细胞的传代培养和细胞计数法共17页
细胞传代培养实验报告
一、实验目的1. 掌握细胞传代培养的基本操作流程。
2. 熟悉细胞传代培养过程中的注意事项。
3. 了解细胞传代培养在生物科学研究中的应用。
二、实验原理细胞传代培养是指将已经生长到一定阶段的细胞，通过特定的方法进行分离、洗涤、消化、计数和稀释等步骤，将细胞转移到新的培养容器中继续培养的过程。
细胞传代培养是维持细胞生长、扩大细胞数量和保持细胞特性的重要手段。
三、实验材料1. 细胞：HeLa细胞2. 培养基：DMEM/F12培养基（含10%胎牛血清）3. 试剂：0.25%胰蛋白酶、10%FBS、PBS缓冲液、酒精4. 仪器：超净工作台、倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、移液枪、培养瓶/皿、吸管等四、实验步骤1. 准备阶段（1）将HeLa细胞从培养瓶中取出，用PBS缓冲液轻轻洗涤一次，去除残留的培养基。
（2）准备胰蛋白酶工作液，将其置于37℃水浴中预热。
（3）准备含有10%FBS的培养基，将其置于37℃水浴中预热。
2. 分离细胞（1）用移液枪吸取适量胰蛋白酶工作液，滴加到细胞培养皿中的细胞层上。
（2）将培养皿置于37℃、5%CO2的培养箱中消化2-3分钟。
（3）倒置显微镜下观察细胞，当大部分细胞变圆且亮时，加入等体积含有10%FBS的培养基终止消化。
（4）用移液枪轻轻吹打细胞，使其成为细胞悬液。
3. 计数（1）取适量细胞悬液，使用细胞计数仪或显微镜配合琼脂滴定法计数。
（2）根据计数结果，调整细胞密度至所需的浓度，一般为每毫升105-106个细胞。
4. 传代（1）向含有预热的培养基的离心管中加入细胞悬液，并轻轻混匀。
（2）离心管离心，在1500 rpm速度下离心3-5分钟，以沉淀细胞。
（3）弃去上清液，保留沉淀的细胞。
（4）加入适量的新鲜培养基，将细胞重新悬浮。
（5）将细胞悬液转移到新的培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
五、实验结果1. 成功完成细胞传代培养，观察到细胞在新的培养瓶中继续生长。
2. 细胞生长状态良好，细胞密度符合预期。
传代培养及细胞计数 ppt课件
传代培养及40培养基 2ml，终止消化，并充分吹打。吹打后将悬浮起来的 细胞转移到15ml离心管中，1000rpm离心5min。
传代培养及细胞计数
6. 离心后，弃上清，加含血清1640重悬，混匀，取50ul用于细胞 计数。
传代培养及细胞计数
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也 是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细 胞直接分皿就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分皿。
传代培养及细胞计数
仪器：培养箱（调整至37℃）、培养皿、超净工作 台、倒置相差显微镜。
材料：卵巢癌细胞HO-8910。 试剂：1640培养基（含血清10%）、0.25%胰蛋白酶、
③ 各个实验小组的同学负责将垃圾带走，值日生打扫 实验室卫生。
传代培养及细胞计数
1. 试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是 关键步骤。
传代培养时要注意严格的无菌操作，并防止细胞之间的交叉 污染。
酶解消化要适度，消化过度会对细胞造成损害，消化不够则 难于将细胞解离下来。
传代后第2-3天观察细胞生长情况，了解细胞是否健康生长： 健康细胞的形态饱满，折光性好。
掌握好代传代时机：健康生长的细胞生长致密，即将铺满瓶
传代培养及细 胞计数
7. 血球计数板的计数原理
传代培养及细胞计数
8. 根据细胞计数的结果，用含血清的培养基调整细胞浓度到 1X105个/ml。分至两个培养皿中，做好标记，继续培养。
传代培养及细胞计数
① 实验完毕，将培养基瓶口迅速过酒精灯火焰消毒， 拧紧后，封口膜密封。拿出超净台，放入冰箱。
② 实验后，请将超净工作台内擦拭干净，酒精喷洒消 毒，并将酒精擦干净，打开紫外灯灭菌。用过的离 心管和血球计数板须清洗干净。
细胞的换液与传代培养
传 代
成细胞悬液再传代。
培 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，
养 沉淀物加新培养液后再混匀传代。原代细胞
传代按1：2接种，细胞系传代按1：3-4接种。
动
2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）
物 细
此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不
胞
牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，
传
进行传代。
代
一、传代培养（passage）
❖无论是否稀释，将细胞从一个培养 瓶转移或移植到另一个培养瓶，也 称再培养（subculture）
二、单层培养细胞的一传代步骤:
倒出旧液 PBS洗涤 胰蛋白酶消化 倾出消化液 培养 稀释 计数 吹散细胞 加入培养液
三、原代培养物需要换液和传代 (subculture)的指标
细胞的换液与传代培养
细胞系cell line：原代培养物经首次传代后即成。 有限细胞系finite cell line: 不能继续传代或传代数有限。 连续细胞系continuous cell line：可连续传代的细胞系， 即已建成的细胞系。 细胞株cell strain：通过选择法和克隆形成法从原代培 养物或细胞系中获得的具有特殊性质和标志的培养物。
动 1.pH值下降（红变黄色）；
物 细
2.细胞浓度；
胞 3.细胞类型；
传
代 4.细胞形态学；细胞核四周充满颗
培
粒，细胞质呈空泡化，细胞变圆，
养
或出现细胞与底物脱离时。
四、细胞传代方法
动 1．悬浮生长细胞传代
物 直接传代法：静置数分钟，悬浮细胞沉淀在
细 瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然
胞 后加入等量的新鲜培养基用吸管直接吹打形
细胞传代培养实验报告
细胞传代培养实验报告一、实验目的：1.了解细胞传代培养的基本原理；2.学习细胞传代培养技术的操作方法；3.掌握细胞传代培养实验的基本步骤和注意事项；4.获得细胞传代培养实验的经验和技能。
二、实验原理：细胞传代培养是指从初始培养物中取出一部分细胞并重新分散、传代到新的培养基中。
通过连续传代，细胞数量可以维持并增加，同时可以获得较为纯净的细胞系，以满足细胞实验的需要。
传代细胞时，需要注意细胞的密度，培养基的补充和细胞培养的条件等。
三、实验材料与方法：1.材料：-细胞培养物-培养基-无菌离心管、培养皿、吸管、移液器等实验器材2.方法：-准备工作：消毒实验器材和台面，准备培养基和培养物；-取出细胞培养物，离心采样管；-收集细胞，用无菌移液器将细胞转移到新的培养基中；-细胞传代，将细胞分散在新的培养基中；-转移细胞至新的培养皿中；-增加培养基，继续培养细胞；-观察细胞生长情况，记录数据。
四、实验结果与分析：1.细胞的形态：观察细胞的外形和颜色，是否有异常；2.细胞的数量：通过显微镜或细胞计数板计算细胞的数量；3.细胞的增长速度：根据前几代的细胞数量和时间，计算细胞的增长速率；4.观察细胞的附着情况和细胞分裂情况；5.记录实验结果。
五、实验结论：通过本次实验，我们成功进行了细胞的传代培养实验。
观察细胞的外形和数量变化，我们可以得出以下结论：1.细胞在新的培养基中可以继续生长和繁殖，实现了细胞传代培养的目标；2.细胞数量随着传代次数的增加而增加，细胞的增长速率相对稳定；3.细胞形态正常，没有明显的异常；4.在培养的过程中，细胞附着情况较好，细胞分裂正常。
六、实验心得：通过本次实验，我学到了细胞传代培养的基本原理和操作技巧。
我了解了细胞的培养条件和细胞的要求，掌握了细胞传代培养的步骤和注意事项。
在实验中，我注意保持实验器材的无菌，尽量减少细菌的污染。
同时，我也学会了如何观察细胞的形态和数量变化，以及如何记录实验结果。
细胞培养的方法及注意事项
细胞培养的方法与注意事项细胞培养是将动物某一器官、组织如肝脏、肺、肾脏等取出，将其分散成单个细胞，在人工条件下，使之存活、生长和增殖的技术。
细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养：第一次培养，将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物，不更换培养物的生长器皿的培养过程。
传代培养：在培养过程中培养物分裂生长，长满培养空间，细胞之间相互接触而发生接触抑制，生长速度减慢甚至停止。
在这种情况下，需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿中，再进行培养一、原代培养的方法：1、取材对于水产动物，取材的方法为：无脊椎动物取材用消毒海水或淡水暂养24小时；用酒精棉消毒体表；解剖需培养的组织和器官，放到消毒液中处理一段时间；取出，用灭菌BSS清洗3次鱼的取材用酒精棉消毒体表；打开腹腔（注意不能碰破肠道）；体表组织，处理方法同无脊椎动物。
原代培养过程技术路线图：①准备工作：实验台面用紫外灯照、70%酒精棉球擦；所用各种器械、培养液无菌；操作者用新洁尔灭和酒精擦手，穿衣、戴帽、口罩；实验动物体表用酒精消毒或放入无菌海水中。
②取材：在无菌条件下取出需要培养的器官或组织；如果是有菌的器官或组织需进行灭菌处理；取材要准确③培养材料的制备：欲培养的器官或组织洗去血污，剔掉多余成分。
剪成1mm3大小，用于外置块培养。
用胰蛋白酶消化，终止消化后，机械法吹打组织块，筛网过滤，过滤液离心1000rpm,10min，用培养液悬浮细胞，计数细胞密度，用于细胞培养。
④接种：外植块：用吸管将小的组织块均等地在培养瓶底排列好；反过培养瓶加入培养基，或5-6h后再加培养基；放入CO2培养箱培养；2-3d更换培养液或颜色变黄时更换；记录、每2-3d观察。
结果：1-3d，细胞从外植块中迁移出来分离细胞：将已分散的细胞悬液加到培养瓶或培养板中，并加少量培养液,细胞浓度为105-106个/ml。
不能少于5000个。
24h后加足培养液（防漂浮）。
原代细胞培养和传代培养的方法
原代细胞培养和传代培养的方法原代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒初代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
细胞传代的操作步骤
细胞传代的操作步骤细胞传代的操作步骤：一、细胞培养基的制备：细胞培养基是细胞传代的基础，它提供了细胞所需的营养物质和生长环境。
制备细胞培养基的主要步骤如下：1. 准备培养基所需的原料，包括培养基基础成分、氨基酸、维生素、生长因子等。
2. 将适量的培养基基础成分溶解在无菌的蒸馏水中，加热至溶解完全。
3. 按照配方添加适量的氨基酸、维生素和生长因子等辅助成分。
4. 调节pH值和渗透压，并进行无菌过滤，得到无菌的细胞培养基。
二、细胞的预处理：在细胞传代前，需要对细胞进行预处理，以保证细胞的健康和正常生长。
预处理主要包括以下几个步骤：1. 细胞的分离：将培养皿中的细胞进行分离，通常采用胰蛋白酶等消化酶来处理细胞，使其分离成单个细胞。
2. 细胞的计数：使用细胞计数板或细胞计数仪对细胞进行计数，以确定细胞的数量。
3. 细胞的离心：将细胞离心沉淀，去除培养基和消化酶等残留物。
4. 细胞的重悬：将细胞用培养基等培养液进行重悬，使其均匀分散。
三、细胞的传代：传代是指将细胞从一种培养容器转移到另一种培养容器中，并提供新的培养基，以维持细胞的正常生长和增殖。
细胞传代的步骤如下：1. 准备无菌的培养皿：将需要传代的培养皿进行无菌处理，通常采用高温高压灭菌法或紫外线照射法。
2. 细胞接种：将预处理好的细胞取适量加入新的培养皿中，使其均匀分散。
3. 添加培养基：在细胞接种后，加入适量的新鲜培养基，以提供细胞所需的营养物质。
4. 培养条件的调节：根据细胞的特性和要求，调节培养条件，包括温度、CO2浓度、湿度等。
5. 观察和记录：定期观察细胞的生长情况，并记录细胞数量、形态和健康状况等信息。
四、细胞培养的维护：细胞传代后，需进行细胞培养的维护工作，以使细胞保持健康和正常生长。
细胞培养的维护包括以下几个方面：1. 培养基的更换：定期更换培养基，以提供新鲜的营养物质和生长环境。
2. 细胞的分离：当细胞达到一定密度时，需进行分离，以避免细胞过于拥挤而影响其正常生长。
细胞传代详细步骤
细胞传代详细步骤细胞传代是指细胞在培养皿或体外环境中无限次数地繁殖和增殖的过程。
这个过程是非常重要的，因为它可以用于细胞培养、疾病研究和新药开发等多个领域。
细胞传代的步骤包括：细胞预处理、传代处理和培养细胞。
第一步：细胞预处理在传代之前，细胞需要接受一些预处理以保证其健康和增殖能力。
预处理步骤包括：1.检查细胞的形态和凝聚性，以确保它们没有受到感染或污染。
如果细胞解聚或异常，应该重新开始培养过程。
2.滚珠法检测细胞的活力。
通过与抗体反应，可以确定细胞是否具有细胞膜完整性和活力。
3.检查细胞的遗传特性，例如核型分析或DNA指纹图谱。
第二步：传代处理传代处理的主要目的是保持细胞的健康和增殖能力。
传代处理的具体步骤包括：1.组织分离：将细胞从培养皿或器官中分离出来。
常用的方法包括机械剪切（如琼脂糖酶消化）、化学消化（如胰蛋白酶）或酶解（如胶原酶）方法。
2.细胞计数：使用显微镜和细胞染色剂（如尝试胎儿牛血清素、樱桃牛血清素或尝试蓝）来确定细胞数目。
这对于计算细胞密度和加入适量的细胞到培养皿中非常重要。
3.加入培养基：将新鲜培养基加入细胞悬液中，以提供细胞增殖所需的营养物和生长因子。
培养基的配方可以根据细胞类型和研究目的进行调整。
4.处理细胞：处理细胞悬液，如离心沉积细胞，以去除旧的培养基和废弃物。
在离心过程中，细胞可以沉积在底部，形成一个叫做细胞沉淀的物质。
第三步：培养细胞在传代处理之后，细胞应该被重新培养和继续传代。
培养细胞的具体步骤包括：1.培养皿处理：将细胞沉淀悬液加入预先处理过的新的培养皿中。
培养皿通常会用一种叫做凝胶体的物质包裹，以提供细胞附着和增殖所需的支持。
2.细胞监测和培养：在培养过程中，应定期检查细胞的形态、增殖情况和细胞的遗传特性。
这可以通过显微镜观察、细胞计数和遗传分析等方法来完成。
培养细胞需要维持在适当的温度（通常为37摄氏度）、湿度和二氧化碳含量下。
3.传代细胞：当细胞达到一定的密度和增殖速度时，应该进行传代以避免细胞过度增殖和细胞分化。
细胞培养PPT
长需要。
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人工合成培养基只能维持细胞生存，
要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量
的天然培养基（如血清）。
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血清中含有：
①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子 ； ③激素；
④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分
1悬浮生长细胞传代
离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养
液后再混匀传代。
直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／
2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。
2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）
此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹
打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
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滤器
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CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖 微松，以保证通气。
②保持培养箱内空气干净。定期消毒
（90 ℃ ，14 h)。
③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中 以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。
在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要 用无血清培养基培养细胞．
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无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因 子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。
无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。
1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近 20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和 增殖。
Hep2细胞的传代培养
1
一、原理
❖ 体外培养的细胞形成单层汇合以后，由于细胞密度过大, 生存空间不足而引起营养枯竭，将影响细胞的继续生长， 此时需将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3 以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培 养。
❖ 传代培养可获得大量的同种细胞，并维持细胞种的延续, 同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
9
谢 谢！
10
2
❖细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一
段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中， 细胞倍增3～6次。
3
二、材料和试剂
❖1、细胞： Hep-2 细胞 ❖2、试剂： PBS、VTP、DMEM营养液（含10％
小牛血清） ❖ 3、仪器和器材：倒置显微镜、CO2培养箱、培
养瓶、吸管、废液缸等
三、操作方法
6
四、结果
❖置于37℃培养的细胞，次日开始需逐日进行观 察，主要观察：
（1）培养物是否被污染 （2）细胞生长状况 （3）如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征
7
Hep-2细胞 ×100
8
五、注意事项
❖ 严格的无菌操作 ❖ 适度消化 ❖ 每天观察细胞形态，生长致密时即可传代。 ❖ 如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施。
❖ 将长成单层的Hep-2细胞弃去原来的培养液， PBS洗2次。
❖ 在瓶中加入少许消化液(以液面盖住细胞为宜)， 静置3～5分钟。
5
❖ 肉眼观察当见到瓶底出现细针孔空隙时终止消
化。倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，
细胞相互之间不再连接成片，表明此时细胞消 化适度。这时应立即将消化液倒掉，加入适量 新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。 ❖ 以1：2或1：3进行分装，标记，置37℃培养。
细胞技术方法和传代方法
打法使细胞从 瓶壁脱落下来， 进行传代。
贴壁生长细胞 传代
采用酶消化法 传代。常用的 消化液有0.25 ％的胰蛋白酶 液。
贴壁生长细胞传代方法：
一．吸光培养瓶中的培养液 二．加入1-2 ml 0பைடு நூலகம்25％的胰蛋白酶液(以消化
液能覆盖整个瓶底为准） 静置2-10 min（显微镜下动态监测）。 一．吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 二．用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细
胞，形成细胞悬液。
01 离心，细胞沉淀用培养 液制成悬液。
02 吸取1/10—1/40细胞悬 液，接种于新的培养瓶 内。
03 加适量新鲜培养液于接 种了细胞悬液的新培养 瓶内。
04 将后者放入培养箱中培 养。
感谢观看
Thanks
谢谢！
细胞传代 方法
根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：
悬浮生长细胞传代
离心法传代：离心（1000转/分）去上清， 沉淀物加新培养液后再混匀传代。
直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将 上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管 直接吹打形成细胞悬液再传代。
半悬浮生长细 胞传代（Hela 细胞）
此类细胞部分 呈现贴壁生长 现象，但贴壁 不牢，可用直 接吹
二．将细胞悬液吸出少许， 滴加在盖片边缘，使悬 液充满盖片和计数板之 间。 静置3分钟。
镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞 只计左侧和上方的。然后按下式计算： 细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应 按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散 不好，需重新制备细胞悬液。
细胞培养
细胞的传代方法 培养细胞的方法 主要讲2方面问题：
传代培养和细胞计数共19页
END
传代培养和细胞计数
6、法律的基础有两个，而且只有两个……公平和实ห้องสมุดไป่ตู้。——伯克 7、有两种和平的暴力，那就是法律和礼节。——歌德
8、法律就是秩序，有好的法律才有好的秩序。——亚里士多德 9、上帝把法律和公平凑合在一起，可是人类却把它拆开。——查·科尔顿 10、一切法律都是无用的，因为好人用不着它们，而坏人又不会因为它们而变得规矩起来。——德谟耶克斯
16、业余生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃
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40、人类法律，事物有规律，这是不 容忽视 的。— —爱献 生
31、只有永远躺在泥坑里的人，才不会再掉进坑里。——黑格尔 32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。——普列姆昌德 33、希望是人生很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。——洛克
传代培养和细胞计数
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
《细胞传代》PPT课件
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也可将装有细胞的冻存管放入4 ℃ 冰箱 30min,-20℃冰箱30min ，然后放入70℃冰箱中过夜，最后移入液氮容器内
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注意事项
1.待冻存的细胞应具有较高的活力。从增殖期到形 成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻 存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最 好换一次培养液；
加入消化液5滴，翻转培养瓶，使消化液浸没细 胞。(一般消化时间为1到5分钟，镜下观察发现 细胞质回缩，胞体变圆)
加入3mlD-Hanks液，轻轻吹打细胞生长面， 使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作 要轻柔不要用力过猛。
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将细胞悬液移至15ml离心管中， 1000rpm*5min离心。
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培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方 法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分 贴壁生长的细胞可直接吹打传代；悬浮生 长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后 传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹 打传代。
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操作步骤
选择生长良好的A549细胞一瓶，轻轻摇动培养 瓶数次，悬浮起附着在细胞表面的碎片，然后 连同培养液倒出，用D-Hanks洗1次。
高密度 上皮样细胞
悬浮 圆形 未转化
成纤维样
贴附 成纤维或上皮样
转化后
可成上皮样
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悬浮型：
见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细 胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持 物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁 殖。
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体内细胞生长在动态平衡环境中，组织培养细胞 的生存环境是甁皿等容器，生存空间和营养是有 限的，当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出 一部分细胞和更新营养液，这一过程称传代 （passage或subculture)。传代的频率与接种 细胞数量、细胞生物特性以及营养液的性质等有 关。
细胞传代培养
细胞传代培养1.细胞传代概念传代即去除原培养基并将细胞从原培养体系转移到新鲜的生长培养基中，该过程可使细胞系或细胞株进一步增殖。
接种后培养细胞的生长将从延滞期进入对数期，即：细胞呈指数增殖。
当贴壁培养的细胞已占据所有可用基质、没有扩增空间，或者悬浮培养的细胞已超过培养基所能支撑的能力，无法进一步生长时，细胞增殖速度将大大降低甚至完全停止(参见下图)。
为了将细胞密度维持在最佳水平，以便细胞继续生长，并且刺激其进一步增殖，必须将培养物分成若干部分，并添加新鲜培养基。
2.细胞传代标准（1）细胞密度哺乳动物细胞：贴壁培养细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时即应进行传代。
正常细胞达到汇合状态时会停止生长(接触抑制),重新接种后需要较长时间才能恢复。
转化细胞即使达到汇合状态也能继续增殖，但是在经过大约两个倍增时间后通常会变质。
类似地，悬浮培养的细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时也应进行传代。
到汇合状态时，悬浮培养的细胞会聚集成团块，转动培养瓶时培养基会变得浑浊。
昆虫动物细胞：昆虫细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时应进行传代。
牢固贴壁的昆虫细胞达到汇合状态时也可传代，虽然此时细胞更容易从培养容器上解离下来，但是如果反复将昆虫细胞在密度超过汇合的状态下传代，细胞的倍增次数会减少，活力会降低，贴壁能力也会下降。
另一方面，将贴壁培养的昆虫细胞在达到汇合状态前传代要较大的机械力，才能使细胞从单细胞层中脱离。
反复在达到汇合状态前传代，会导致细胞倍增次数减少，活力降低，健康度较差。
（2）培养基耗竭哺乳动物细胞：生长培养基pH 值降低通常表示乳酸蓄积，乳酸是细胞代谢的副产物。
乳酸有细胞毒性，而且pH值降低也是细胞生长的不利因素。
pH值改变的速度通常取决于培养体系中的细胞浓度，细胞浓度越高，培养基耗竭的速度越快。
如果发现 pH 值迅速降低(>0.1-0.2 pH 单位),同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。
昆虫细胞：用于昆虫细胞培养的生长培养基通常比哺乳动物细胞培养基酸度大。