香蕉枯萎病菌4个生理小种生化特征的比较
香蕉枯萎病拮抗芽孢杆菌的筛选与鉴定
香蕉枯萎病拮抗芽孢杆菌的筛选与鉴定
植物病害一直是影响农作物生长发育和产量的重要因素之一，而香蕉枯萎病则是近年来香蕉生产所面临的重要疾病之一。
目前，对于香蕉枯萎病的控制方法主要还是依靠化学农药，但是由于其对环境和人体健康造成的负面影响，因此寻找替代方法来控制香蕉枯萎病至关重要。
利用拮抗菌防治植物病害是一种重要方法，因为它不仅对环境友好，而且可以有效地降低化学农药的使用量。
因此，本文旨在筛选和鉴定一株拮抗香蕉枯萎病的芽孢杆菌。
首先，我们从不同来源的土壤中分离出潜在的拮抗菌，然后通过抗香蕉枯萎病菌液浸泡筛选方法筛选出具有拮抗活性的菌株。
其次，对筛选出的菌株进行形态学、生理生化和分子生物学鉴定，以确定其属于芽孢杆菌属，并以该科已鉴定的型菌作为对照。
最后，通过体外和田间试验评估该菌株对香蕉枯萎病的拮抗效果。
结果显示，共分离出15株具有拮抗活性的芽孢杆菌，并选择其中一株编号为Bacillus sp. XJ2进一步进行鉴定。
通过分析其形态学特征、生理生化特性和16S rRNA 基因序列，我们确认XJ2菌株属于芽孢杆菌属。
体外试验中，XJ2菌株对香蕉枯萎病菌平均抑制率达到70%以上，在田间试验中，施用XJ2菌株防治香蕉枯萎病的效果也得到了证实，其防效可与化学农药噻唑菌酯相媲美。
香蕉枯萎病的发生与防控
香蕉枯萎病的发生与防控香蕉枯萎病是一种毁灭性病害，是国际植物检疫对象，由尖孢镰刀菌古巴专化型侵染引起。
在我省主要分布1号和4号小种，1号小种主要为害粉蕉，4号小种为害粉蕉和香蕉。
病原菌在土壤中存活时间达数年之久，一般减产20%以上，严重的田块甚至绝收。
一、危害症状受害蕉株初期下部叶片边缘及其叶鞘外部发黄，并且逐渐向中肋扩展，致使整叶发黄迅速枯萎。
叶柄在靠近叶鞘处下折，致使叶片下垂；随后病株除顶叶外，所有叶片自下而上相继变褐、干枯；基部假茎纵裂，最后全株枯死。
剖视根茎、球茎和假茎，其维管束呈红棕色。
二、发病因素香蕉枯萎病是土传性的维管束病害，带病蕉苗和病土是初侵染源。
高温多雨、土壤酸性、砂壤土、肥力低、土质黏重、排水不良、下层土渗透性差和耕作伤根等因素，有利于病害发生。
感病的春植蕉一般在6～7月开始发病，8～9月加重，10～11月进入发病高峰。
香蕉枯萎病通过带菌的香蕉种苗、土壤和农机具等调运和搬移进行远距离传播；通过带菌的水、分生孢子进行近距离扩散。
三、检疫防控措施1.种苗检疫和管理严格育苗管理：对用于组培苗生产的吸芽要严格检疫，杜绝在病区及其邻近蕉区选取。
二级蕉苗大棚应选在地势高、远离蕉类作物的地方，需用五香蕉枯萎病病菌的土壤培养，用无污染的水灌溉，采用福尔马林、多菌灵等药剂消毒出入大棚的工具，进出口设消毒间，严禁非蕉苗生产人员进入棚内。
种植健康蕉苗：一、二级蕉苗需进行产地和调运检疫，严禁病区的蕉苗（组培瓶苗和袋苗除外）和病土调到无病区，种植者应购买经过检疫合格的香蕉种苗。
2.清除病株发生香蕉枯萎病的蕉园要及时挖除病株，就地晒干焚烧。
有条件的可先用草甘膦溶液注入发病香蕉植株（在植株高15厘米处注入，大株10毫升、小苗3毫升），待植株枯死后，收集病株集中烧毁或深埋处理。
零星发病区的蕉园必须改种其他非蕉类作物或作其他用途；重病区的蕉园要用石灰或多菌灵等药剂对病株周围的土壤进行消毒处理，并进行农业防治。
香蕉枯萎病菌毒素在香蕉抗病品种选育和抗病性鉴定中的应用
香蕉枯萎病菌毒素在香蕉抗病品种选育和抗病性鉴定中的应用本文对香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp. cubense)毒素和细胞壁降解酶(cell wall-degrading enzymes,CWDEs)的致病性进行系统研究,并探讨了枯萎病菌毒素在香蕉(Musa spp.)抗病品种选育和抗病性鉴定中的应用,主要研究结果如下:系统研究了香蕉枯萎病菌毒素和CWDEs的体外诱导技术,建立了诱导香蕉枯萎病菌高产毒素镰刀菌酸(fusaric acid,FA)、纤维素酶(cellulase)和多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)的方法。
香蕉枯萎病菌4号小种(F. oxysporum f.sp. cubense race 4)FOCAAA315菌株在改良Czapek B培养液中培养第15 d时FA产量最高,达669.2 mg/L。
在改良Czapek培养液中添加麸皮诱导香蕉枯萎病菌产生纤维素酶效果明显,而添加果胶则能有效诱导产生PG。
β-D-葡萄糖苷酶(BG)和PG具有典型的酶动力学特性。
在反应体系底物P-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)浓度为4.0 mmol/L,温度为60~65℃,pH5.0条件下反应10 min,β-D-葡萄糖苷酶(BG)活性最高;而以柑橘果胶为底物其浓度达到0.5%,反应体系温度50℃,pH5.0条件下反应20 min,PG活性最高。
明确了香蕉枯萎病菌毒素与CWDEs的致病作用。
用香蕉枯萎病菌粗毒素和CWDEs接种于香蕉组培苗,引起的病害症状与病菌孢子侵染引起的病害症状相似。
香蕉枯萎病菌的混合代谢物接种比单独使用粗毒素接种对香蕉组培苗表现更强的致萎作用,说明香蕉枯萎病(Fusarium wilt of banana)发生是病原菌多种致病物质共同作用的结果。
试验结果表明,不同的香蕉品种对病菌致病物质的敏感性存在差异。
香蕉枯萎病菌毒素是一类非专化性毒素,对不同抗性的香蕉品种均具有明显的致病作用,不同香蕉品种对毒素的敏感性程度与田间真实的抗病性无显著相关。
香蕉枯萎病菌4号小种在各培养基上性状比较
福建农林大学学报（ 自然科学版 ）
Байду номын сангаас
第３ ７卷 第 ４期
２０ 年 ７月 ０８
Ｊ ｒ ｌｆ ｕａ ｇｃｌｒ ａｄＦｒ ｔ ｎ ｅ ｉ Ｎｔ ａＳｉ ｃ Ｅｉ ｎ ｏ ｎ ｊ ｎ ｒｕ ｕ ｏ ｓｙＵｉ ｒｔ ａ ｒ ｅ ｅ ｄｉ ） ｕ ａ６ Ｆ ｉ Ａ ｉ ｔ ｅ ｎ ｅｒ ｖ ｓｙ（ ｕ ｌ ｃ ｎ ｔ ｏ
香蕉枯萎病菌 ４号小种在各培养基上性状 比较
陈静华 ，张绍升 （ 建农 林大 学植 物保 护学 院 ， 建 福 州 ３ ０ ０ ） 福 福 ５０２
摘要 ： 通过 Ｋ 、Ｐ 、 Ａ和 Ｐ Ａ等培养基对香蕉枯萎病菌 ４号小种的选择性和鉴别作用进行 比较 ， ２ Ｐ Ａ ＭＢ Ｓ 结果表明 ，２培养基 Ｋ 抑制杂菌 的能力强 ， 适宜香蕉枯萎病菌 ４号小种生长 ， 齿轮状 菌落 是该小种的鉴别特 征． 利用 Ｉ （ ２培养基从 土壤 中检测 出的 菌株在香蕉组培苗上进行致病性测定 ， 确认该菌株为香蕉枯萎病菌 ４号小种． 因此 ， ２培养基 可 以作为香蕉枯萎 病菌 ４号 Ｉ （
Ａｂ ｔ ａ ｔ ｈ ｅｅ ｔ ｉ ｄ ｉｅ ｔ ｃ ｔ ｎ ｏ ２，ＰＰ ｓｒ ｃ ：Ｔ ｅ ｓ ｌｃｉ ｔ ａ ｄ ｎ ｉ ａ ｏ ｆＫ ｖ ｙｎ ｉ ｆ ｉ Ａ，ＭＢ ａ ｄ Ｉ Ａ ｄ ａ ｆｒＦｕ ａ ｉ ｏ ｙｐ ｒ ｍ ｛ Ａ ｎ ３ ｍｅ ｉ ｓ ｒ啪 Ｘ ｏ ｘ ｓｏ ｕ ． ｐ．ｃ ｂ ｎ ｅ ｒ ｃ ｅ ｕ ｅ ｓ ａ ｅ４ ｗ ｒ ｅ ｃ ｍｐ ｒｄ ｈ ｅ ｒ ｓ ｔ ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ２ ｍｅ ａ ａ ｏ ｅ ｈ ｅ ｅｏ ｍｅ ｔｏ ｏ ｙｐ ｒ ｍ ． ｐ ｕ ｅ ｓ ａ ｅ４ ａ ｄ ｆｒ ｄ ｔ ｅ ｌｃｎ ａ ｏ ａｅ ．Ｔ ｅ ｕ ｓ ｈ ｗｅ ｔＫ ｄ ｌ ｗ ｄ ｔ ｅ ｄ ｖ ｌｐ ｎ ｌ ｈ ｉ ｌ ｆ ｘ ｓ ｏ ｕ ｆ ｓ ．ｃ ｂ ｎ ｅ ｒ ｃ ｍｅ ｈ ａ ｉ ｉ－ ｎ ｏ
香蕉枯萎病及其防治研究进展_王振中
香蕉枯萎病及其防治研究进展*王振中(华南农业大学广州510640)摘要香蕉枯萎病(Fusarium o xy s porum.f sp.cubense)是破坏香蕉维管束导致植株死亡的毁灭性病害。
其病菌腐生能力很强,在土壤中可长期存活。
香蕉枯萎病是典型的土传病害,侵染来源主要是带菌的吸芽、病株残体及带菌土壤。
病菌从寄主根部伤口侵入寄主,通过寄主维管束向假茎上部及叶部蔓延。
目前还没有一种理想的防治香蕉枯萎病的化学药剂,与水稻轮作是控制病害的最有效途径。
半个世纪前,香蕉枯萎病菌1号小种几乎摧毁了世界的香蕉产业,现在则由于4号小种的蔓延,香蕉产业又面临新的挑战。
对香蕉枯萎病菌4号小种实施检疫控制是防止枯萎病扩散的关键。
关键词香蕉枯萎病菌4号小种香蕉品种生理小种尖孢镰刀菌中图分类号S432.1,S41香蕉(M us a spp.)是著名的热带和亚热带水果,全球香蕉年产量约1亿,t是世界第二大水果作物,产量仅次于柑桔[1]。
香蕉是许多地区的经济支柱,仅在非洲和亚洲,就有大约5亿人靠香蕉为生[2]。
我国是世界香蕉生产的主要国家之一,2003年种植面积达25.5万h m2左右,产量590多万,t是世界第三大香蕉生产国。
香蕉枯萎病又称香蕉巴拿马病、黄叶病,是破坏维管束导致植株死亡的毁灭性病害,其病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusari u m oxy s p orum.f sp. cubense)。
香蕉枯萎病菌4号小种在亚洲和非洲的部分国家以及澳大利亚发生为害,严重威胁世界第一大香蕉种植品种Cavendish的生存。
Cavendish香蕉于20世纪60年代取代当时大蜜哈(G r os M ichel)而成为世界香蕉第一品种,后者则由于香蕉枯萎病菌1号小种的为害而导致绝产[3]。
因而,4号小种的出现和蔓延,引起各香蕉种植国家的高度关注。
1香蕉枯萎病的发生概况香蕉枯萎病最早于1896年在巴拿马发生,1935 ~1939年在南美洲几个国家大面积爆发,导致90%以上的优质大蜜哈香蕉[G r osM ichel(AAA)]发病,约有43万hm2遭毁,并通过出口传播到全世界。
4个抗枯萎病香蕉品种在广西的抗性及主要性状比较
开展抗病品种的适应性和抗病性评价。本研究拟从现 有抗病香蕉品种中筛 选 出 适 宜 广 西 栽 培 的 品 种,为 优 良抗病品种在广西的示范推广提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验品种 桂蕉1号、GJ2和 南 天 黄 由 广 西 美 泉 新 农 业 科 技
有限公司提供,中蕉4 号 由 广 东 农 科 院 果 树 研 究 所 提 供 ,宝 岛 蕉 由 海 南 蓝 翔 公 司 提 供 ,以 桂 蕉 1 号 为 对 照 品 种。 1.2 试验地点
2 结果与分析
2.1 4个抗病品种的抗性分析 由 表 1 可 知 ,桂 蕉 1 号 的 发 病 率 为 65.5% ,抗 性 表
现为高感;宝岛蕉和 中 蕉 4 号 的 发 病 率 分 别 为 12.8% 和13.0% ,抗 性 表 现 为 抗 ;GJ2 和 南 天 黄 发 病 率 分 别 为 8.0% 、8.8% ,抗 性 表 现 为 高 抗 ;4 个 抗 病 品 种 的 抗 性 效 果均显著优于桂蕉1号。
专 项 (桂 农 科 2018YT20)。 作 者 简 介 :李 小 泉 (1968— ),男 ,副 研 究 员 ,主 要 从 事 香 蕉 等 作 物 遗 传 育 种 方 面 的 工 作 ;E-mail:1941243276@。
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种 子 (Seed)
第38卷 第2期 2019年2月 Vol.38 No.2 Feb. 2019
试验地点位于广西南宁市里建华侨投资区猴山试 验 基 地 ,试 验 地 前 造 香 蕉 的 发 病 率 为49.3% ,土 地 旋 耕 均匀后种 植 香 蕉 组 培 苗。 试 验 采 用 完 全 随 机 区 组 设 计 ,每 处 理 20 株 ,3 次 重 复 ,2016 年 10 月 定 植 ,株 行 距 2m×2.5m,1875 株/hm2,中 等 管 理 水 平,不 做 任 何 香蕉枯萎病防控措施。 1.3 指标测定
香蕉枯萎病拮抗菌的筛选鉴定及其防病效果测定
54卷香蕉枯萎病拮抗菌的筛选鉴定及其防病效果测定杨迪1，杜婵娟1，张晋1，潘连富1，叶云峰2*，付岗1*（1广西农业科学院植物保护研究所/农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室/广西作物病虫害生物学重点实验室，广西南宁530007；2广西农业科学院园艺研究所，广西南宁530007）摘要：【目的】从不同作物的根围土壤中分离筛选香蕉枯萎病菌拮抗菌，对拮抗菌进行鉴定并测定其防病效果，以期为香蕉枯萎病的生物防治提供新的菌种资源。
【方法】以尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种（Fusarium oxysporum f.sp.cubense 4，Foc4）Foc 1402菌株为对象，采用稀释涂布法对不同作物根围土壤中的细菌进行分离，并使用平板对峙法和牛津杯法筛选其中的香蕉枯萎病拮抗菌。
根据细菌菌落形态、生理生化特征结合16S rDNA 序列分析对拮抗菌进行分类鉴定。
使用威廉斯B6香蕉杯苗测定拮抗菌对香蕉枯萎病的盆栽防治效果。
【结果】从不同作物根围分离获得345株细菌，从中筛选获得7株对香蕉枯萎病菌具有较强拮抗活性的菌株，抑菌率最高可达72.65%。
依据形态学观察、生理生化反应和16S rDNA 序列分析结果，菌株Ba02、Ba310、Ba48、Ba62和Ba63被鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens ），菌株Bc11被鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia ），菌株Pt05被鉴定为土地类芽孢杆菌（Paenibacillus terrae ）。
盆栽试验结果显示，7株拮抗细菌对香蕉枯萎病的防治效果在20.00%~68.89%，其中以菌株Bc11的防治效果最好，为68.89%。
【结论】从不同作物的根围土壤中筛选获得7株对Foc 具有较强拮抗活性的细菌，其中，土地类芽孢杆菌为香蕉枯萎病生防菌家族的新成员。
筛选获得的不同种类拮抗菌可作为研制香蕉枯萎病生防菌剂的候选菌株资源，在后续开发抗病复合菌剂方面具有良好的应用前景。
香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种细胞壁降解酶的比较
（ ＭＣ） ｎ ｌｓ ｆ ｓｚｍｅ ｙＩ ＦＰ ＧＥ ｓｏ ｄｔａ Ｆ Ｃ ｏ ｌ ｅｒｔ ｏ ｅＰ ｒ ｔａ Ｏ １ｂ ｔ Ｃ ．Ａ ａ ｉ ｏ ｏｙ ｓｂ Ｅ —Ａ ｈ ｗｅ ｔ Ｏ ４ｃ ｕｄｓｃｅｅ ｎ Ｇ ｍｏｅ ｈ ｎＦ Ｃ ｏｈ ｙｓ ｉ ｈ
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关键 词 ：香蕉 ； 香蕉枯萎病 ； 香蕉枯萎病菌 ； 细胞壁降解酶
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植 物 病 理 学 报
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香 蕉 枯 萎 病 菌 １号 和 ４号 生 理 小 种 细 胞 壁 降 解 酶 的 比 较
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香蕉的毁灭性病害_枯萎病
（7）病株处理。 10%草甘膦原液 10～15 毫升+多菌 灵 2～3 克用针筒注射到植株离地面 1.5 厘米处， 等到 病株枯死后挖除并烧毁，并对于植穴撒石灰消毒。
（8）药剂防治： ①杀虫防病。 使用药剂防治线虫，控制病原菌通 过线虫危害造成的伤口而侵染植株。 ②香蕉枯萎病目前还没有特别的药剂能够有效 控制，只有在发病初期用药液浇灌法对枯萎病的扩展 有抑制作用。 常用药剂有多抗霉素、溴菌腈、恶霉灵、 恶霉灵+溴菌腈。
1 症状
枯萎病在各个生长期都会发病，但幼龄蕉树发病 较少。 症状有两种：
（1）外部症状。 ①叶片倒垂型黄化。 成龄蕉株接近 结果时，下部叶片叶缘先出现特异性黄化，而后逐渐 扩展到中脉，叶面的黄化部分与深绿色部分形成鲜明 对比。 感病的叶片很快倒垂枯萎，由黄色变褐色至干 枯，形成一条倒挂的枯干叶片。 即“一黄二枯三倒挂”。 ②假茎基部开裂型黄化。 病株先从假茎外围近地面的 叶鞘处开裂，由外向内逐渐扩展，层层开裂直到心叶 部位，并且向上扩展，裂口呈褐色干腐，叶片也成特异 性黄化，倒垂枯萎。 即“外皮纵裂内部褐变腐烂”。
!绿色植保
香蕉的毁灭性病害—— —枯萎病
丁丽芬 （云 南 热 带 作 物 职 业 学 院 热 作 系 普 洱 665000）
果农之友 2011 No．6
香蕉枯萎病又称西贡蕉枯萎病， 黄萎病， 是一种毁灭性的土传病 害。 此病最早是在 1874 年澳大 利 亚被发现， 在 1910 年造成巴 拿 马 香蕉极大的损失，故此病又称巴拿 马病。 我国香蕉主产区广东、广西、福 建、海南、云南和台湾均有发生。
（2）内部症状。 此病表现在香蕉的假茎和球茎也 有明显的症状，并有两种情况：
香蕉细菌性枯萎病菌可视化检测体系的建立与探索
香蕉细菌性枯萎病菌可视化检测体系的建立与探索作者：***来源：《农业灾害研究》2023年第09期摘要香蕉枯萎病對香蕉植株具有毁灭性危害，严重制约了世界各地香蕉种植业的发展。
基于此，建立了香蕉细菌性枯萎病菌可视化检测体系，探究了检测体系最佳引物组合、引物浓度、Cas12a浓度，以及可检测到的最低样本浓度。
试验证明，该体系可以在60 min内完成准确的检测，且所需仪器简便，对试验环境和操作人员没有特殊的专业要求，该鉴定方法在植物病原菌的分子定性检测中的潜力较大。
关键词香蕉枯萎病菌；分子鉴定；可视化中图分类号：S436.68 文献标识码：B 文章编号：2095–3305（2023）09–0037-03由尖胞镰刀菌古巴专化型（Fusariumoxysporum f. sp. cubense，简称Foc）引起的真菌性枯萎病（又称之为巴拿马病）会对香蕉造成巨大危害，被认为是“香蕉癌症”。
作为一种维管束病害，香蕉枯萎病最直接的症状表现为叶片枯黄、维管束堵塞、腐烂发黑，维管束的堵塞会使得香蕉植株吸收不到营养，最终导致整株枯死[1]。
香蕉枯萎病菌的致病力极强，该病害严重制约了我国香蕉产业的健康稳定发展。
作为全国香蕉的主产地，广东省受香蕉枯萎病的危害极大[2-5]。
基于此，主要针对广东省的香蕉枯萎病热带4号生理小种菌株构建病菌检测体系。
CRISPR/Cas核糖核酸内切酶系统，如Cas12a、Cas13a和Cas14能够对病原样本进行快速、准确的检测。
Cas12a 具有反式切割活性，可以通过crRNA引导识别目标序列5＇端以Poly-T为前间区序列邻近基序的特异片段（5＇-TTTN-3＇），对体系中的任意单链DNA探针进行无差别切割，从而实现对目标基因的检测。
目前，有很多研究将Cas核糖核酸内切酶与序列扩增方法相结合，开发出SHERLOCK、HOLMES、DETE-CTOR、STOP、opv-CRISPR等高灵敏度和特异性的核酸检测平台，可用于致病病毒和微生物的检测[6]。
香蕉枯萎病菌内源报告基因细胞周期蛋白C1基因FocFCC1的鉴定及分析
热带作物学报2021, 42(11): 3126 3133 Chinese Journal of Tropical Crops收稿日期 2020-03-08；修回日期 2021-04-13基金项目 海南省基础与应用基础研究计划（自然科学领域）高层次人才项目（No. 2019RC269）；国家自然科学基金项目（No. 31661143003）；财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系专项（No. CARS-31-07）。
作者简介 曾凡云（1983—），男，博士，助理研究员，研究方向：植物病理学。
*通信作者（Corresponding author ）：彭 军（PENG Jun ），E-mail ：***************；张 欣（ZHANG Xin ），E-mail ：**************。
香蕉枯萎病菌内源报告基因细胞周期蛋白C1基因FocFCC1的鉴定及分析曾凡云，王艳玮，漆艳香，谢艺贤，张 欣*，彭 军*中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室，海南海口 571101摘 要：本研究克隆鉴定了香蕉枯萎病菌4号生理小种（Foc4）的细胞周期蛋白C1（Fusarium Cyclin C1，FCC1）基因FocFCC1，采用Split-marker 同源重组技术获得基因敲除突变体ΔFocFCC1，通过比较突变体和野生菌株在生长速度、产孢量和致病力等方面的差异，探索了FocFCC1基因缺失对香蕉枯萎病菌生物学功能的影响，并评估了FocFCC1作为枯萎菌内源报告基因的可行性。
结果表明：与Foc4野生型菌株相比，ΔFocFCC1菌丝生长缓慢、菌丝畸形及产孢量减少，对巴西蕉苗的致病力明显减弱，推测FocFCC1基因在Foc4的生长发育、产孢及致病力等方面具有重要作用。
以FocFCC1为靶标基因，评估了两种基因敲除重组方法介导的基因敲除效率，利用红色表型作为判断依据，挑取再生板上有红色表型的转化子进行PCR 检测，Split-marker 重组方法获得阳性转化子比例为91.7%，而多片段装配融合方法获得阳性转化子的比例为64%。
香蕉枯萎病防治技术
香蕉枯萎病防治技术作者：陈瑶瑶刘付玉俊来源：《乡村科技》2019年第15期[摘要] 香蕉枯萎病也被称为黄叶病、巴拿马疫病，是香蕉的毁灭性病害，目前已在我国广东、海南、广西等省区扩散蔓延，对香蕉产业造成沉重的打击。
该病具有传染性强、破坏大、治理难度大等特点，是世界性研究课题。
本文总结一套有效的香蕉枯萎病综合防治技术，以供参考。
[关键词] 香蕉;枯萎病;综合防控[中图分类号] S436.68 [文献标识码] B [文章编号] 1674-7909（2019）15-90-2香蕉枯萎病也被称为黄叶病、巴拿马病，是由一种半知菌侵害香蕉马尼拉麻的导管而引起的香蕉病害。
香蕉枯萎病传染性强、破坏大、很难得到有效治理，被形象地比喻为“香蕉癌症”或者“香蕉艾滋”。
目前，香蕉枯萎病已在我国广东、海南、广西等省区扩散蔓延，对香蕉产业造成沉重的打击。
1 病原菌香蕉枯萎病是由一种由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）侵害香蕉尼拉麻导管而引起的病害。
目前，香蕉枯萎病已发现有4个生理小种，第1小种为害大密啥、龙牙蕉类和粉蕉类，第2生理小种为害大蕉类，第3生理小种为害蝎尾蕉科蝎尾蕉属，第4生理小种为害包括香牙蕉在内的500多种香蕉，其中能侵染香牙蕉的4号热带小种包含近百个变异小种，是危害香蕉产业最大的生理小种。
2 传播途径2.1 土壤尖孢镰刀菌是一种土壤习居菌，香蕉枯萎病俗称土壤传染性病害。
该病菌在土壤中可存活8～10 a，若土壤条件适宜，可存活20 a。
土壤是该病菌传播的主要途径之一。
2.2 苗木种植带病的吸芽，用带病的蕉茎作试管苗的培养基，且消毒不彻底，种苗将病菌直接带入大田。
2.3 流水利用流水经过发病的蕉园或富含病菌的土壤或浸泡有病株的水源进行灌溉。
2.4 农具农用机械、锄头等农具交叉带菌。
2.5 农事操作鞋子带病土，清除蕉芽时的用具交差感染。
3 发病条件香蕉枯萎病是一种土传性的维管束病害，带病蕉苗和病土是初侵染源。
香蕉枯萎病致病菌尖孢镰刀菌4号生理小种micro-like RNA及其靶标基因的鉴定
香蕉枯萎病致病菌尖孢镰刀菌4号生理小种micro-like RNA及其靶标基因的鉴定李静宇1，许林兵2，应帆1，肖维强2，陈谷1（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）（2.广东省农业科学院果树研究所，广东广州 510640）摘要：香蕉枯萎病已严重威胁香蕉产业的发展，为了分析香蕉枯萎病菌尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种（Fusarium oxysporum F. sp. cubense race 4，Foc4）中miRNA-like（milRNA）及其调控功能，本研究构建了3个Foc4菌丝小RNA测序文库，测序得到原始数据11783990条，其中可用于后续milRNA鉴定的有效数据3351578条，通过与miRbase中植物miRNA和已报道的真菌milRNA 进行比对，共预测出7个保守的和3个新型的milRNA。
进而利用降解组测序预测milRNA靶基因，共预测出53对milRNA-mRNA。
通过对靶基因进行GO和KEGG富集分析，发现milRNA与多个代谢通路有关，包括嘌呤代谢，甘油磷脂代谢，硫胺素代谢和三羧酸循环通路等，对真菌生长发育有重要影响；同时发现milRNA靶向ABC转运器CDR4和孢子壁成熟蛋白DIT1，可能对Foc4致病过程具有重要影响。
本研究在高通量测序获得milRNA的基础上，首次在香蕉枯萎病致病菌Foc4中利用降解组测序分析了milRNA 靶基因，对研究真菌milRNA调控提供了重要参考，也为香蕉枯萎病的防治提供了新的思路。
关键词：香蕉枯萎病菌4号生理小种；milRNA；降解组测序文章篇号：1673-9078(2021)02-56-63 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2021.2.0300 Identification of Micro RNA-like RNAs and Their Target Genes fromFusarium oxysporum F. sp. cubense Race 4LI Jing-yu1, XU Lin-bing2, YING Fan1, XIAO Wei-qiang2, CHEN Gu1(1.School of Food Sciences and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)(2.Institute of Fruit Tree Research, Guangdong Academy of Agriculture Sciences, Guangzhou 510640, China)Abstract: Fusarium wilt has seriously threatened the development of the banana industry. In order to analyze the miRNA-like (milRNA) and its regulatory function in the Fusarium oxysporum F. sp. cubense race 4 (Foc4), three Foc4 mycelia small RNA sequencing libraries were constructed. Totally 11,783,990 raw reads were obtained by sequencing, of which 3,351,578 valid reads can be used for subsequent milRNA identification. Through the comparison with the plant miRNAs in miRbase and the reported fungal milRNAs, seven conservative milRNAs and three novel milRNAs were identified. A total of 53 pairs of milRNA-mRNAs were identified through degradome sequencing to predict milRNA target genes. Through GO and KEGG enrichment analysis of target genes, milRNA was found in association with multiple metabolic pathways, including purine metabolism, glycerophospholipid metabolism, thiamine metabolism, and tricarboxylic acid cycle pathways, and would have an important impact on fungal growth and development. In the meantime, milRNA targeted the ABC transporter CDR4 and spore wall mature protein DIT1, thereby probably influencing the pathogenic process of Foc4. This study is the first to analyze milRNA-targeted genes in the pathogen Foc4 via degradome sequencing after milRNA was obtained by high-throughput sequencing, which provides an important reference 引文格式：李静宇,许林兵,应帆,等.香蕉枯萎病致病菌尖孢镰刀菌4号生理小种micro-like RNA及其靶标基因的鉴定[J].现代食品科技,2020, 37(2):56-63LI Jing-yu, XU Lin-bing, YING Fan, et al. Identification of micro RNA-like RNAs and their target genes from Fusarium oxysporum F. sp. cubense race 4 [J]. Modern Food Science and Technology, 2020, 37(2): 56-63收稿日期：2020-04-01基金项目：广东省公益研究与能力建设专项资金项目（2015B020202005）；广州市科技计划项目基础与应用基础研究项目(202002030051)作者简介：李静宇（1995-），女，硕士研究生，研究方向：功能基因组学通讯作者：陈谷（1973-），女，博士，教授，研究方向：功能基因组学56for studying the regulatory functions of fungal milRNA and new ideas for the prevention and treatment of Fusarium wilt.Key words:Fusarium oxysporum F. sp. cubense race 4; milRNA; degradome sequencing香蕉枯萎病（也称为巴拿马病）是由真菌尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum F. sp. cubense，Foc）引起的土传性真菌流行病害，可造成香蕉枯萎黄化甚至死亡，严重威胁香蕉产业的发展[1,2]。
香蕉“枯萎病”为什么这么难治？关键是看这几点
香蕉“枯萎病”为什么这么难治？关键是看这几点一、香蕉枯萎病发生历史及现状香蕉枯萎病称香蕉巴拿马病、香蕉镰刀菌枯萎病、黄叶病，是全球香蕉最重要的毁灭性土传病害之一。
目前，全世界几乎所有香蕉种植区均有香蕉枯萎病发生。
已经有法国科学家警告,香蕉巴拿马病和香蕉叶斑病有可能使种植香蕉的园地夷为平地。
香蕉枯萎病的世界性分布我国香蕉枯萎病的发生情况大陆：上世纪50-60年代，广西粉蕉，发现1号小种危害。
台湾：1967，首次发现4号小种危害香蕉品种，引起严重的枯萎病(黄叶病)。
上世纪70年代大流行，香蕉大面积枯死、失收，台湾香蕉产业受到了极大的影响。
广东：1996年，我省在广州番禺（万顷沙）首次发现香蕉枯萎病4号小种危害香牙蕉（枯萎病）。
由于对此病认识不足，未能及时采取措施控制，病害通过种苗和流水等传染途径扩散至中山、珠海、东莞、肇庆、信宜、江门、茂名、湛江、汕头、揭阳等地，每年以30—50公里速度传播，使许多蕉园不能种植香蕉，对我国香蕉种植业构成了严重的威胁。
目前，该病在广东、广西、海南、福建等省（区）都有分布，有些地方发生较为严重。
湛江香蕉枯萎发生情况：2005年首次在硇洲岛发现，同期湖光镇也出现，2006年左右传入廉江、徐闻等地，现湛江各香蕉种植区均有发生。
我国香蕉枯萎病分布图二、香蕉枯萎病的症状香蕉枯萎病（黄叶病）为镰刀菌（真菌）引起的维管束病害。
为害症状：从苗期到成株期都能染病，以抽蕾期症状表现明显。
病株开始是在下层叶片及靠外的叶鞘变黄色，先从叶片基部逐渐向上、或从叶缘向中脉逐渐变黄，以后整张叶片变黄、凋萎、下垂，由黄变褐色干枯。
有些叶片未变黄即下垂、或虽发黄但不下垂，有的病株是心叶坏死，基部的假茎纵裂，整株叶片均凋萎下垂。
维管束呈黑褐色。
叶部症状：叶片发黄，叶柄基部折曲、下垂严重发病的田块2、内部症状该病是一种维管束病害，切开病株假茎或球茎，可见维管束变成褐色，越近茎基部颜色越深。
保湿两天可见白色的菌丝体三、病原菌1、病原菌的名称：该病由一种叫做尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense) 的真菌所引起。
香蕉枯萎病综合防控技术探究
香蕉枯萎病综合防控技术探究作者：周伟芬陈晓兰刘志红来源：《农家科技》2020年第04期摘要：枯萎病是香蕉种植栽培中常见的疾病之一，本文对香蕉枯萎病的症状以及发病规律进行了简单介绍，并对如何有效的防控该病的发生进行了讨论，对相应的综合防治技术进行了研究和探索，希望能够为香蕉的种植栽培起到一些帮助作用。
关键词：香蕉;枯萎病;综合防控香蕉枯萎病又被称为黄叶病、巴拿马病，是香蕉种植栽培中的一种毁灭性土传病害，该病具有传染性强、破坏性大、治理难度高等特点，因此又被称为“香蕉癌症”或“香蕉艾滋”。
该病的发生往往会导致大量的香蕉园失收、荒废或改种，给种植户和香蕉产业造成极大地损失。
一、香蕉枯萎病的症状当香蕉感染枯萎病后，其初期表现为下层叶片及外侧叶片的叶鞘变黄，然后沿叶片基部逐渐向上、向内变黄，直至整个叶片转为黄色并表现出凋萎、下垂等症状。
随着病情进一步发展，叶片会由黄转褐色或干枯。
部分叶片在变黄后可不发生下垂，部分叶片没有变黄依然可出现下垂，此外还有部分叶片可能会表现为心叶坏死、基部假茎纵裂、维管束呈黑褐色等症状。
二、香蕉枯萎病的发病规律（一）致病菌尖孢镰刀菌古巴专化型真菌是导致枯萎病的主要病菌，其通过侵入香蕉的尼拉麻导管而造成发病。
该病菌目前已知种类有四种，分别对会不同的香蕉种类造成影响，第一种，生理小种为害大密啥、龍牙蕉类和粉蕉类;第二种，生理小种为害大蕉类;第三种，生理小种为害蝎尾蕉科蝎尾蕉属;第四种，生理小种为害香牙蕉等500余种香蕉种类，同时第四种生理小种还具有近百种变异小种，是危害最大的生理小种。
该病菌在冬夏两季主要以厚垣孢子的形式存在，其对不良环境有着较强的适应性和抵抗力，及时没有宿主也可存活较长时间。
（二）发病条件香蕉枯萎病病菌主要从植株的根尖、球茎上的表面伤口侵入，随后病菌繁殖并经过维管束向块茎扩散，在病菌繁殖的同时还会分泌毒素形成胶质或侵填体，对香蕉的维管束组织造成堵塞，进而导致维管束组织褐化，并出现叶片发黄、下垂、干枯以及假茎基部向内纵裂、块茎腐烂、植株死亡等现象。
香蕉枯萎病菌4号生理小种smy1基因的功能分析
香蕉枯萎病菌4号生理小种smy1基因的功能分析作者：何壮漆艳香曾凡云丁兆建梁峻玮张欣彭军谢培兰谢艺贤来源：《热带作物学报》2019年第12期摘; 要; Smy1是一种参与调控真菌生长的驱动蛋白。
本研究克隆了香蕉枯萎病菌4号生理小种（Foc 4）驱动蛋白基因smy1，并采用同源重组技术获得smy1敲除的野生型Foc 4的smy1敲除突变体。
通过测定突变体菌丝形态、生长速度、产生孢子量、对香蕉苗的致病力及对氰烯菌酯的敏感性，用于研究smy1在香蕉枯萎病菌的生长发育及对氰烯菌酯抗药性中的作用。
结果表明，与野生型Foc 4相比，smy1敲除突变体生长缓慢、菌丝畸形、产孢量增加，对巴西蕉苗的致病力减弱，但对氰烯菌酯的抗性水平变化不大。
由此推断smy1基因可能在Foc 4的生长发育、产孢以及致病力等方面具有重要作用。
关键词; 香蕉枯萎病菌;基因敲除;致病力;smy1基因中图分类号; S436.681; ; ; 文献标识码; AEffects of smy1 Gene Knockout on Physiological Function of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4HE Zhuang1，2， QI Yanxiang2， ZENG Fanyun2， DING Zhaojian2， LIANG Junwei1，2， ZHANG Xin2， PENG Jun2， XIE Peilan2， XIE Yixian2*1. Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China;2. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， ChinaAbstract; Smy1 is a kinesin involved in the regulation of fungal growth. In the study， the smy1 kinesin gene of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4 （Foc 4） was cloned. The smy1 knockout mutant of Foc 4 was obtained by homologous recombination technique. Besides observing the mycelial morphological characteristic， growth rate and sporulation of the mutants， pathogenicity to banana seedlings and sensitivity to fungicide were studied in order to reveal the role of smy1 played in the growth and development of F. oxysporum and resistance to fungicide. The results showed that，compared with the Foc 4 wild-type strain， the knockout mutants grew slowly， the mycelial morphology changed， the sporulation increased， and the pathogenicity to banana plantlets seedlings decreased， but the resistance level to fungicide changed little. This indicates that the smy1 gene may play an important role in the growth， sporulation and pathogenicity in Foc 4.Keywords; Fusarium oxysporum; gene knockout; pathogenicity; smy1 geneDOI; 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.019香蕉枯萎病又称香蕉巴拿马病，属于检疫性病害，它的病原菌是尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense），是一种毁灭性土传病害，在热带、亚热带地区广泛传播，香蕉产业也曾因其造成巨大的经济损失[1]，目前还没有任何单一的生物或者化学药剂可以长期有效控制香蕉枯萎病。
香蕉抗枯萎病生理生化基础的研究
香蕉抗枯萎病生理生化基础的研究香蕉镰刀菌枯萎病是一种由土壤真菌引起的毁灭性病害,特别是香蕉枯萎病4号生理小种目前正严重危害世界香蕉的生产,从而引起广泛关注。
本试验以金手指(抗病)、威廉斯芽变(抗病)、1282(耐病)、威廉斯(感病)、天宝(感病)5个不同抗性香蕉品种(系)为试材,研究接种枯萎病菌后各香蕉品种(系)假茎部位发生的生理生化变化,以初步探讨香蕉抗枯萎病的生理生化机制。
结果如下:1、香蕉各品种(系)在生长发育阶段4中防御酶(PPO、POD、PAL、SOD)及β-1,3葡聚糖酶的酶活性变化不大处在动态平衡之中。
2、抗病品种(系)在接菌处理后多酚氧化酶(PPO)活性普遍增强。
而感病品种(系)多酚氧化酶(PPO)变化缓慢。
被枯萎病菌感染后香蕉抗病品种(系)多酚氧化酶(PPO)活性极显著高于感病品种(系)。
多酚氧化酶(PPO)初步认为参与了香蕉抗枯萎病反应。
3、接种枯萎病菌后,香蕉各品种(系)苯丙氨酸解氨霉(PAL)和过氧化物酶(POD)活性均上升。
抗病品种(系)的苯丙氨酸解氨霉(PAL)和过氧化物酶(POD)活性增高的速度和峰值都大于感病品种。
说明香蕉品种(系)接种后PAL和POD活性变化与香蕉枯萎病菌的抗性之间有密切关系。
4、接种枯萎病菌后不同抗感品种(系)香蕉超氧化物歧化酶(SOD)活性均受影响。
在接菌处理后,抗病品种SOD活性有提高,而感病品种(系)SOD酶活性无规律。
所以SOD酶是否参与了香蕉抗枯萎病的反应还有待于进一步研究。
5、抗感品种(系)未接种处理的β-1,3葡聚糖酶活性差异不大,但在接菌处理后,β-1,3葡聚糖酶活性均发生变化。
都是先下降,后上升趋势。
但抗病品种(系)的β-1,3葡聚糖酶活性上升的速度和幅度显著高于感病品种(系)。
可以初步认为β-1,3葡聚糖酶参与香蕉对枯萎病的抗病反应。
6、香蕉各品种(系)在生长发育阶段木质素含量有明显差异,抗病品种(系)高于感病品种(系)。
枯萎病能诱导香蕉假茎中木质素的积累,但其诱导的速度和强度在抗病品种(系)和感病品种(系)间有明显差异。
2种植物病原线虫和香蕉枯萎病菌4号小种对香蕉的复合致病作用的开题报告
2种植物病原线虫和香蕉枯萎病菌4号小种对香蕉的
复合致病作用的开题报告
香蕉是全球一种非常重要的水果，在世界许多地区都是人们日常生
活的重要组成部分。
但是，香蕉生产受到了很多有害生物和病害的威胁，其中最严重的是香蕉枯萎病。
随着人口的增加，对香蕉的需求也越来越大，因此研究和控制香蕉病害的工作变得越来越重要。
本研究主要研究
了两种植物病原线虫和香蕉枯萎病菌4号小种对香蕉的复合致病作用，
下面是该开题报告的具体内容：
1.研究背景和意义
香蕉枯萎病是由一种叫做Fusarium oxysporum f.sp.cubense的真菌引起的病害，可以导致香蕉植株的死亡。
这种病菌以及其他病原体与线
虫也会加重香蕉的病情，因此对它们的控制和了解成为了十分重要的问题。
2.研究内容和方法
本研究将选取两种植物病原线虫Meloidogyne incognita和Pratylenchus coffeae以及香蕉枯萎病菌4号小种，通过通过感染香蕉植
株的方式研究它们对香蕉植株的复合致病作用。
研究方法包括根系损伤、内部结构变化观察、生长情况观察等多参数分析技术。
3.预期结果
预期得到的结果是各种病原体及其复合感染的效果分析，包括对香
蕉植株的发育状况，内部病害症状，生物学特征等多个方面的分析，以
此为基础评估复合致病作用的严重程度。
4.研究意义
本研究将为香蕉病害的治理和控制提供更加详细和准确的信息，可
以帮助生产者更好的防治植物病害，为推动全球水果生产提供有力支撑。
同时，本研究也将为研究相关微生物种的分布，致病机制等研究提供有益参考。
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第３６卷第３期２０１７年 ５月华 中 农 业 大 学 学 报Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＶｏｌ．３６ Ｎｏ．３Ｍａｙ ２０１７，３２～３７收稿日期：２０１６－０８－０３基金项目：国家现代农业（香蕉）产业技术体系建设专项（ＣＡＲＳ－３２）舒灿伟，博士，讲师．研究方向：植物病原真菌及真菌病害．Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｊｕｃａｎｗｅｉ＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ通信作者：周而勋，博士，教授．研究方向：植物病原真菌及真菌病害．Ｅ－ｍａｉｌ：ｅｘｚｈｏｕ＠ｓｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ香蕉枯萎病菌４个生理小种生化特征的比较舒灿伟 张源明 曾 蕊 周而勋广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室／华南农业大学农学院，广州５１０６４２摘要 为研究香蕉枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃｕｂｅｎｓｅ）生理小种之间的差异，对该菌的细胞壁降解酶、酯酶同工酶和可溶性蛋白进行测定和分析，结果表明：在４个生理小种中均能检测到４种细胞壁降解酶（ＰＧ、ＰＭＧ、Ｃｘ和ＦＰＡ）。
其中４号生理小种的ＰＭＧ和Ｃｘ酶活性最高，且国外的１号和４号生理小种菌株的Ｃｘ酶活性比国内同种生理小种菌株的高；国内１号生理小种的ＦＰＡ酶活性最低，其他小种的酶活性差异不显著；同一生理小种国内外菌株的ＰＧ酶活性差异不显著；４个生理小种的酯酶同工酶和可溶性蛋白电泳图谱差异较大，聚类分析表明致病力相近的菌株聚在同一分枝上，亲缘关系较近。
关键词 香蕉枯萎病菌；生理小种；细胞壁降解酶；酯酶同工酶；可溶性蛋白中图分类号 Ｓ ４３６．６７ 文献标识码 Ａ 文章编号 １０００－２４２１（２０１７）０３－００３２－０６ 香蕉枯萎病又称巴拿马病（Ｐａｎａｍａ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆｂａｎａｎａ），是在世界范围内分布最广、毁灭性最强的植物病害之一［１］，该病已广泛分布于亚洲、非洲、澳大利亚、南太平洋及热带美洲的香蕉产区［２］。
作为国际植物病害检疫对象之一，香蕉枯萎病给香蕉种植国的香蕉进出口贸易带来了严重的经济损失。
香蕉枯萎病的病原菌为尖镰孢古巴专化型（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃｕｂｅｎｓｅ，简称Ｆｏｃ），该菌可侵染香蕉根系和假茎，堵塞输导组织，使罹病植株表现黄叶症状，香蕉一旦罹病将全株死亡。
据报道，该病菌目前有４个生理小种［３］。
１号生理小种呈世界性分布，对大蜜啥（Ｇｒｏｓ Ｍｉｃｈｅｌ）、Ａｐｐｌｅ和Ｓｉｌｋ等香蕉品系的侵染力最强；２号小种在中美洲可侵染三倍体杂种煮食蕉和某些Ｊａｍａｉｃａ四倍体蕉等；３号生理小种被报道能危害野生羯尾蕉属（Ｈｅｌ－ｉｃｏｎｉａ ｓｐｐ．）植物；４号小种的毁灭性最大，能侵染大蜜啥、矮香蕉和Ｃａｖｅｎｄｉｓｐｈ品系［４］。
这４个生理小种不仅在寄主品种和致病性方面差异很大，而且在分布范围上也具有区域性。
我国分布有１号和４号这２个生理小种［５－６］，２号和３号小种在我国尚未见报道。
目前人们对香蕉枯萎菌的致病因子进行了较多的研究，这些致病因子包括细胞壁降解酶［７－８］、土壤理化因素［９］、毒素［１０］和激素［１１－１２］等。
细胞壁降解酶可降解植物细胞壁初生壁和次生壁中的多糖成分，从而破坏细胞壁，或使细胞分离，组织溃散［１３］。
王琪［８］的研究结果表明，４号生理小种分泌的细胞壁降解酶对粉蕉、巴西香蕉和大蕉假茎有明显的浸解作用，而１号小种的细胞壁降解酶只对粉蕉组织起作用。
董章勇等［７］测定了粉蕉、巴西蕉和大蕉在受到４号和１号生理小种侵染后细胞壁降解酶活性，结果表明这些香蕉品种均能产生细胞壁降解酶，该研究还比较了不同的碳源培养条件下香蕉枯萎菌１号和４号小种分泌细胞壁降解酶和酯酶同工酶的差异。
在真菌中，同工酶和可溶性蛋白也被广泛应用于种间和种内分析［１４－１５］，真菌的不同致病类型与酯酶同工酶有着较为密切的关系［１６－１７］。
因为蛋白是基因的外在表达产物，在某种程度上可看作是对结构基因的分析。
但对于香蕉枯萎病菌的４个生理小种，尚未有这方面的报道。
因此，为明确香蕉枯萎病菌４个生理小种的生化差异，本研究以香蕉枯萎菌４个生理小种为材料，对其细胞壁降解酶、酯酶同工酶、可溶性蛋白和滤纸酶进行比较分析，旨在为该病菌的致病机制研究和生理小种的分类鉴定提供重要的生化依据。
DOI:10.13300/ki.hnlkxb.2017.03.006 第３期舒灿伟等：香蕉枯萎病菌４个生理小种生化特征的比较 １ 材料与方法１．１ 真菌菌株（小种）和试剂供试菌株（小种）如下：ＷＧ０２（１号小种）、ＷＧ０３（２号小种）、ＷＧ０４（３号小种）和ＷＧ０５（４号小种），这４个菌株（小种）均来自澳大利亚，由澳大利亚Ｂｅｎｔｌｅｙ博士提供；Ｚ１３（４号小种）、Ｚ１４（１号小种）、Ｚ１５（１号小种）和Ｚ１６（４号小种），这４个菌株来自中国，由笔者所在研究室姜子德教授提供。
所用的试剂均为分析纯级，购自北京鼎国昌盛有限公司。
１．２ 细胞壁降解酶液的制备真菌培养采用改良的Ｍａｒｃｕｓ液体培养基［１８］。
将５块直径为５ｍｍ的菌丝块接种到５０ｍＬ培养基中，２８℃下静止培养６ｄ后过滤掉菌丝，在４℃下以１５ ０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，所得上清液即为粗酶液。
粗酶液加入硫酸铵至饱和度为６０％后在４℃静止过夜，然后在４℃下，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ后弃上清液。
所得沉淀用５０ｍｍｏｌ／Ｌ的醋酸－醋酸钠缓冲液（ｐＨ ５．０）溶解后在４℃透析２ｄ，每隔１２ｈ换１次透析液，即得到细胞壁降解酶液。
１．３ 细胞壁降解酶活性的测定１）纤维素降解酶（Ｃｘ）。
取１．０ｍＬ酶液加入等体积的５０ｍｍｏｌ／Ｌ柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液（ｐＨ ５．０），再加１．０ｍＬ羧甲基纤维素钠盐溶液（ＣＭＣ，１．０％，Ｖ／Ｖ），然后在５０℃酶解３０ｍｉｎ后立即加入１．５ｍＬ二硝基水杨酸（ＤＮＳ）终止反应，沸水浴１０ｍｉｎ后用流水冷却，再加５．５ｍＬ的蒸馏水，稀释冷却后在５４０ｎｍ处测定其酶活性。
对照试验除在终止反应后才加入底物外，其余操作同上。
ＣＸ的酶活性单位为５０℃下每小时每毫升细胞壁降解酶液催化底物（ＣＭＣ）释放１μｇ还原糖所需的酶量（Ｕ／ｍＬ）。
试验设计３次重复。
２）多聚半乳糖醛酸酶（ＰＧ）。
取０．５ｍＬ酶液加入等体积０．２５％ＰＧ溶液后再加入１．０ｍＬ的蒸馏水，然后在５０℃条件下酶解１ｈ后加入２．５ｍＬＤＮＳ终止反应，在沸水浴中孵育１０ｍｉｎ后用流水冷却，再加５．５ｍＬ蒸馏水稀释，酶活测定和重复次数同本文“１．３”中１）。
３）果胶甲基半乳糖醛酸酶（ＰＭＧ）。
取０．５ｍＬ酶液加入等体积０．２５％果胶溶液，再加１．０ｍＬ蒸馏水后于５０℃酶解１ｈ后加入２．５ｍＬ ＤＮＳ终止反应，沸水浴１０ｍｉｎ后取出冷却，再加５．５ｍＬ蒸馏水稀释，酶活测定和重复次数同本文“１．３”中１）。
４）滤纸酶（ＦＰＡ）。
参考李宝聚等［１９］的方法，取０．５ｍＬ酶液加入１．５ｍＬ的５０ｍｍｏｌ／Ｌ柠檬酸缓冲液（ｐＨ ４．５）和一片大小为１ｃｍ×６ｃｍ的滤纸条（新华１号定量滤纸，５０±０．５ｍｇ），５０℃孵育１ｈ后加入１．５ｍＬ ＤＮＳ终止反应，沸水浴１０ｍｉｎ后取出冷却，再加入６．５ｍＬ蒸馏水稀释，酶活测定和重复次数同本文“１．３”中１）。
５）酯酶同工酶的定性分析。
用直径为５ｍｍ的打孔器从菌落边缘打取５块菌丝块，接种到１００ｍＬＰＤＢ培养基中，在室温条件下以１２０ｒ／ｍｉｎ的转速连续培养７ｄ后收集菌丝，加入１∶２（质量比）的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲溶液（ｐＨ ６．９）后冰浴研磨，在４℃下以１２ ０００ｒ／ｍｉｎ转速离心２０ｍｉｎ，弃掉沉淀物。
酯酶同工酶的电泳和染色参考许广波等［２０］的方法。
６）可溶性蛋白的测定。
用于提取可溶性蛋白的菌丝培养参照车建美等［２１］的方法。
将１ｇ冷冻菌丝加入液氮充分研磨成粉状，然后转入１．５ｍＬ的离心管中，加入６００μＬ的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ６．８）充分混匀，于４℃放置过夜，然后在４℃下以１０ ０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，所得上清即为可溶性蛋白溶液。
将可溶性蛋白酶溶液稀释１０倍后测量其ＯＤ５９５ｎｍ值，结合可溶性蛋白的标准曲线，即可求出各试验样品的可溶性蛋白浓度［２２］。
７）数据分析。
本研究所有数据分析使用ＳＰＳＳ１３．０软件，方差分析使用ＤＭＲＴ法进行。
２ 结果与分析２．１ 细胞壁降解酶的测定结果１）不同生理小种Ｃｘ酶活性的比较。
从图１可看出，不同小种和同一小种不同菌株在纤维素酶活水平上都有差异：１号小种（ＷＧ０２，Ｚ１４和Ｚ１５）和４号小种（ＷＧ０５，Ｚ１３和Ｚ１６）的Ｃｘ酶活性整体上高于２号小种（ＷＧ０３）和３号小种（ＷＧ０４）；国外的１号小种（ＷＧ０２）和４号小种（ＷＧ０５）的Ｃｘ酶活性均高于国内的同一小种的菌株（Ｚ１４和Ｚ１５，Ｚ１３和Ｚ１６），而且差异显著。
２）不同生理小种ＰＧ酶活性的比较。
从图２可看出，来自国内外的４个生理小种共８个菌株的ＰＧ酶活性在数值上存在少许的差异，但总体来说差异不显著。
其中２号生理小种（ＷＧ０３）的酶活性为２０．２Ｕ／ｍＬ，浓度最高；４号生理小种（ＷＧ０５和Ｚ１３、Ｚ１６）的酶活性（２０．０、２０．０、１９．９Ｕ／ｍＬ）略高于１号生理小种（ＷＧ０２和Ｚ１４、Ｚ１５）的酶活性（１９．８、３３ 华中农业大学学报第３６卷 １９．７、１９．８Ｕ／ｍＬ）；而３号生理小种（ＷＧ０４）的酶活性最低，约为１９．５Ｕ／ｍＬ。
ＷＧ０２、ＷＧ０３、ＷＧ０４和ＷＧ０５分别为国外的１～４号生理小种菌株；Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５和Ｚ１６分别为国内的４、１、１和４号生理小种菌株。
下同。
ＷＧ０２，ＷＧ０３，ＷＧ０４ａｎｄ ＷＧ０５ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｔｈｅ ｉ－ｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｒａｃｅｓ １－４ｆｒｏｍ ａｂｏａｒｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ｚ１３，Ｚ１４，Ｚ１５ａｎｄＺ１６ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｒａｃｅｓ ４，１，１ａｎｄ ４ｆｒｏｍ ｄｏｍｅｓｔｉｃ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ ｂｅｌｏｗ．图１ 香蕉枯萎病菌不同生理小种的Ｃｘ酶活性Ｆｉｇ．１ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｃｘ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ４ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒａｃｅｓ ｏｆＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃｕｂｅｎｓｅ图２ 香蕉枯萎病菌不同生理小种的ＰＧ酶活性Ｆｉｇ．２ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＰＧ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ４ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒａｃｅｓｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃｕｂｅｎｓｅ ３）不同生理小种ＰＭＧ酶活性的比较。
由图３可知，国内外的１号小种和４号小种的所有菌株的ＰＭＧ酶活性约为国外的２号和３号小种的２倍而且差异显著；而１号小种和４号小种的ＰＭＧ酶活性在１２．０～１６．２Ｕ／ｍＬ之间，差异不显著。