pTG19-T PCR产物克隆系统

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TAKARA公司pMD19-T说明书

Q-2 转化后的菌落全为蓝色，但有目的 DNA 片段的插入，为什么？ A-2 插入的 DNA 片段较短（小于 500 bp），且插入片段没有影响 LacZ 基因的读框，此时平板培养基上
出现的菌落有可能呈现蓝色（或淡蓝色）。
Q-3 欲对克隆 DNA 片段进行测序时，使用何种引物？ A-3 本载体来源于 pUC19 载体。因此，用于 pUC19 载体测序的通用引物都可以使用。 Q-4 pMDTM19-T Vector与pMDTM18-T Vector相比有何不同？ A-4 pMDTM19-T Vector与pMDTM18-T Vector相比，β -半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的
B）结果使用Control Insert时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：1.5×108 cfu/μg pUC19 DNA。
Control Insert
连接/转化效率（cfu/μg Vector）
白色菌落比率（%）
效率（%）*
＋
2.8×106
96.3
90 以上
－
2.2×105
4）全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 5）42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 6）加入 890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟。 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。
注） ① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 ② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
4）全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 5）42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 6）加入 890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟。 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。

pMD19-T载体说明书

TaKaRa Code：D102ApMD®19-T Vector宝生物工程(大连)有限公司目录内容 Page●制品说明 1●制品内容 1●保存 1●纯度 1●用途 1●pMD®19-T Vector的结构 1 ●实验操作 2■Control DNA片段的克隆实验2■一般DNA片段的克隆实验2●相关说明 3 ●使用注意 4 ●Q&A4●制品说明pMD ®19-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。

本载体由pUC19载体改建而成，在pUC19载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了Eco R V识别位点，用Eco R V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。

因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

由于本载体以pUC19载体为基础构建而成，所以它具有同pUC19载体相同的功能。

此外，本制品中的高效连接液Solution I 可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。

本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control 反应。

本载体与pMD ®18-T Vector 相比，本制品的 β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。

因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。

●制品内容pMD ®19-T Vector（50 ng/μl） 20 μl×1支 Control Insert（50 ng/μl）10 μl×1支 Solution I*75 μl×2支* 使用时请于冰中融解。

●保存： -20℃●纯度■ Control Insert 经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA 片段。

TA clone

PCR产物的T载体克隆（一）重组T质粒的构建一．原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。

重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

DNA 连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。

两种DNA 连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。

但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

连接反应通常将两个不同大小的片断相连。

因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。

对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。

为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端，所以除磷后载体不会自环。

一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。

通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。

对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。

双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。

但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。

pcr clone

PCR 产物克隆实验步骤1．在微量离心管中加入下列试剂2.加入5ul的solution 13.16度反应30min4.将10ul反应液全部加入100ul感受态细胞，轻轻旋转离心管，混匀，冰浴静置30分钟5.42度水浴90秒，冰浴2min6.加入500ulLB培养基（不含抗生素），混匀后37度，150rpm，摇床振荡培养45min，目的使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏；7.在无菌条件下，取适量菌液（转化质粒在10ng时，90mm的平皿涂100ul，55mm涂50ul，连接产物于4度保存，根据平板上菌落生长的情况决定是否保留）均匀加到含相应抗生素的LB固体培养基平板中，用无菌的细菌涂布器将细胞均匀涂开，等平板中的液体完全吸收后，导致平板，37度12-16小时8. 2*taq PCR MasterMIX9 反应条件10. 5ul电泳2011-3-8 陆旭主任医师查房记录患者一般情况良好，生命体征平稳，查体同前，陆大夫查看病人后指示，患者目前诊断为右胸壁肿物，不除外右侧乳腺癌术后复发。

现完善相关检查，注意监测生命体征，限期手术。

今日完善B超引导下肿物穿刺活检术，指导下一步治疗方案。

遵执。

2011-3-9 陆旭主任医师、肖文政主治医师查房记录患者未诉不适。

查体同前。

昨日行B超引导下肿物穿刺，病理结果未回报，空腹血糖回报：8.8mmol/l，陆旭主任医师、肖文政主治医师查房看病人后建议:今日监测血糖，遵执。

2011-3-5患者未诉不适。

查体：生命体征平稳。

继续目前治疗，完善术前检查，及时对症处理，观察病情变化。

2011-3-7 肖文政主治医师查房记录患者未诉不适。

查体同前。

今日右乳肿物穿刺病理结果回报示右乳导管内原位癌，高分化。

麻醉科会诊后建议：1、按神经内科建议术前予丙种球蛋白冲击，增强对手术的耐受性，持续使用溴吡斯的明；2可采用喉罩全麻，尽量减少术中肌松药的应用；3、术后入ICU 病房观察，避免肌无力危象的发生，若术后患者出现呼吸困难，尽早呼吸支持治疗。

PTG19-T载体

本次结论：tip-20柱使用4次以上时，用Buffer QC PH7.7对3K DNA片段的洗脱回收率在70%以上；柱使用1次时Buffer QC PH7.85，回收率80%以上。
·PTG19-T载体质量控制
· PTG19-T载体的连接转化实验
· PTG19-T载体与PTG dual-T载体转化实验的比较
连接片段为700bpDNA，采用连接MIX（2×）
实验结果：连接时间30分钟以上比连接时间20分钟以下连接效率高平板展示
· PTG19-T载体与PTG dual-T 载体转化实验的比较
· 两种载体对700bp，1.5kb DNA片段连接效率的比较
实验结果：连接效率相当平板展示！
· 大片段（DNA长度2K，3K，5K）连接效率
·Xcm Ⅰ酶切
Xcm Ⅰ分别酶切G364-3和G364-4质粒
酶切体系500uL，1ug质粒用酶1U
40bp 60bp
10min 20min 25min 30min 10min 15min 20min
图1：1ug质粒用酶0.5U
图2：1ug质粒用酶1U
·QIAGEN tip20柱纯化回收 PTG19-T Vetor
主要内容
· G364-3，G364-4质粒的大量制备
· Xcm Ⅰ酶切
· QIAGEN tip20柱纯化回收PTG19-T Vetor
· PTG19-T载体质量控制
· G364-3，G364-4质粒的大量制备
PTG19-T载体由PTZ19R载体改造而来，优化成 G364-3，G364-4。经过大量制备得到高质量的G364-3，G364-4质粒，供后续实验。
G364-3,G364-4经酶切后直接运用QIAGEN tip20柱纯化回收， tip20柱最大回收量为20ug

PCR产物不经过酶切,直接快速,定向克隆入任何载体的方法

PCR产物不经过酶切，直接快速，定向克隆入任何载体的方法默认分类2010-08-13 23:15:45 阅读260 评论0 字号：大中小订阅上海捷瑞生物工程有限公司提供的EZfusion PCR定向克隆同源重组试剂盒，专门为把PCR 产物快速，定向，有效的克隆到任何目标载体而设计。

有效的避免了在克隆过程中遇到的合适内切酶的选择，磷酸化，补平，加A，使用中间载体等等一系列复杂步骤。

无需连接酶，只需要把目标载体线性化(平末端，粘性末端都可以)，PCR产物无需任何酶促处理，直接和目标载体混合，20-30分钟一站式解决所有问题。

技术原理：根据酶切后线性化载体的两端序列，分别在目的基因两端设计15 base与载体末端同源的序列，PCR扩增的产物两端就会分别带有15 bp与线性化载体两端相同的序列。

PCR 产物和线性化载体与EZfusion Enzyme酶充分混匀，22 ℃温浴30 min后，按传统方法转化E. coli competent cells，就可以高效、定向地将PCR产物克隆到目标载体上。

如下图：适用范围：1、PCR cloning into any vector2、Long PCR DNA (up to 12 kb) cloning3、Gene transfer from one vector to another4、High-throughput (HTP) PCR cloning5、In vitro joining of DNA fragments优点：1适用于各种自备载体、插入片断、或者酶切位点，只要线性化载体就行（单酶切、双酶切均可），不用酶切PCR产物，不用补平或加A处理，不用去磷酸化载体，不用连接；2. 适用于各种PCR酶（常规Taq、各种高保真酶均可）的扩增产物；3. 混合温育30分钟即可转化，节约时间和精力；4. 精确定向克隆，即使载体单酶切也可以定向，表达产物没有多余的氨基酸；5. 重组效率高、转化率高，可用于高通量操作，批量克隆, 重复性高、可靠性好；6. 根据实验需要选择适合的表达载体，选择最佳酶切位点，酶切载体后得到线性化载体（单酶切或者双酶切均可），得到PCR产物和线性化载体后，加入EZfusion Enzyme酶，混合，22°C保温30分钟后转化，就可以高效、精确、定向将PCR产物克隆到目标载体上。

PCR产物的TA克隆

PCR产物的TA克隆(DNA的胶回收和连接)【实验原理】1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。

切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。

2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。

商品化的T载体有很多。

本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。

这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。

由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。

【试剂与器材】（一）试剂1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。

2.TAE电泳缓冲液3.琼脂糖（Agarose）4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。

5.溴化乙锭(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。

6.70%乙醇7.胶回收试剂盒（Omega公司）（二）器材水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 凝胶成像系统或其它照相设备。

【操作方法】（一）胶回收试剂盒回收PCR产物（以Omega公司Gel Extraction Kit为例）1.当目的片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。

2.凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。

近似地确定其体积（假设其密度为1g/ml）。

pMD19-T Simple Vector的结构

注） ① ② ③
室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。长片段 PCR 产物（2 kbp 以上）进行 DNA 克隆时，连接反应时间请延长至数小时。
4）取 2 μl 上述连接液（10 ng Vector DNA）加入到 microcentrifuge tubes 中，冰上冷却 2 min。 5）取 50 μl E.coli JM109 Competent Cell 加入到上述 microcentrifuge tubes 中，混匀并冰浴 5 min。 6）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养（平板使用前需要在 37℃预热 30 分钟），形成
记录菌落数。以得到 200 个克隆体为例计算转化效率，此时的转化效率=200 cfu/0.001 ng=2×105 cfu/ng=2×108 cfu/μg pUC19 DNA。
● 使用注意
1. 由于载体上的多克隆酶切位点被破坏，所以使用本载体克隆 PCR 产物时，注意应在 PCR 引物上设计导入酶切位点，否则将会难以切下 DNA 片段进行其它亚克隆实验。
2. Solution I 请于冰中融解。 3. 克隆时使用的 Insert DNA 片段（PCR 产物）建议进行切胶回收纯化，否则 PCR 产物中的短片段
DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质都会影响 TA 克隆效率。 4. 按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过 20 μl。当要转化的 DNA 量较大或准
●用途
■ 进行 TA 克隆，克隆 PCR 产物。 ■ 对克隆后的PCR产物使用BcaBESTTM Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序。

pmd18-19-T 质粒图谱

GAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC
ACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCG CAGCACTGACCCTTTTGGGACCGC BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47
LacZ operator
146 ~ 469
ColE1 ori
852 ~ 1466
Ampr
1626 ~ 2486
■ 实验操作 Control DNA片段的克隆实验 A.操作方法
1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 µl。
pMD18-T or pMD19-T Vector*1
1 µl
Control Insert*2
■ 相关说明 1.感受态细胞的选择。
PCR产物克隆系列载体
PCR产物克隆系列载体
转化时请使用高效的热转化感受态细胞（转化效率≥1
×108 cfu/µg pUC19)，这样才可能得到比较理想的阳
性克隆。如果需要进行蓝白筛选时，宿主细胞必须具
有正确的基因型（F'编码的［ △M15］）产生 ω
Fragment，才可能和载体DNA产生的
ng DNA/ml)，将上述培养液稀释10倍后（0.01 ng
DNA/ml）取100 µl涂布平板（0.001 ng DNA/100
µl)，记录菌落数。以得到200个克隆体为例计算转化效率，此时的转化效率=200 cfu/0.001 ng=2×105
cfu/ng=2×108 cfu/µg pUC19 DNA。

PCR产物不经过酶切直接快速定向克隆入任何载体的方法

PCR产物不经过酶切直接快速定向克隆入任何载体的方法PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。

在PCR反应中，DNA模板被扩增成PCR产物，这些产物可以用于克隆到适当的载体中，以便进一步分析和研究。

常规的PCR扩增后，通常需要通过酶切产物，并连接到适当的载体上，然而，如果PCR产物已经获得，并且不需要进行进一步处理，则可以直接进行快速、定向克隆入任何载体的方法。

以下是该方法的详细步骤：第一步：设计引物-选择引物序列，使其具有与PCR产物的5'和3'端相互补的序列。

-引物的5'末端需要添加一个相应的酶切位点，以便在下一步中克隆到载体上。

第二步：PCR扩增-使用设计好的引物，将PCR产物扩增出来。

在反应中引入适当的条件和酶。

-可以使用标准的PCR条件，包括模板DNA、引物、适当的缓冲液和聚合酶。

第三步：制备载体DNA-选择一个适当的载体，如质粒或噬菌体DNA，并将其线性化或在所需的位置上酶切。

- 线性化或酶切载体后，进行酶切位点的HLigation反应，以恢复载体的环状形态。

第四步：酶切亲和纯化PCR产物-使用刚刚克隆到PCR产物上的引物，将其进行酶切。

-在酶切反应中引入切割PCR产物的限制性内切酶。

-可以将酶切后的PCR产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他亲和纯化方法纯化。

第五步：进行连接反应-在连接反应中将酶切后的PCR产物与线性化的载体DNA连接。

-使用连接酶和连接缓冲区进行连接反应。

-连接反应中还应避免产生过量连接产物。

第六步：转化宿主细胞-使用合适的方法将连接产物转化到选择性培养基中的细胞中。

-宿主细胞应具有适当的选择性标记。

第七步：筛选-在选择性培养基上筛选转化子。

-使用适当的培养基含有合适的抗生素或其他选择性标记。

通过以上步骤，可以快速而直接地将PCR产物定向克隆入任何载体中。

这种方法可以用于克隆和分析感兴趣的DNA片段，同时避免了酶切和连接产物的额外步骤，并且有效地提高了实验的效率。

猪Fc受体γ亚单位基因克隆与原核表达

猪Fc受体γ亚单位基因克隆与原核表达张志远;张继希;徐红运;刘肖萍;卢晓艳;段二珍;夏平安;崔保安【摘要】mRNA encoding porcine FcR gamma subunit obtained from PAMs of 90-day piglets was transcribed into cDNA through RT-PCR. Recombinant plasmid pET-FcRγ was constructed successfully by inserting the cDNA sequence into pET-32a,and expressed as soluble protein with a molecular weight of about 29 kDa. Following purification ,recombinant protein FcRγ-His was used to immune mouse,and polyclonal antibody against it was obtained. Western-blotting indicated that such polyclonal antibody could react specifically with FcR-y-His. Indirect ELISA shows that the titer of the polyclonal antibody is 1 : 8000, revealing the good immunogenicity of FcRγ-His. All these results provide the foundation for further studying the structure and function of FcR gamma subunit.%应用RT-PCR技术从90日龄健康仔猪肺巨噬细胞中克隆出猪Fcγ亚单位的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-FcRγ,成功表达了分子量约为29 kDa的γ亚单位重组蛋白.将重组蛋白FcRγ-His免疫小鼠,制备获得鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体,将得到的重组蛋白多克隆抗体采用间接ELISA和Western-blotting试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的效价为1∶8000.Western-blotting结果表明,制备的鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体可以与重组γ亚单位蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性.成功克隆出猪Fc受体γ亚单位基因并表达,为进一步研究其结构与功能奠定了基础.【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2012(027)001【总页数】4页(P35-38)【关键词】猪Fc受体γ单位;克隆;原核表达;多克隆抗体【作者】张志远;张继希;徐红运;刘肖萍;卢晓艳;段二珍;夏平安;崔保安【作者单位】河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002【正文语种】中文【中图分类】S828Fc受体多是作为一个多亚单位的复合体来发挥功能的,一般由3个亚单位构成:α、β和γ二聚体,其中只有α亚单位具有特异的识别功能,能与免疫蛋白Fc段结合,γ亚单位在信号转导、受体装配及调节特异性配体方面发挥重要作用,γ亚单位胞质区有免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motifs,ITAM)[1]。

【doc】一种PCR产物克隆的新方法—T—A克隆法

一种PCR产物克隆的新方法—T—A克隆法1999;26(2)生物化学与生物物理进展Pr哩.Bioeltem.Biophys.?187?H.一APse坤m叫呲P啪''''':卜wei,'W ANGY an—Zhi(Schoo/ofLifeScience931,～1,…I_,,州:A.H.n:theangeisbetterthanquinacrinewiththeinltia1slopex'acuolarH一ATPa~e~mplexfromoa话ro眦sPlantPhy~ol,一一.一...…一妲拍pactivity'nDeI_II一met\一f,一种PCR产物克隆的新方法——T.A克隆法李新波壑尘田德志朱依纯姚泰._——海医科大学生理学教研室,上海200032)摘要介绍一种PCR产物克隆的新方法——T.A克隆法.用改良碱裂解法抽提pBluee~nptSK(+)质粒,用EcoRV将pBluescrlptSK(+)质粒切成平端,利用TaqDNA聚合酶及d11制备pBluescriptSK(+)T_A载体.将~-actineDNA片段克隆人自制的pBluescriptSK(+)T_A载体,经EcoRI及/-//ndlI双酶切得到与设定长的篇;PCR~-acti朝差关蔓词A克隆载体,产物,nT一4}暇学科分类号Q'r82'.___.一对PCR产物进行克隆是分子生物学领域以及基因工程领域里常用的方法.以前对PCR产物进行克隆实验,采用的方案有以下几种;一是将PCR 产物切成两端平齐的双链DNA,然后克隆到切成平端的质粒载体上,或在PCR产物的两端加上人工接头(1lnker),经限制性内切酶处理后,克隆到质粒载体的相应位点上;二是在设计PCR引物时, 使PCR引物的5端含有可切成粘性末端的限制性内切酶酶切位点的识别序列,在PCR反应结束时, 将PCR产物再用相应的限制性内切酶进行处理,以便于克隆到含相应限制性内切酶酶切位点的质粒载体上.这两种方法虽然有效,但均较繁琐.本实验的目的在于利用pBluescriptSK(+)质粒,TaqDNA聚合酶及d1vrP自制T_A克隆载体,对从RT—PCR中得到的~-actincDNA片段进行克隆.1材料与方法1.1试剂TaqDNA聚合酶,T4DNA连接酶,EcoRV,EcoRI,ndⅢ等限制性内切酶及X-gal,异丙基硫代一Ⅱ半乳糖苷(IPTG),PCR扩增p—actin片段所用试剂等来自Promega公司,质粒载体用pBluescriptSK(+),来源于中国科学院细胞生物学研究所,琼脂糖由Sigma公司进口分装,柱离心式胶回收试剂盒来源于Qiagen公司,扩增口.actin 收稿日期:1997-124)1,修回日期:1998.06—18199936(2)生翱化学与生翱橱理进展P∞g.Bioehem.Bio曲.?l8q 造成了切成平端的pBS质粒3端产生了突出的单T.核苷酸.PCR产物的3末端单A核苷酸尾与切成平端的pBS质粒的3末端突出的单T核苷酸实现了T—A互补,称为T—A克隆,它实际上是一种粘性末端连接,因而具有较高的连接效率.从一些生物工程公司(如美国的Invitrogen公司或Promega公司)可以购到已制备好的T—A克隆载体,其制备原理与自制T.A克隆载体方法相似_]J,但这类载体价格昂贵,不利于广泛推广,而且这种载体反复冻溶后连接效率也会降低;另一方面Invitrogen公司等提供的这类载体量较少,进行大量的PCR产物克隆需用大量的_r_A克隆载体,不能满足大量克隆的需要,而我们自制的T—A克隆载体,不但应用pBS质粒可行,应用其他质粒也同样有效,且操作简便,可大量制备,连接效率足以满足进行克隆操作的需要,故值得推广应用.另外,我们也将RT—PcR扩增得到的含有369个bp的13-LHeDNA片段克隆人自制_r.A载体,经自动测序证实,插入片段为370bp(PCR产物3端加入了一个A),序列全长与设计的PCR产物序列及大小完全一致.在本实验中,我们对用RT—PCR扩增的~actincDNA片段进行了T—A克隆,对一般的PCR产物应用此方法也同样可行.参考文献1萨姆布鲁克J.弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T着.盘冬雁,黎孟枫等译分子克隆实验指南(第二版)北京:科学出版杜,1992,49～56(SambrokJ,tschEF,MaaiatisTMo]cularC[oning:aLaboratoryManual2adNewY ork:ColdSDring HarborLaboratoryPres~)2AndresDA.SeabraMC.BrownMS,etaleDNAcloningof[X)r~lpOl'je31tA.fRabgerany[gerangy]t押nsfera5eartddexaonstration ofitroleaS.aRabe研pmtelnCAl,J993,73(6):1091～10993BatesMD,OlSellCL,BaekerBN,etalElevationof,s requiredfordown-regutatI叩,butnotagonist-indueeddesensitiza—den,ofea~gencosd.DarDIreceptorsinopassttmdⅡey cellsJBidChem.1993,168(20):14757～14763 ANewMethodforPCRProductsCloain——一r_A CloneTechnique.LIXin—I3o,ZHAOXiao—Song,TIANDe-Zhi,ZHUYiChun,YAOTai(Depart—maltofPhysiology,ShanghaiMedicalUnizersity,Shanghai200032.Chiha). AbstractAnewmethodforPCRproductsclonin乎一T—Acloningtechniqueisintroduced.pBluescriptSK(十)plasanidWaSextractedbymodi—fledalkalilysismethod.Abluntendswasgenerated usingrestrictionenzymeE∞RV.thenT.Acloning vectorwaspreparedinthepresenceofTaqDNA polymeraseanddTTP.1:3-actlneDNAfragmentwas clonedintotheaboveT—AcloningvectorAfter小e recombinantplasmidsweredi~edbyE∞RIandHindlII,allexpectedsizeofI~actineDNAfragmentwasobtainedKeywordsT—Acloningvector.PCRproducts.B'actin《生物化学与生物物理进展》被国内外重要检索系统收录据中国科技信息研究所统计分析表明:《生物化学与生物物理进展》被美国科技信息研究所(ISI)检索系统(SC!Search),美国《化学文摘》(《cA》)和苏联文摘杂志收录.被美国IsI检索系统收录的中国期刊共有45种.《生物化学与生物物理进展》是其中一种.《生物化学与生物物理进展》也是中国科技信息研究所统计源期刊,按1997年1214种中国科技论文统计和分析期刊的学科影响因子排序,我刊排在第18位,影响因子为0.228.据中国科学院中国科学引文数据库的1997年数据统计,我刊在被引频次最高的中国科技期刊500名排行表中排行第25名.。

pTG19-T PCR产物克隆系统

pTG19-T PCR产物克隆系统GK6021 20次GK6022 100次一、系统说明pTG19-T 载体是一种高效克隆PCR产物的专用载体。

它是由pTZ19R载体改造成的,因此具有该载体的所有特性。

因大部分Taq酶会在PCR产物的3’末端添加一个“A”，所以用本载体可以高效地进行PCR产物克隆。

产品组成GK6021 20次GK6022 50次内容浓度总量浓度总量pTG19-T vector 25ng/uL 25uL*2 25ng/uL 25uL*5Control insert 12.5ng/uL 20uL 12.5ng/uL 50uLT4 DNA Ligase 2.5u/uL 30ul 2.5u/uL 60uLT4 DNA Ligase buffer 10× 100uL 10× 200uL质量控制：1. Control Insert 经克隆后，90%以上为白色菌落；2. 用BamHI鉴定，白色菌落中85%以上包含正确大小的片段；3. 每批载体经测序确认T的存在。

用途：1. 克隆PCR产物；2. 对克隆的PCR产物用M13+,M13-,或T7通用引物进行测序；3. 蓝/白斑筛选重组子 (Blue/white screening for recombinant)。

pTG19-T载体多克隆位点结构：pTG19-T 载体图谱pTG19-T载体相关位点说明：特征位置f1(+)单链DNA复制起始区 2-457beta-galactosidase alpha片段编码区 (lacZ’) 449-733(complementary)多克隆位点 615-689lac promoter 691-710pMB1复制启动子区 1116-1730ampicillin 抗性编码区 1890-2750(complementary)T7 启动子测序引物结合位点 692-710(complementary)M13+(-47) 测序引物结合位点 575-592M13-(-48) 测序引物结合位点 745-765(complementary)二、使用说明PCR 产物纯化处理:PCR产物可以进行切胶纯化，直接沉淀或直接用于连接。

实验知识

1..pMD®19-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。

本载体由pUC19载体改建而成，在pUC19载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。

因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

由于本载体以pUC19载体为基础构建而成，所以它具有同pUC19载体相同的功能。

此外，本制品中的高效连接液Solution I可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。

本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control反应。

本载体与pMD®18-T Vector 相比，本制品的β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。

因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。

简而言之，就是一种可以将taq酶（注意：pfu不具备在产物两端加“A”碱基的能力）扩增的两端带有A碱基的产物连入这种载体，从而通过大肠杆菌扩增的载体，而且可以通过蓝白筛选来筛选阳性克隆，插入成功的为白，不成功为蓝。

2..pPIC9K转化酵母时为什么要线性化，不同的酶切位点的产生的线性化的酵母的表性为什么不同？线性化方便目的基因的插入重组，我们一般在Sal1位点线性化，∙载体类型: 酵母表达载体(ppic9k)∙细菌抗性: 氨苄青霉素(Ampicillin)∙测序引物: 3'AOX1∙测序引物序列: 5'd[GCAAATGGCATTCTGACATCC]3'3. LB一般被解释为Luria-Bertani培养基，其发明人为贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)，这个名字来源於英语的lysogeny broth，即溶菌肉汤。

芸薹属TT19基因家族RNA干扰载体的构建

芸薹属TT19基因家族RNA干扰载体的构建陈艳;柴友荣;张迪;冯瑜【摘要】为构建芸薹属TT19基因家族的RNAi载体,为芸薹属植物的种皮色素、观赏色彩等性状的研究和修饰打基础.利用PCR克隆芸薹属TT19基因家族的RNAi片段,采用双酶切将其反义片段和正义片段分别从T-载体亚克隆到平台载体pFGC5941M的启动子与间隔区之间和间隔区与终止子之间,形成RNAi载体,转化大肠杆菌并完成PCR鉴定,再转化根癌农杆菌LBA4404得到工程菌株.结果表明:克隆得到200 bp(含人工酶切位点)的芸薹属TT19基因家族RNAi片段BTT19I,其对应于甘蓝型油菜BnTT19-1 mRNA的363～540 bp,其反义和正义片段分别被NcoI+AatII和BamHI+XbaI双酶切亚克隆到pFGC5941M中,得到10552 bp的RNAi载体pFGC5941M-BTT19I(简称pBTT19I).成功构建了芸薹属TT19基因家族的RNAi载体.%The RNAi fragment of Brassica TT19 gene family is cloned by PCR first, and then its sense and antisense fragments are respectively sub-cloned into between promoter and spacer, and between spacer and terminator in platform vector pFGC5941M for forming RNAi vector and finally the RNAi vector is transformed into Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 after PCR identification to lay a foundation for research and modification of testa pigment and ornamental colo characters. The sequence results showed that the RNAi fragment (BTT19I) with 200 bp of Brassica TT19 gene family was cloned, which corresponds to 363～540 bp of BnTT19-1 mRNA, its sense and antisense fragments were respectively subcloned into pFGC5941M by NcoI+AatII and BamHI+ XbaI1 doubledigestion and pFGC5941M-BTT19 I,a RNAi vector with 10 552 bp was obtained.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2011(039)003【总页数】4页(P1-4)【关键词】芸薹属;RNA干扰(RNAi);TT19;载体构建【作者】陈艳;柴友荣;张迪;冯瑜【作者单位】西南大学,农学与生物科技学院,重庆,400716;农业部生物技术与作物品质改良重点实验室,重庆,400716;重庆市作物品质改良重点实验室,重庆,400716;重庆市油菜工程技术研究中心,重庆,400716;西南大学,农学与生物科技学院,重庆,400716;农业部生物技术与作物品质改良重点实验室,重庆,400716;重庆市作物品质改良重点实验室,重庆,400716;重庆市油菜工程技术研究中心,重庆,400716;西南大学,农学与生物科技学院,重庆,400716;农业部生物技术与作物品质改良重点实验室,重庆,400716;重庆市作物品质改良重点实验室,重庆,400716;重庆市油菜工程技术研究中心,重庆,400716;西南大学,农学与生物科技学院,重庆,400716;农业部生物技术与作物品质改良重点实验室,重庆,400716;重庆市作物品质改良重点实验室,重庆,400716;重庆市油菜工程技术研究中心,重庆,400716【正文语种】中文【中图分类】S565芸薹属(Brassica)包含许多有重要经济价值的油料、蔬菜、饲料和观赏作物。

PCR产物的T载体克隆

PCR产物的T载体克隆(一) 重组T质粒的构建一、原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。

重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。

两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA 连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。

但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA 连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

连接反应通常将两个不同大小的片断相连。

因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。

对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。

为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端，所以除磷后载体不会自环。

一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。

通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。

对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。

双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。

但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。

一种简单的PCR产物克隆方法

一种简单的PCR产物克隆方法黄淑华;彭芝兰;王和【期刊名称】《华西医学》【年(卷),期】2006(21)2【摘要】目的分别将两段PCR产物hTERT及E1定向克隆到载体pShuttle中以构建重组质粒pShuttle-hTERT-E1。

方法在合成PCR引物时两端对应加入线性化载体两端的15个碱基,这样PCR得到的产物两端就分别带上了15个和线性化载体两端重复的碱基序列,将纯化的产物与线性化载体以摩尔数为2∶1比例混和,溶于10μl的去离子水中,加入In-Fusion重组酶,在42℃下反应30分钟后转化,就可以实现类似同源重组的反应,将PCR产物定向克隆入目标载体上。

结果经鉴定,成功构建出重组质粒pShuttle-hTERT-E1。

结论无需传统的酶切、连接、去磷酸化等手段,利用In-fusion技术可快速、高效的完成PCR产物的定向克隆。

【总页数】2页(P331-332)【关键词】多聚酶链式反应(PCR);克隆;重组【作者】黄淑华;彭芝兰;王和【作者单位】四川大学华西第二医院妇产科【正文语种】中文【中图分类】R446.9;R446【相关文献】1.TA克隆及双链DNA：测序：介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法 [J], 于永利;麻彤辉2.一种简单有效的平端PCR产物克隆方法 [J], 赵崇;黄秉仁3.一种基于核酸外切酶Ⅲ的PCR产物克隆方法 [J], 王艳艳;张春雨;王兴春;刘斌4.GM-CSF PCR产物的克隆:一种快速克隆PCR产物方法的建立 [J], 郭仁锋[1];薛静[2];程云[3];罗清华[4]5.一种PCR产物克隆的新方法——T-A克隆法 [J], 李新波;赵小松;田德志;朱依纯;姚泰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。