副猪嗜血杆菌hhdB-A基因的鉴定和分析

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试析副猪嗜血杆菌病的诊断和治疗

随着我国养猪行业的日益发展，副猪嗜血杆菌病在世界各地的猪场都有出现。

由于养殖场环境恶劣以及饲养技术水平的落后，猪群发生疫病的现象十分常见，许多猪都出现呼吸破促、日益消瘦、皮肤泛红等现象，这些现象被临床诊断为副猪嗜血杆菌病。

本文将此病的临床现象、诊断和治疗情况介绍如下。

一、临床诊断副猪嗜血杆菌病多存在于幼猪，可经过呼吸道、消化道传染，在养猪场里，只要有病猪存在,便使副猪的死亡率大大增大，这为养猪厂带来巨大的损失。

副猪嗜血杆菌病多数存在于养殖厂中，副猪的呼吸道以及消化道也时常存在此病菌。

当猪的身体状况良好时，病菌不会致病；但当猪的免疫力低下时，病菌便会大量繁殖，导致临床现象的出现。

此病主要与以下几个因素有关：（1）养殖场饲养员喂养的饲料营养不均衡，缺少水分。

（2）饲养环境恶劣，不通风，阴冷潮湿或高温高压，饲养密度大。

（3）不合理的阉割注射，断奶以及长途运输等。

副猪嗜血杆菌病多在幼猪的保育时，虽然幼猪刚进入保育时十分活跃，但是半个月后便出现相应症状，主要变现在：体温过高，大约在42℃。

食欲不振，精神萎靡。

随着时间的推移病情加剧，咳嗽声音不断，鼻孔出现脓状分泌物，眼睑水肿，有时突然死亡。

有些病猪关节肿痛，行动不便，皮肤潮红。

随着病情加重，病猪多见厌食的症状，呼吸不便，日益消瘦，时有便秘现象，最后因衰竭而死亡。

患有此病的母猪产期延长，多见便秘现象，多有流产现象，产后无奶或少奶。

生出的小猪身体弱小，时常高烧、发病，呼吸困难，最后因衰竭而死亡。

副猪嗜血杆菌病的剖检变化如下：关节疼痛，心肌炎，脑膜炎，时常渗出纤维素。

对此病猪剖检时，其腹腔有红色腹水，胸腔大量积水，肺萎缩，腹部淋巴肿大。

副猪嗜血杆菌病时常有高烧现象，呼吸急促，皮肤红肿的症状，因此多被误诊为蓝耳症。

蓝耳症经常出现母猪流产以及许多难以繁殖的现象。

而副猪嗜血杆菌病多出现于四个月以内的幼猪。

此病的高烧现象以及呼吸道现象时常被误诊为流行性感冒。

而副猪的流感常见于春季以及冬季，并且一周便可以自愈，几乎不会有死亡现象。

副猪嗜血杆菌病原的分离鉴定和药敏试验

副猪嗜血杆菌病原的分离鉴定和药敏试验在规模化集约化猪场内，副猪嗜血杆菌病时有发生，表现为多发性浆膜炎和关节炎，主要感染断奶前后和保育阶段猪，发病率一般在10%-15%，严重时死亡率可达50%。

我们实验室对湖南地区某猪场疑似病例进行了病原的分离鉴定和药敏试验，得到良好的治疗效果。

现将结果报告如下：一、材料1、病料：在无菌操作条件下取疑似病猪的肺脏、胸膜、胸腹腔积水、心包积液、心血、关节液等。

2、培养基：巧克力琼脂平板或胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）。

3、生化试验试剂：氧化酶、甘露醇、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、糖、脲酶和伯胶糖等，均购自长沙金标生物有限公司。

4、药敏试纸：氟苯尼考、泰妙菌素、头孢菌素、丁胺卡那霉素、氟甲砜霉素、头孢噻肟、红霉素、克林霉素、庆大霉素、环丙沙星、恩诺沙星、链霉素、土霉素, 均购自长沙金标生物有限公司。

二、方法及结果1、病理变化观察剖检病死猪，发现胸腔内有大量淡红色液体、纤维性渗出物。

肺脏呈纤维素性胸膜肺炎，肺肿大暗紫红色，表面覆有纤维素性渗出物。

支气管内有淡红色泡沫样渗出物。

心包积液。

腹腔内有大量透明黄褐色渗出液，有的呈胶胨状凝块。

全身淋巴结肿大，暗红色。

2、触片镜检取发病猪的肺组织、心血、胸水和腹膜面涂片，革兰氏染色，镜检可见革兰氏阴性的细小杆菌，个别两极球杆状革兰氏阴性菌。

3、细菌分离培养无菌取发病猪的肺脏、腹膜、胸水和心血划线接种TSA平板，置37℃，5%CO2培养箱培养48h，出现无色、透明、湿润、光滑、边缘整齐的针头大小菌落，镜检可见大小不一、形态有细长、丝状的革兰氏阴性杆菌。

接种无NAD的TSA不生长。

而后挑取单个菌落，再进行纯培养。

4、生化试验挑取纯化菌落接种于氧化酶、甘露醇、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、核糖、脲酶和伯胶糖等生化鉴定管中，同时加入0.01%的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）5微升，置于37℃5%的CO2 培养箱培养48h，观察结果如下：。

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏试验

福建畜牧兽医第35卷第2期2013年步跟踪检测研究。

参考文献：[1]何爱华,林奕坚,郭永健,等.大黄鱼幼鱼虹彩病毒感染的电镜研究[J].福建水产,1999(3):56-59.[2]Chen X H,Lin K B,Wang X W.Outbreaks of an iridovirus disease in maricultured large yellow croaker,Larimichthyscrocea (Richardson)in China [J].Journal of Fish Diseases,2003,26:615-619.[3]陈新华,董燕红.大黄鱼虹彩病毒PCR 快速检测试剂盒的研制[J].生物技术,2005(3):38-40.[4]OIE.Red Sea Bream Iridoviral Disease Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals [M].Paris:OfficeInternational des Epizooties,2009:251-261.[5]赵玉然,岳志芹,谭乐义,等.山东沿海部份地区真鲷虹彩病毒病初步调查与分析[J].渔业科学进展,2011,32(6):31-36.[6]萧枫,张奇亚.水生动物虹彩病毒的分子生物学[J].水生生物学报,2004,28(2):202-206.[7]李华,孙志鹏,李强,等.条石鲷检出的虹彩病毒特性研究[J].病毒学报,2011,27(2):158-164.[8]洪健,周雪平.ICTV 第八次报告的最新病毒分类系统[J].中国病毒学,2006,21(1):84-96.副猪嗜血杆菌（Hps ）常引起猪的多发性浆膜炎、关节炎以及脑膜炎，由该菌引起的病又称为猪革拉泽氏病［1］。

随着世界养猪业的发展，该病已成为全球范围内影响养猪业的一种重要细菌性疾病。

副猪嗜血杆菌在实验室分离培养困难，生长条件苛刻，需要高营养成分和特殊的生长因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD ，又称辅酶Ⅰ）［2］。

规模猪场副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药物试验

养．５菌体形态及染色
对该病的治疗临床上目前还是以使用抗生素为主。但是由于抗生素的耐药性，不同菌株对同一种抗生素的敏感性有很大差异，因
使用同一种药，要交替轮换使用。
挑去上述纯化培养物，涂片，革兰氏染色，镜检，观察观察此，要在进行药敏试验的基础上，选择药物，不能长期、大剂量细菌形态。
副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌（ＨＰＳ）引起猪的以纤维
愿活动等副猪嗜血杆菌只感染猪，一般多发生于断奶前后及保育左右的小菌落。分离到的３株细菌被别命名为ＬＳ１、ＬＳ２、ＬＳ３。猪，感染高峰期通常见于４周～６周，病死率可达５０％，给养猪业２．２卫星现象观察
１．６卫星现象观察
参考文献
［１Ｊ马增军．副猪嗜血杆菌重要生物学特性测定［Ｊ１．黑龙江畜牧兽医，
２００５，（１）：２８ — ２９．［２］陆承平．兽医微生物学ｆＭ１．北京：中国农业大学出版社，２００１：
按常规方法进行，将分离到的单个细菌菌落均匀涂于氧氟沙
原菌是副猪嗜血杆菌。同时，对分离菌进行药敏试验，为今后防星、丁胺卡那霉素、阿莫西林、环丙沙星、替米考星等ｌＯ种抗生控该病提供试验依据。素药敏试纸，３７。ｃ培养２４ｈ后，观察测定抑菌圈的大小。

副猪嗜血杆菌病的诊断及防治分析

副猪嗜血杆菌病的诊断及防治分析孟凡杰(山东省菏泽市农业科学院274000)摘要:近年来,我国的养猪业发展迅速,因此使得猪群的饲养密度也不断加大,呼吸道疾病逐渐成为导致猪场有害的主要原因之一。

其中副猪嗜血杆菌所引起的多发性浆膜炎、关节炎呼吸困难等导致猪死亡率较高,由此给养猪业带来了巨大的经济损失,本文通过对副猪嗜血杆菌病的诊断及防治措施进行分析,以期促进养猪业的健康发展。

关键词:副猪嗜血杆菌病;诊断;防治措施副猪嗜血杆菌病主要是指由于副猪嗜血杆菌所引发的一种传染性细菌疾病。

当前,由于饲养技术不当及猪呼吸道综合征疾病的发生,使得此种疾病呈现出流行趋势,对于猪的影响非常大,此种疾病的发病率在10%~20%,病死率高达50%,由此对于养猪场的正常运营产生严重影响,需要采取有效的防治措施,以降低猪的死亡率,保证养猪场的运营效益。

1诊断1.1症状诊断副猪嗜血杆菌病的主要发病猪群是一些4~8周的断奶仔猪,一些10日龄左右的仔猪和4月龄的育成猪,偶尔也会发病,但是主要集中在断奶的仔猪群中,仔猪群在断奶阶段,免疫力降低,对环境的应激反应比较强烈,很容易受到病菌的感染,而且在发病的同时,还可能与其他病症交叉感染,导致猪群出现发热、关节肿胀行走有困难、精神不振、四肢无力和共济失调等问题,很多死猪都会侧卧或四肢呈划水样,一般被感染的猪群,都会出现生长不良的情况,在感染之后很容易出现急性病症,导致死亡率极高[1]。

1.2实验室诊断症状诊断有时会存在误差,所以想要进行详细和确定的诊断,就需要在实验室进行,一般都会使用传统的细菌分离;分子生物学检测技术中的PCR、荧光定量PCR、环介导等温扩增技术;血清学检测技术中的酶联免疫吸附试验、间接血凝实验、平板凝集实验等。

这些方法的使用能够准确地对副猪嗜血杆菌病进行诊断。

在副猪嗜血杆菌病的快速诊断中,血清学检测技术无疑是拥有极大优势的,现在已经成为了检测中的常用方法,酶联免疫吸附试验方法,现在已经得到了发展,出现了很多测试剂盒,在使用的过程中,十分方便迅速,能够有效提高疾病检测的效率和质量[2]。

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及菌体灭活苗的研制

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及菌体灭活苗的研制副猪嗜血杆菌的分离鉴定及菌体灭活苗的研制引言：副猪嗜血杆菌（Actinobacillus suis），属于革兰阴性菌，是猪猩红热的病原菌，可引起猪的败血症、关节炎等严重疾病，对养殖业造成了严重威胁。

因此，对副猪嗜血杆菌进行准确分离鉴定，并研制出有效的疫苗，对于疾病的控制和预防起着重要作用。

一、副猪嗜血杆菌的分离鉴定方法1. 采集样品：从病猪关节、心脏等部位采集组织样品，并迅速送至实验室进行处理。

2. 消毒处理：将采集到的样品进行外部消毒处理，避免其他细菌的污染。

3. 细菌分离：将样品切成小块，接种于选择性培养基（专门用于分离培养副猪嗜血杆菌的培养基），并在适宜条件下培养。

4. 菌体特征观察：观察分离培养物的菌落形态、颜色等特征，以初步判断其为副猪嗜血杆菌。

5. 生化试验：通过一系列碳源利用试验、酶活性测试等进行进一步鉴定，以确认其为副猪嗜血杆菌。

6. 分子生物学鉴定：采用PCR技术，利用特异性引物扩增副猪嗜血杆菌的特异基因片段，通过比对序列与已知菌株的基因序列进行比对，确认其为副猪嗜血杆菌。

二、副猪嗜血杆菌菌体灭活苗的研制1. 菌体培养：在含有适宜营养成分的培养基中培养副猪嗜血杆菌，并控制培养条件，使细菌倍增到一定浓度。

2. 菌体灭活：通过加热、紫外线照射、化学消毒等方法对菌体进行灭活，同时保持菌体表面抗原的完整性。

3. 佐剂的选择：选择合适的佐剂，如低聚糖、脂质体等，以增强疫苗的免疫效果。

4. 疫苗制备：将菌体灭活液与佐剂充分混合，并进行过滤、冷冻保存等步骤，得到最终的菌体灭活苗。

5. 动物实验证实：选择一定数量的健康猪作为实验对象，将灭活苗进行注射，观察其免疫效果、安全性等指标，并与对照组进行对比分析。

6. 疫苗生产：在动物实验证实通过后，将菌体灭活苗进行大规模生产，以满足养殖业的需求。

三、疫苗的应用与前景展望副猪嗜血杆菌菌体灭活苗的研制成功，为猪猩红热的防控提供了重要工具。

猪副猪嗜血杆菌病的诊断方法

猪副猪嗜血杆菌病的诊断方法副猪嗜血杆菌病的诊断主要有临床诊断和快速聚合酶链式反应（ＰＣＲ）诊断技术：副猪嗜血杆菌病的诊断主要有临床诊断和快速聚合酶链式反应（ＰＣＲ）诊断技术：1临床诊断首先，病猪侧卧，腹式呼吸极其微弱，不仔细观察很难看出有呼吸动作，因副猪嗜血杆菌病可导致心脏衰竭，多在深夜死亡，所以经常在早晨发现死猪。

其次，多发性纤维素渗出性浆膜炎，在所有脏器浆膜表面均有白色纤维素性渗出物，尤其“绒毛心”可作为特征性诊断。

第三，胸腔、腹腔、心包内多有大量浑浊积液。

第四，关节不一定肿胀，多为整条腿肿胀，剖开可见皮下水肿，个别猪关节囊内渗出严重，有时刺破关节囊，囊内液体可喷射而出。

2快速聚合酶链式反应（ＰＣＲ）诊断技术疾病诊断通常建立在畜群病史调查,临床症状和尸体解剖的基础上细菌的分离培养对确诊是必要的,但往往不能成功,这是因为副猪嗜血杆菌十分娇嫩,相对于标本中同时可能出现的其它细菌,难以满足其生长需要。

据报道采用回归分析法分析,副猪嗜血杆菌真实的发病率可能为实际确诊的１０倍之多,部分原因是由于不能确认采集来的标本中是否存在副猪嗜血杆菌。

研究人员不仅要对有严重临床症状和损伤的猪进行尸体剖检,还要对处于疾病急性期的猪在应用抗菌素之前采集病料进行细菌的分离鉴定,细菌分离培养好选择浆膜表面物质或渗出的脑脊髓液及心脏血液,即使损伤轻微或不明显也要这样做。

尽管常规诊断有些困难,但在加有抗菌素的选择培养基上接种以后,用特殊的稀释技术可成功地在从呼吸道采集来的标本中培养出大量细菌。

现在华中农业大学动物病毒室已建立了副猪嗜血杆菌的快速聚合酶链式反应（ＰＣＲ）诊断技术,可对该病作出迅速的诊断。

用生物化学的检测方法可将副猪嗜血杆菌从其经ＮＡＤ或Ｖ因子依赖的微生物中鉴别开来。

有时其它的ＮＡＤ依赖的细菌类（Ｌ类嗜血杆菌,猪放线菌、吲哚放线菌）会被误认为嗜血杆菌。

这些细菌在鼻窦,扁桃体或肺脏中大量存在,但只有较低的致病力。

在一个猪群中出现副猪嗜血杆菌的几个菌株或血清型并非少见,甚至在单个猪上的不同标本中也可发现不同的菌株或血清型。

副猪嗜血杆菌hhdA克隆、抗原表位预测和表达

细胞抗原表位的优势表位。将目的基因转入原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ（＋）构建重组原核表达质粒ｐＥＴ一３２ａ（＋）一
ｈｈｄＡ，将重组质粒转化到ＢＬ２１（ＤＥ３）中，进行ＩＰＴＧ诱导表达，经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳结果显示表达的融合蛋白约８０ｋＤ。为进一步研究ＨＰＳｈｈｄＡ生物学功能及抗体制备和开发ｈｈｄＡ基因工程产品奠定了基础。关键词：副猪嗜血杆菌；ｈｈｄＡ；克隆；抗原表位；原核表达中图分类号：￥８５２．６１２文献标志码：Ａ文章编号：１０００ — ２２８６（２０１５）０３ — ０５１２ — ０５
ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅａｐａｉｒｏｆｐｒｉｍｅｒｓａｎｄｔｈｅＰＣＲｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗａｓｕｓｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｙＨＰＳｈｈｄＡｇｅｎｅａｎｄｂｕｉｌｄｉｔｓｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｏｆｔｈｅＨＰＳｈｈｄＡｇｅｎｅｗａｓ１７９７ｂｐｉｎｌｅｎｇｔｈ，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅａｎ — ｎｏｕｎｃｅｄｈｈｄＡｇｅｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅＣＰ００５３８４．１，ｔｈｅｒｅｓｅｍｂｌａｎｃｅｗａｓ９９．８％；ｔｈｅｅｎｃｏｄｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｗａｓ５９９ａａｉｎｌｅｎｇｔｈ，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅａｎｎｏｕｎｃｅｄｈｈｄＡｇｅｎｅｅｎｃｏｄｅｄａｃｉｄｓｅｑｕｅｃｅ，ｔｈｅｒｅｓｅｍｂｌａｎｃｅｗａｓ９９．６％．ＴｈｅｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｈｈｄＡｇｅｎｅｅｎｃｏｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｈｙｂｒｉｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎ．ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ一

副猪嗜血杆菌病病原鉴定及治疗试验

豁
皿嚆
杭州天和微生物试剂有限（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓ）引起的一种多型板上，然后把药敏纸片（
性、散发性或地方流行性、细菌性传染病，是严重危害养猪业的重要传染病之
一
，
病状主要为多发性浆膜炎、关节
炎、纤维素性胸膜炎和脑膜炎【 ” 。２０１４
年１０月，驻马店市上蔡县宏伟种猪有
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口
限公司５～８周龄猪突然大量发病，出现精神沉郁、呼吸困难、体温升高、被毛粗乱、厌食、跛行、振颤及共济失调等症状，甚至死亡［２］。该病发病率高达
１试验材料
环丙沙星头孢噻呋钠左氧氟沙星卡那霉素磺胺．６．甲氧嘧啶磺胺间甲氧嘧啶
１．１被检病料。取病死或濒死病猪心、肝、脾、淋巴结等共２６份病料，保存于４℃冰箱备用。
ｒＤＮＡ基因测序，并与ＮＣＢＩ基因数据库中已有菌种的１６ＳｒＤＮＡ＇序列进行同源性分析和相识性分析，在分子水平对ＦＺ．１、ＦＺ．２进行系统发育、种
属鉴定翻。
血状、病例剖检疑似为副猪嗜血杆菌病猪
体内分离到革兰氏阴性可疑茵．然后通

副猪嗜血杆菌的鉴定方法

副猪嗜血杆菌的鉴定方法
副猪嗜血杆菌是一种常见的病原菌，引起许多动物和人类的感染疾病。

为了有效鉴定副猪嗜血杆菌，需要采取一系列的实验步骤和技术手段。

我们可以通过分离和培养的方法来鉴定副猪嗜血杆菌。

从患者的样本中（如血液、尿液、脑脊液等）提取菌落，然后将其接种在含有适当营养成分的琼脂平板上。

经过一段时间的培养，我们可以观察到菌落的形态特征，如颜色、大小、形状等，这些特征可以帮助我们初步判断是否存在副猪嗜血杆菌。

我们可以利用生化试剂盒来进一步确认副猪嗜血杆菌的存在。

这些试剂盒中含有特定的酶和底物，当副猪嗜血杆菌存在时，它们可以与菌体内的酶发生反应，产生特定的颜色反应。

通过观察反应的颜色变化，我们可以确定是否存在副猪嗜血杆菌。

分子生物学技术也可以应用于副猪嗜血杆菌的鉴定。

例如，PCR技术可以利用特异性引物扩增副猪嗜血杆菌的特定基因片段，通过检测扩增产物的存在与否来确定副猪嗜血杆菌的存在。

在临床实践中，我们还可以利用荧光显微镜和免疫组化染色等技术来观察副猪嗜血杆菌在患者样本中的存在情况。

这些技术可以通过特定的抗体与副猪嗜血杆菌结合，并在显微镜下观察到荧光信号或特定的染色反应。

鉴定副猪嗜血杆菌需要结合传统的培养方法、生化试剂盒、分子生物学技术以及显微镜观察等多种手段。

这些方法的综合应用可以确保副猪嗜血杆菌的准确鉴定，为临床诊断和治疗提供有力的支持。

副猪嗜血杆菌hhdB基因的鉴定和分析

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副猪嗜血杆菌ｈｄ基因的鉴定和分析ｈＢ
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副猪嗜血杆菌的分离鉴定与血清学检测试验

摘要在病史调查、临床症状、特征性病变观察、料采集、病细茵分离培养、生化鉴定的基础上．取贵州地区猪场发病猪群血样进行抽间接血凝试验检测。结果表明：贵州地区部分猪场存在副猪嗜血杆茵的感染，且感染率随着猪日龄的增长而降低，场平均感染幅度在１％猪０
ＡｂｔａｔＢｓｄｏｄｃｌｉｏｖｓｇｔｎｃｉｉａｓｍｐｏ，ｈｒｃｅｉｔａｇｓｏｓｒａｉｎｄｓａｅｃｌｃｉｎｉｏａｉｎａｄｃｌｒｓｒｃａｅｎｍｅｉａｓｒｉｅｔａｉ，ｌｃｙｔｍｓｃａａｔｒｓｃｄｍａｅｂｅｖｔ．ｉｓｏｌｔ，ｓｌｔｎｕｔｅｈｔｙｎｉｏｎｌｉｏｅｅｏｏｕｏａｔｒｍｎｉｃｅｃｌｄｎｉｃｔｎｔｋｎｌｏａｌｓｏｆｃｅｉｓｆｍｐｇｅｙｉｉｈｕａｅａｒｎｉｄｒｃａｍａｇｕｉａｉｎｆｃｅｕａｄｂｏｈｍｉａｅｔａｉ，ｉｇｂｏｄｓｍｐｅｉｅｔｄｐｇｏｉｒｎＧｕｚｏｒａｔｃｒｏｎｉｔｈｅｇｌｔｔｂｉｉｉｆｏａｆｎｒｇｏｙｅｎｏｔｓｅｅｔｎ１１ｖｒｅｒｓｌｈｗｄｔａａｔｏｕｚｏｒａｅｉｅｈｎｅｔｎｏｅｐｉｓｐｒｓｉａｄｉｆｃｉｎｒｔｄｃａｅｔｅｔｄｔｃｉ．ｅａｅａｅｕｔｓｏｅｔｒｆｉｕａｘｓｄｔｅｉｆｃｉＨａｍｏｈｌａａｕｓｎｎｅｔａｅｅｒｓｄｗｉｏ１ｇｓｈｐｓＧｈｅｔｏｆｕｏｅｈ

副猪嗜血杆菌的分离鉴定与血清学检测试验

副猪嗜血杆菌的分离鉴定与血清学检测试验摘要在病史调查、临床症状、特征性病变观察、病料采集、细菌分离培养、生化鉴定的基础上，抽取贵州地区猪场发病猪群血样进行间接血凝试验检测。

结果表明：贵州地区部分猪场存在副猪嗜血杆菌的感染，且感染率随着猪日龄的增长而降低，猪场平均感染幅度在10%~33%。

关健词副猪嗜血杆菌；分离；鉴定；血清学检测ExperimentonIsolation，IdentificationandSerologicalDetectionofHaemophilusparasuisYANG Mao-sheng 1WU Wei-heng 1YANG Li 1Xu Jing-e 1YANG Xiao 2JIA Hui-jun 3 WEI Ci-kai 4（1 Animal Husbandry and Veterinary Medicine Institute of Guizhou Province，Guiyang Guizhou 550005；2 Animal Disease Control Station of Xishui County；3 Huaxi District Animal Disease Control Station of Guiyang City；4 Animal Disease Control Station of Weng’an County）AbstractBased on medical history investigation, clinical symptoms, characteristic damages observation, disease collection, isolation and culture of bacterium and biochemical identification,taking blood samples of infected pigs from piggery in Guizhou area to carry on indirect haemagglutination test detection.The average results showed that parts of Guizhou area existed the infection of Haemophilus parasuis and infection rate decreased with increasing ages of pigs，the amount of infection in piggery was 10%~33%.Key wordsHaemophilus parasuis；isolation；identification；serological detection副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）引起猪的多发性浆膜炎和关节炎，该病已成为全球范围内影响养猪业的典型细菌性疾病，会严重危害仔猪和青年猪[1-3]。

副猪嗜血杆菌的分离与鉴定

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兽医实验室 2017 年第 12 期

5. 小鼠毒力试验。用已灭菌的注射器吸取 1 ml 生理盐水，喷洒在可疑菌 Hps 生长良好的 NAD 的鲜血培养基上，将可疑菌落洗刮下来制成细菌悬液，分别于腹部皮下接种 5 只健康成年小白鼠，每只 0.2 ml，观察小白鼠的生长情况。
图 1 分离菌镜检结果（革兰氏染色 1000×） 3. 卫星试验结果卫星试验结果表明，在金黄色葡萄球菌的两侧有针
尖大小、圆形、边缘整齐的菌落生长，距金黄色葡萄球菌愈近，菌落愈大，愈远则菌落愈小，呈现出明显的“卫星现象”；而在未接种金黄色葡萄球菌的另一个巧克力平皿上则生长不良，菌落稀少，无“卫星现象”出现。
生物实验室。（二）方法 1. 直接涂片镜检。无菌采集病猪的肺脏、心血、胸
腹腔积水、心包积液、关节积液直接涂片，干燥固定后分别进行革兰氏染色，镜检。
2. 分离培养及培养特性观察。将疑似 HPS 感染的猪肺脏、关节液分别接种于含 NAD 的鲜血培养基上，置于体积分数为 5％的 CO2 培养箱中，37℃培养 24 ～ 48 h 后，挑取可疑菌落进行革兰氏染色，镜检。接着将可疑菌落分别接种于麦康凯培养基、普通琼脂培养基、巧克力培养基、普通血平板、含 NAD 的鲜血培养基上，置于 CO2 培养箱 37℃培养 24 h，观察可疑菌株的生长特性。为尽可能排除杂菌干扰，此时可采用格盘法，挑取在巧克力培养基和含 NAD 的鲜血培养基上生长良好的可疑菌落，在同样的位置分别接种于含 NAD 的鲜血培养基、巧克力培养基和麦康凯培养基、普通琼脂培养基、普通血平板上，置于体积分数为 5％的 CO2 培养箱中，37℃培养 24 h 后再次观察分离菌株的生长特性。

副猪嗜血杆菌病的诊断和治控措施

养猪
副猪嗜血杆菌病的诊断和治控措施
李静
(辽宁省葫芦岛市连山区动物疫病预防控制中心，辽宁葫芦岛 DOI:10援3969/J.ISSN援1671-6027援2019援08.099
125000）
副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引发，是一种突发、短期和高发病率及死亡率的疾病。易感猪大都较为年幼（4~8 周龄），但也会在成年猪中偶发（如将无病成年猪引入一个健康猪群）。幸存猪腹部和胸腔会有严重的纤维变性，导致生长率降低和屠宰时胴体的废弃。本病在世界各地广泛传播，我国自从传入了猪繁殖与呼吸综合征，共发病率一直是上升趋势。 1病原
本病不常出现呼吸困难和咳嗽，可从伴有卡他性化脓性支气管肺炎和黏液性化脓性肺炎的猪肺中分离到副猪嗜血
作者简介：李静(1988～)，女，辽宁省葫芦岛市人，大专，助理兽医师，主要从事化验工作。
畜牧兽医科技信息
杆菌。 3病理
急性疾病可能导致某些组织的出血点，且无肉眼病变。组织学观察表明，这些患病猪可出现脓毒症样的显微病变如弥慢性血管内凝血和微出血。胸腔和腹腔的体液增加，无纤维蛋白的出现，也可视为急性病。严重的全身感染特征主要为纤维蛋白多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。可在胸膜、心包膜、腹膜、关节骨液和脑膜中发现纤维蛋白分泌物，且常伴随体液的增加。纤维蛋白胸膜炎可能伴有前腹侧的病变（卡他性化脓性支气管炎）。患有中枢神经系统症状的猪也普遍缺乏肉眼可见的病变。猪的慢性感染常伴有严重的心包膜和胸膜的纤维化病变，有时也会出现在腹膜腔。 4诊断
副猪嗜血杆菌是一种革兰氏阴性菌，对青霉素很敏感。其他有效的抗生素还有头孢噻呋、氨苄青霉素、恩诺沙星、红霉素、泰妙菌素、替米考星、氟苯尼考和磺胺类增效药。治疗时须经非肠道给药疗效显著，且感染猪群内所有的猪都应该被治疗（并不只是显示临床症状的猪）。预防治疗可以通过药物饮水或拌料。无论是商品疫苗还是自家苗，都可被用来控制副猪嗜血杆菌感染，尽管它们的作用是不确定的。潜在的致病性血清型和基因型有很多种，从而导致该病尚未见特效的疫苗。从相同血清型分离得到的菌株之间具有同源性保护，而仅少数血清型可提供异源性保护。据报道，在不久的将来，基因型分型和基因组的研究，可以帮助鉴定菌株之间的交叉免疫，鉴定毒力群和毒力基因，以及辅助发展更多可靠的疾病控制方法。

一例副猪嗜血杆菌的分离鉴定及防治措施

副猪嗜血杆菌是严重威胁养猪业的重大细菌性病原体之一，是猪呼吸道疾病综合征的一种主要原发性病。

副猪嗜血杆菌是需氧或兼性厌氧的巴斯德氏杆菌科的革兰氏阴性菌，血清型众多，目前已确定的有15种，尚有一些未定血清型即不可分型（NT ），且不同地区的副猪嗜血杆菌血清型有所差异，4、12和14型等是我国主要流行血清型。

副猪嗜血杆菌易感1～4月龄的仔猪和保育猪，主要存在于猪的上呼吸道。

该病原菌为条件性致病菌，当猪群免疫力低下时易于感染，单独感染时可导致多发性浆膜炎、多发性关节炎以及脑膜炎，其中以格拉瑟氏病为典型特征。

该菌可经直接接触、空气和污染物进行传播。

当前该病流行正呈上升趋势，常与其他猪病如猪圆环、猪繁殖与呼吸综合征等混合感染而导致发病率和死亡率均较高。

临床患猪多表现呼吸困难、关节肿大、发热、共济失调等症状，给猪场造成严重的经济损失。

本试验对山东省滨州市某猪场疑似副猪嗜血杆菌感染的发病猪进行了病原菌的分离鉴定、血清型鉴定、药敏试验等，为其他类似疾病的诊治提供参考依据。

1发病情况自2020年4月开始，山东滨州某猪场内17日龄仔猪陆续出现精神委顿，体温升高，畏寒扎堆，呼吸急促，被毛粗乱，食欲不振，逐渐消瘦。

有的仔猪腿关节肿胀，卧躺在地，发病1周左右死亡，病死猪多皮肤及黏膜发绀。

初步统计产房哺乳仔猪死亡率可高达34%。

养殖场内兽医初步怀疑为副猪嗜血杆菌病，采用氟苯尼考、氨苄西林进行试探性治疗，但效果不理想。

2病理剖检随机选择三只病死猪进行临床剖检，可见胸、腹腔积液增多，有少量的纤维素，各脏器普遍有纤维素性渗出物，胸腔内纤维素性浆膜炎、纤维素性胸膜肺炎、关节炎等病变明显，病变的关节周围肿大，且有波动感，剖开后有大量清亮积液流出。

3细菌分离3.1病料采集无菌条件下收集腹腔和关节处积液，进行实验室诊断。

3.2细菌分离取适量采集的积液接种在含10%新生牛血清、0.02%氧化型辅酶I 的TSA 培养基上，用无菌接种环涂抹均匀，放置于5%CO 237℃恒温箱内培养24～48h ，观察平板。

多重感染猪场副猪嗜血杆菌的分享与鉴定

表现为消瘦、被毛粗乱，病死猪有的皮肤发红、有的皮肤苍 15 mL，置 100 ℃ 30 min 灭菌。于一管中加入 30 μg 辅酶 I
白；多数咳嗽或气喘，有的跛行、关节肿大。解剖 2 头病死（氧化型 NAD），另一管不加，在于每管中接种 0.5 mL 灭菌
猪（20 ～ 25 kg），其中一头有明显的皮肤与肾脏病变；另一生理盐水分离菌菌落悬浮液，置 37 ℃摇振培养，0 h 及每间
2008 年 9 月，笔者从江苏太仓市某商品猪场分离到一株然后用接种针挑取金黄色葡萄球菌以“ 井 ” 字样划线，
毒力较强的副猪嗜血杆菌，并从培养特性、生化特性、分子 37 ℃ 24 ～ 48 h，5% CO 条件下培养。结果（如图 1 所示）， 2
生物学特征及致病性等方面进行了鉴定，现报道如下。
氏阴性短小杆菌或呈球杆状，未见到丝状菌体，未观察到荚膜。 2.3 “卫星现象 ”试验
将分离菌纯培养物密集划线于绵羊血琼脂平板上，
图 1 分离菌的“卫星现象”，白色“#”字（金黄色葡萄球菌）划线周边布满露珠状生长的副猪嗜血杆菌，较远的区域呈现
无菌落生长的空白区。
为断奶后多系统消耗综合征（PMWS）。
0 h 细菌分离与鉴定 2.1 细菌分离
NAD 的培养管在近 20 h 的培养时间中，OD 值呈上升趋势，前 12 h 细菌生长繁殖较快。此现象与结果表明分离菌具有副
将在无菌条件下采集的多发性浆膜炎病死猪病料进行细
猪群保健
HEALTH
多重感染猪场副猪嗜血杆菌的分离与鉴定
周宗清，邹勇，王英，张春玲，蒋凤英（1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海邮编；2.上海佳牧生物制品有限公司，上海邮编）

副猪嗜血杆菌诊断治疗分析

副猪嗜血杆菌诊断治疗分析【摘要】副猪嗜血杆菌病是一种以多发性浆膜炎和关节炎为主的疾病,近两年来在各地越发严重,发病速度快、死亡率高,给养猪业带严重的危害和损失。

副猪嗜血杆菌属于条件性致病菌,环境卫生较差、气候突变、密度过大、氨气超标等因素会增加发病,所以要改善饲养环境和加强饲养管理,才能最大限度地降低发病率。

同时,该病多以继发感染形式存在,所以控制原发病是预防和治疗本病的关键。

【关键词】副猪嗜血杆菌;临床诊断;治疗1.发病情况本病单独感染临床很少见到,更多的是继发感染和混合感染。

主要危害2周龄仔猪到4月龄的肥育猪,刚断奶的仔猪和2月龄的保育猪感染最严重。

在猪瘟、伪狂犬病疫苗免疫失败的猪场发病率更高。

感染圆环病毒的猪群,副嗜血杆菌病的发生率可达80%以上。

感染本病是整个猪群免疫力低下的标志。

2.临床症状2.1急性型急性病例是由强毒株感染引起,发病急、治愈率低,一般接触病原几天后就可感染, 2~3d就会出现死亡。

初期体温升高(40~42℃)采食量下降、精神沉郁、身体发红、反应迟钝、咳嗽,随着病情的发展,呼吸症状严重、痛性咳嗽、腹式呼吸、行走困难、疼痛明显、出现关节肿大甚至整条腿明显肿胀;后期出现败血症变化,耳尖发紫,眼睑发青肿胀;表现严重的呼吸困难,气喘,共济失调,随后死亡。

死亡后腹部微肿,好似刚进过食物一样,死后不掉膘。

2.2慢性型慢性型病例多数是由急性病例转变而来,部分是由中等毒力的毒株感染引起。

发病时间长,对脏器造成不可逆的损伤,表现出严重的浆膜炎和关节炎。

病猪食欲下降,精神萎靡,体温升高(40~42℃),发抖,痛性咳嗽,呼吸困难,关节肿大伴发整条腿明显肿胀(后肢严重),行走、站立困难,被毛粗乱,皮肤苍白,逐渐消瘦。

随着病程的延长,食欲和饮欲逐渐废纸,最后衰竭死亡。

得到及时治疗的猪只侥幸未死,但生长发育受阻成为僵猪。

2.3混合感染型与猪瘟混合感染时,除以上症状外,还多发生粪便呈干粪球状,或者是干稀粪便交替。

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序列与少数放线杆菌、杜克雷嗜血杆菌的溶血素蛋白具有一定的相似性。ｌ —ＣｉＰＲ扩增到了ｈｄ－因的ｔｈＢＡ基
关键词：副猪嗜血杆菌；ｈＢＡ基因；隆；ｈｄ－克鉴定和分析
中图分类号：８８２５１￥５．８．２
副猪嗜血杆菌（ａｍｐｉｓａｓｓＨｓ是一种多形态、Ｈｅｏｈｌｒｕ，Ｐ）ｕｐａｉ烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Ａ）ＮＤ依赖型、革兰氏阴性细小杆菌，属于巴斯德杆菌科嗜血杆菌属。该菌可引起猪的格氏病，临床上以多发性浆膜炎、节炎、关脑膜炎、肺炎为特征¨ 。该菌曾被认为是猪呼吸道的常在菌或条件性致病菌，ｊ而现在却在临床健康猪群中流行，且常与其他病原菌混合感染－。Ｋｅｔｎ３２ｉｓｉ等Ｌ利用血清学方法已鉴定出该菌的］ｌｅ
宋帅，李春玲，李淼，杨冬霞
（广东省农业科学院兽医研究所广东省兽医公共卫生实验室，广东广州，１６０５０４）
摘要：了明确副猪嗜血杆菌致病菌株的毒力相关因子，为从广东省不同地区发病猪场送检病猪中分离到９株
细菌（一Ｈ）并对其ｈｄ — Ｈ１９，ｈＢＡ基因进行了鉴定和分析。结果显示，所分离的９株细菌经形态观察、生化特性鉴定和ＰＲ鉴定为副猪嗜血杆菌阳性，具有卫星现象和不溶血特征。用ｈｄ－因引物从分离菌株中扩Ｃ并ｈＢＡ基
目的条带，表
基因同源性为９％，９分离菌株ｈｄｈＢ基因之间序列同源性为９．％～９．％；导的氨基酸７５９８推
基因在分离菌株中得到了相应的表达。文献标志码：Ａ文章编号：６２９３２１）４０１－１７Ｇ８（０００－６００７
收稿日期：１ —２１２０１－００
４期
宋帅等
副猪嗜血杆菌ｈｄ－ｈＢＡ基因的鉴定和分析
ｌ７
纯化试剂盒，随机六聚体引物，转录酶ＡＶ等购自ＴＫＲ公司；ＮａｙＭｎｉ购自Ｑａｅ司；反ＭａａａＲｅｓｉｉｔｋｉｎ公ｇ
增到了特异性片段，序列分析表明，所获得的ｈｄ因序列与Ｇｎａｋ中副猪嗜血杆菌Ｓ０６，Ｐ５ｈＡ基ｅＢｎＨ１５ＨＳ９的
以基因同源性为９％～１０，８０％分离菌株Ｍ以基因之间序列同源性为９．％一９９；ｈＢ基因序列与９Ｏ９．％ｈｄＳ０６Ｈ１５的
河北科技师范学院学报
第２４卷第４期，００年１２１２月
ＪｕａｆＨｅｅｒｌｉｅｓｔｆＳｉｎｅ＆ＴｅｈｏｏｙＶｏ．４Ｎｏ４Ｄｅ００ｏｒｌｏｂｉＮｏｍａｖｒｉｏｃｅｃｎＵｎｙｃｎｌ１２．ｃ２１ｇ
副猪嗜血杆菌ｈｄ — 因的鉴定和分析ｈＢＡ基
ＴＡＴＢ培养基购自美国ＢＳ，ＳＤ公司，配制时加小牛血清体积分数为０１．０的小牛血清溶液和质量浓度为１０ｍ／０ｇＬ的ＮＤ脲酶、Ａ；氧化酶、接触酶、吲哚、葡萄糖等试剂均购自杭州微生物试剂有限公司；副猪嗜血杆菌３型菌株、１１型菌株为中国农业科学院兰州兽医研究所馈赠。１１３引物副猪嗜血杆菌１ＳＲＡ的引物设计参照Ｏｉｉ．．６ｒＮｌｅａ等，６ｒＮｏ：ＡＧＧｖｒＪ１ＳＲＡＦｒ５一ＴＡ－ＧＧＡＧＴＧＧ－，６ｒＮａｋ５．Ｇ１ＣＴＡｃＴＴＴ３，ＡＧＧＧＴＴ３１ＳＡＢｃ：Ｇｃ＿ＧｃｃｃｃＧ一预期扩增片段大小为８１ｂ。副Ｒｒ２ｐ猪嗜血杆菌扭基因的引物设计参照Ｍｉ等－，ｅｅ６胁以Ｆｒ５一Ｇ＿盯ｃｃｋＪｏ：１ｃＧｒＡｃＧｃＴＡｃ从－Ａ．。ｈＡＢｃ：＇ＡＡＩＡｃｃＧｃｖＡｒＴＴ－，Ｃ３ｈｄａｋ５－ＴＴＴｃｃＴｃｒ℃ ＴＧＡＣ３预期扩增片段大小为９４ｂ，ｈＢＦｒＧＩＩ６ｐｈｄｏ：５．ＴＴＧｃＴＡＴＡＡＴＧ．，ｈＢＢｃ：ＧＧＡＡＡＣＣＴＴＣＡＴＧＣ３，期ＡｃｒｃＣＧＴＡＧＧＡＧ３ｈｄａｋ５．ＴＡＴＴＧＣＴＡＣＡＡＡＧ－预Ｇ
ｌ５个血清型，对每个血清型的代表菌株进行腹腔途径感染ＳＦ猪，并Ｐ证实了不同血清型的毒力差异性。例如，血清１５１，，，１０２型为强毒力血清型；而血清６７９１型为非毒力血清型。但对于某些分离菌株，，，１
Байду номын сангаас
用血清型鉴定方法无法定型，同一血清型的不同分离菌株其毒力也存在差异性。从而利用血清型且判定其毒力存在一定的缺陷，］为了进一步明确致病菌株和非致病性菌株的差异性，对致病菌株所特有的毒力相关基因的鉴定就显得尤为重要。研究发现，在副猪嗜血杆菌致病菌株基因组内，某段核苷酸序列所编码的蛋白与杜克雷嗜血杆菌溶血素（ｈＢＡ存在相似性，ｈｄ－）将这段核苷酸序列假定为副猪嗜血杆菌的ｈｄ－因，基因序列存在于大多数致病菌株中，ｈＢＡ基该而非致病菌株为阴性，可考虑作为区分致病菌株和非致病菌株的候选对象。但对副猪嗜血杆菌ｈｄ－因以及编码蛋白的生物学特性还不是］ｈＢＡ基彳清楚。因此，艮笔者对临床发病猪中所分离的副猪嗜血杆菌菌株进行ｈｄ－因的鉴定和分析，ｈＢＡ基为探讨该基因的生物学特性、致病菌株和非致病菌株的区别鉴定以及副猪嗜血杆菌致病机理的研究提供理
论依据。
１材料和方法
１１材料．
１１１病料从广东省不同地区发病猪场送检病猪中采集病料，．．发病猪只大多为保育阶段，临床表现为消瘦、被毛粗乱、腹式呼吸、卧行等。剖检病理变化为淋巴结肿大、肺实质性病变并与胸腔壁粘连，胸腹腔内有淡黄色积液等。采集部位包括心脏、肺脏、肝脏、脾脏、、脑扁桃体、腹股沟淋巴结、胸腹腔积液
等样品。
１１２主要试剂、养基及菌株．．培
限制性核酸内切酶，ａＮＴｐＤＡ聚合酶，ＮＰ，ＮａｋｒＤＡ片段ｄＴｓＤＡＭｒｅ，Ｎ
基金项目：广东省农业科技重大专项（目编号：０９００００６；项２０Ａ２１１０）广东省农业攻关项目（目编号：０７００００５项２０Ａ２３００ — １）广州市农业科技重大专项（目编号：０９１Ｅ４）１；项２０Ａ一０１。通讯作者，，士，女博研究员。主要研究方向：兽医微生物学。Ｅｍｉｌｅｍ＠６．ｏｌ — ａ：ｌａ１３ｃｎ。ｌｅｌ