ Ｈｉｎｚ ＳＷ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ， ２００６， ９３（１）： １２２－ １３１ ［１１］ Ｈａｎｓｓｏｎ Ｔ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ， ２００１， ７３（３）： ２０３－ ２１０ ［１２］ Ｒｉｖｅｒａ ＭＨ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ， ２００３， １６（７）： ５０５－ ５１４ ［１３］ Ａｒｏｎｓｏｎ ＮＮ Ｊｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， ２００６， ７０（１）：
１． 绿色荧光蛋白 绿 色 荧 光 蛋 白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＧＦＰ）
是 荧 光 蛋 白（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＦＰ）家 族 中 常 用 的 一 种 ， 最 初 从 水 母 Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ 中 分 离 得 到 。 它能够在单独或者与其他蛋白质融合时产生荧 光， 最显著的特点是除了氧气之外， 不需要其他 辅 酶 。ＧＦＰ 由 １１ 个 β片 层 组 成 桶 状 构 成 疏 水 中 心， 由 α螺 旋 包 含 着 的 发 光 基 团 位 于 其 中（图 １）。 这 个 发 光 基 团 是 由 ３ 个 氨 基 酸（Ｓｅｒ６５、Ｔｙｒ６６、Ｇｌｙ６７）
ｑｉｎｇ３６＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ ； 王 倩 （１９８３ — ）， 女 ， 博 士 生 ； 祁 庆 生 （１９６６—）， 男， 教授， 联系作者， Ｅ－ ｍａｉｌ： ｑｉｑｉｎｇｓｈｅｎｇ＠ｓｄｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
Ｂａｉｒｄ等［４］ 发现， 虽然 ＧＦＰ 有紧密的桶状结构 和形成发光基团所必需的复杂的翻译后修饰， 当 对 ＧＦＰ 的 Ｎ 端和 Ｃ 端部分交换重排并以一段间隔 重 新 连 接 时 ， ＧＦＰ 仍 然 具 有 荧 光 。并 且 ， ＧＦＰ 的 某些位点可以耐受整段蛋白质的插入， 在结合金 属 离 子 的 黄 色 荧 光 蛋 白（ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＹＦＰ）（ＧＦＰ 的突变体）的 １４５ 位插入锌指结构能够使 荧光强度多倍提高。Ｈｕ 等［５］ 提出了双分子荧光互 补 实 验 （ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ， ＢｉＦＣ）的概念， 用互补的荧光片段标记不同蛋白质 来研究 ｂＺＩＰ 和 Ｒｅｌ 转录因子家族的相互作用， 确 定了相互作用位置和信号传递对作用位点的调节 等， 证明了双分子荧光互补实验在蛋白质相互作
２５８５－ ２５８８
●小综述
《生命的化学》２００７ 年 ２７ 卷 １ 期 ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２００７， ２７（１）
· ４９ ·
图 １ 绿色荧光蛋白的结构及发光基团
荧 光 定 量 测 定 的 方 法 ［２］。 ２． ＧＦＰ 在蛋白质相互作用和构象变化研究中的应 用
蛋白质相互作用是生物学研究很重要的一个 方面， 采用如免疫共沉淀、化学交联、片段层析 等技术， 已经了解了许多蛋白质的相互作用以及 结构基础。但这些生化技术离体研究不能反映活 细胞内蛋白质相互作用的情况以及动力学问题。 一种活细胞内蛋白质相互作用的研究方法是蛋白 质 片 段 互 补 测 定 法 （ｐｒｏｔｅｉｎ－ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａ－ ｔｉｏｎ ａｓｓａｙ， ＰＣＡ）［３］。将 标 记 蛋 白 在 某 个 位 点 打 开 ， 用片段分别与两个靶蛋白融合。如果靶蛋白相互 作用， 则标记蛋白片段靠近并重新折叠恢复活性。
参考文献
［ １ ］ Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ ＲＪ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ， ２００５， ９（２）： １９５－ ２０１ ［ ２ ］ 卢 丽 丽 等． 糖 苷 合 成 酶 ， 生 物 化 学 与 生 物 物 理 进 展 ， ２００６，
３３（４）： ３１０－ ３２０ ［ ３ ］ Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ ＬＦ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， １９９８， １２０： ５５８３－ ５５８４ ［ ４ ］ Ｊａｈｎ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ， ２００３， ４２（３）： ３５２－ ３５４
摘 要 ： 绿 色 荧 光 蛋 白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＧＦＰ）自 发 现 以 来 ， 由 于 具 有 自 发 荧 光 等 特 性 ， 在 分 子 生 物 学 和 细 胞 生 物 学 领 域 得 到 广 泛 应 用 。 ＧＦＰ 作 为 一 种 报 道 分 子 ， 在 研 究 蛋 白 质 相 互 作 用 和 构 象 变 化 、 检 测 蛋 白 质 表 达、蛋白质和细胞荧光示踪中， 起到了重要的作用。该文通过对绿色荧光蛋白特性的分析， 介绍其作为荧光标 记在蛋白质研究中的应用， 并展望进一步的研究前景。 关键词： 绿色荧光蛋白； 荧光标记； 基因标记物； 蛋白质研究 中 图 分 类 号 ： Ｑ２９１， Ｑ５０３
· ４８ · 文章编号： １０００－ １３３６（２００７）０１－ ００４８－ ０４
《生命的化学》２００７ 年 ２７ 卷 １ 期 ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２００７， ２７（１）
●Ｍｉｎｉ Ｒｅ ｖｉｅ ｗｓ
绿色荧光蛋白在蛋白质研究中的应用
段 青 王 倩 祁庆生
（ 山 东 大 学 微 生 物 技 术 国 家 重 点 实 验 室 ， 济 南 ２５０１００ ）
［ ５ ］ Ｊａｈｎ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）， ２００４， （３）： ２７４－ ２７５ ［ ６ ］ Ｈｏｎｄａ Ｙ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００６， ２８１（３）： １４２６－ １４３１ ［ ７ ］ Ｖａｕｇｈａｎ ＭＤ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， ２００６， １２８（１９）： ６３００－ ６３０１ ［ ８ ］ Ｓｕｇｉｍｕｒａ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， ２００６， ７０ （５）：
用研究中的可行性。 荧光互补不仅在蛋白质相互作用中有所应用，
Ｊｅｏｎｇ 等［６］ 以 与 底 物 结 合 时 会 有 典 型 构 象 变 化 的 麦芽 糖 结 合 蛋 白 （ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＭＢＰ）为 模 型， 将 ＭＢＰ Ｃ 端和 Ｎ 端分别与 ＧＦＰ 片段融合。 结果证明加入底物的一组显示出比对照组更强的 荧 光 ， 由 此 提 出 ｓｐｌｉｔ－ ＧＦＰ 在 观 察 蛋 白 质 构 象 变 化中的应用。
２４３－ ２５１ ［１４］ Ｆｅｎｇ ＨＹ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００５， ２８０（４４）： ３７０８８－ ３７０９７ ［１５］ Ｄｉｏｎ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ， ２００１， １８（３）： ２１５－ ２２３ ［１６］ Ｄｉｏｎ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ， ２００１， １８（６）： ４５７－ ４６４ ［１７］ Ｋｉｍ ＹＷ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００４， ２７９（４１）： ４２７８７－ ４２７９３ ［１８］ Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ Ｆ ｅｔ ａｌ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２００１， ５７： ６４７－ ６５２ ［１９］ Ｇｏｙａｌ Ｋ ｅｔ ａｌ． Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ， ２００２， ４０７（１）： １２５－ １３４ ［２０］ Ｍｕｌｌｅｇｇｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ． Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ， ２００６， ４５ （１６）：
另 外 ， 重 要 的 荧 光 成 像 技 术— ——荧 光 共 振 能 量 转 移 ［ ７］ （ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ， ＦＲＥＴ）， 利 用 ＧＦＰ 及 其 突 变 体 ， 实 现 了 定 时 、 定 量、定位、无损伤地在活细胞内检测大分子构象 变 化 和 蛋 白 质 相 互 作 用 。 最 近 ， Ｐｅｄｅｌａｃｑ 等［８］ 经 过突变得到一种 ＧＦＰ 超折叠体。这种 ＧＦＰ 超折叠 体不论是在单独表达还是融合表达时都不容易产 生荧光的减弱， 将有望用于 ＦＲＥＴ 技术的改进。 ３． ＧＦＰ 在蛋白质表达中的应用 ３．１ ＧＦＰ 与 蛋 白 质 可 溶 性 表 达 利 用 大 肠 杆 菌 进行蛋白质大量表达时， 常常会造成蛋白质错误 折叠和聚集沉淀。已有的增加蛋白质可溶性表达 的方法包括： 靶蛋白与溶解性好的蛋白质融合表 达、靶蛋白与促折叠剂及伴侣蛋白共表达、低温 表达、改善培养条件等。但这些方法并不适用于 所有情况， 因为没有从本质上改变控制蛋白质折 叠和可溶性的因 素 。Ｗａｌｄｏ 等［９］ 利 用 ＧＦＰ 只 有 在 自身折叠正确的情况下才产生荧光的特性和能在 基因水平操作的优点， 将随机突变后的目的蛋白 以 Ｃ 端 同 ＧＦＰ 融 合 ， 在 大 肠 杆 菌 中 构 建 表 达 文 库。荧光筛选和 ＳＤＳ 验证表明， ＧＦＰ 的 折 叠 和 发 光基团的形成与上游蛋白质的正确折叠及可溶性 直 接 相 关 。此 后 ， Ｐｅｄｅｌａｃｑ 等［１０］ 进 一 步 利 用 ＧＦＰ 指 示 筛 选 到 可 溶 性 提 高 的 甲 基 转 移 酶 、 ＮＤＰ 激 酶 ， 并 通 过 Ｘ 光 衍 射 实 验 得 到 了 进 化 的 ＮＤＰ 激 酶 的 结 构 。ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ 等［１１］ 利 用 这 种 方 法 ， 通 过 易 错 ＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ－ ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ）增 加 了 ＴＥＶ 蛋 白 酶 在 大 肠 杆 菌 中 的 可 溶 性 表 达 。 Ｋａｗａｓａｋｉ 等 ［１２］ 将 Ｔ－ ＰＣＲ（ｔａｇｇｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ ＰＣＲ）扩 增 与 ＧＦＰ 标 记 筛 选 方 法 相 结 合 ， 从 小 鼠 Ｖａｖ 蛋 白 中 克 隆 到 ４ 个可溶结构域。
针对 ＧＦＰ 折叠报告系统存在的问题， 比如在 蛋白质定向进化中， 蛋白质可能从内部隐蔽核糖 体结合位点错误起始翻Baidu Nhomakorabea而形成截短的蛋白质， 以及这种报告系统不适用于由于缓慢聚集而形成 的 不 溶 性 蛋 白 质 ， Ｃａｂａｎｔｏｕｓ 等［１３］ 在 ＧＦＰ 折 叠 报
经过环化、氧化后形成的咪唑环， 在钙离子激发 下 产 生 绿 色 荧 光 ［１］。
通 常 ， ＧＦＰ 在 完 整 并 形 成 正 确 构 象 时 能 够 产 生荧光， 这个性质使得它在蛋白质研究中具有极 其重要 的 作 用 。ＧＦＰ 被 广 泛 地 用 作 指 示 分 子 ， 通 过与靶蛋白的基因融合， 来研究蛋白质相互作 用、构象变化， 蛋白质折叠效率与可溶性， 蛋白 质 的 表 达 以 及 细 胞 定 位 等 。 作 为 报 道 分 子 ， ＧＦＰ 具有很多优点， 如实现了活细胞内基因表达和定 位、荧光为蛋白质的内在属性、荧光发射无种属 依赖性、检测时不需要附加辅助因子、具有高度 稳 定 性 等 。 另 外 ， 细 胞 内 ＧＦＰ 的 检 测 也 比 较 简 单， 如利用紫外灯、荧光显微镜、荧光激活细胞 分选仪等， 现有报道利用实时定量 ＰＣＲ 进行 ＧＦＰ
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能 将 很 快 被 实 现 。最 近 ， 糖 苷 酶 的 突 变 酶— ——糖 苷合成酶被应用于合成糖蛋白和 鞘 糖 脂 ， ［７，２０］ 不 仅 成功地解决了长期以来糖蛋白和鞘糖脂难以合成 或合成产量低、难以大量获得的难题， 同时也扩 大了糖苷酶的应用范围。随着分子生物学技术在 糖苷酶领域的进一步应用， 糖苷酶的作用将会继 续延伸， 更多的新酶将会不断涌现， 极大地丰富 其合成的糖类及药物分子的种类， 推动糖生物学 和制药业的迅速发展。
１２１０－ １２１７ ［ ９ ］ Ｋｉｍ ＹＷ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， ２００６， １２８（７）： ２２０２－ ２２０３ ［１０］ Ｈｉｎｚ ＳＷ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ， ２００６， ９３（１）： １２２－ １３１ ［１１］ Ｈａｎｓｓｏｎ Ｔ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ， ２００１， ７３（３）： ２０３－ ２１０ ［１２］ Ｒｉｖｅｒａ ＭＨ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ， ２００３， １６（７）： ５０５－ ５１４ ［１３］ Ａｒｏｎｓｏｎ ＮＮ Ｊｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， ２００６， ７０（１）：
１． 绿色荧光蛋白 绿 色 荧 光 蛋 白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＧＦＰ）
是 荧 光 蛋 白（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＦＰ）家 族 中 常 用 的 一 种 ， 最 初 从 水 母 Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ 中 分 离 得 到 。 它能够在单独或者与其他蛋白质融合时产生荧 光， 最显著的特点是除了氧气之外， 不需要其他 辅 酶 。ＧＦＰ 由 １１ 个 β片 层 组 成 桶 状 构 成 疏 水 中 心， 由 α螺 旋 包 含 着 的 发 光 基 团 位 于 其 中（图 １）。 这 个 发 光 基 团 是 由 ３ 个 氨 基 酸（Ｓｅｒ６５、Ｔｙｒ６６、Ｇｌｙ６７）