重叠延伸PCR技术及其在生物学中的应用
重叠延伸pcr
重叠延伸pcr重叠延伸PCR一、前言重叠延伸PCR（Overlap Extension PCR，又称OE-PCR）是一种基于PCR技术的DNA重组技术，它可以实现在DNA两端同时进行定向变异、插入、删除等操作。
重叠延伸PCR广泛应用于基因工程、遗传学、生物学等领域，成为分子生物学研究中的一项重要技术手段。
二、适用场景2.1 定向变异定向变异是指在已知序列中有目的地进行基因改造，如点突变、插入、缺失等。
这种改造方式在药物研发、基因治疗等方面有广泛应用。
重叠延伸PCR可以实现在DNA两端同时进行定向变异，从而避免在后期回溯过程中的麻烦。
2.2 DNA连接DNA连接是指将不同组织来源的DNA片段进行连接的技术。
重叠延伸PCR在连接过程中，可以通过PCR技术将两个片段的连接点相互重叠，从而实现快速、准确的连接。
三、操作流程3.1 设计引物首先，需要根据实验需要，设计出两对带有同义语突变位点的引物组合。
3.2 预扩增将目的片段引物体系与目的DNA模板进行PCR扩增，以获得适当浓度的DNA模板。
3.3 扩增突变位点将模板进行分开再扩增，由于引物不具有重复序列，可以杜绝非特异性放大的情况发生。
3.4 扩增合成将扩增突变位点与预扩增产物进行重叠延伸PCR反应，合成所需DNA 片段。
3.5 二次PCR利用扩增产物进行二次PCR反应，获得所需突变的DNA产物。
四、优点4.1 准确性高在重叠延伸PCR中，引物端使用了一些具有重叠序列的引物，可以减少模板串扰，从而大大提高了反应的准确性。
4.2 可控性强由于引物设计合理、重叠合成区域明确，重叠延伸PCR能够实现精确控制产物长度，避免了延伸过程中产生多余的DNA序列。
4.3 操作简便重叠延伸PCR是一种简单、快速、方便的重组技术，操作简便，前期准备工作少。
五、结论重叠延伸PCR是一种高频使用的分子生物学技术手段，具有诸多优点。
在实际应用中，重叠延伸PCR能够实现定向变异、DNA连接等操作，为生物学和基因工程的研究提供了强有力的支持。
重叠延伸pcr引物设计原理
重叠延伸pcr引物设计原理以重叠延伸PCR引物设计原理为标题，本文将详细介绍重叠延伸PCR（Overlap Extension PCR）的原理和引物设计方法。
重叠延伸PCR是一种常用的基因工程技术，用于在DNA分子水平上进行特定DNA片段的定向突变、插入、删减等操作。
其基本原理是通过两轮PCR反应，将两个具有重叠序列的引物引导下的DNA片段进行扩增，并在扩增过程中通过引物设计实现特定的基因改造。
在重叠延伸PCR中，引物设计是关键步骤之一。
首先，需要设计两对引物，分别命名为引物A和引物B。
引物A和引物B的设计原则是：引物A和引物B的5'端都包含所需改造的目标序列，而3'端则包含与目标序列互补的序列。
这样，在PCR反应中，引物A和引物B的3'端互补部分可以通过两轮PCR反应的重叠延伸步骤，实现目标序列的重组。
同时，引物A和引物B的5'端还可以通过两轮PCR 反应的扩增步骤，将目标序列扩增出来。
在第一轮PCR反应中，引物A和引物B分别与目标序列的两个相邻区域发生引物特异性结合，导致目标序列的扩增。
在第二轮PCR 反应中，引物A和引物B的3'端互补部分通过重叠延伸步骤，使得目标序列的两个相邻区域连接在一起，形成重组的目标序列。
最终，通过两轮PCR反应，可以得到重组的目标序列。
引物设计时，需要注意以下几点：首先，引物A和引物B的长度应适当，一般在18-30个碱基对之间，过短的引物可能导致扩增产物的不稳定，而过长的引物可能导致扩增效率降低。
其次，引物A和引物B的Tm值应接近，以确保二者在PCR反应中有相似的扩增效率。
此外，引物A和引物B的5'端应尽量避免包含重复序列或剪切位点，以避免意外的扩增产物。
除了引物设计，重叠延伸PCR还需要注意反应条件的优化。
例如，PCR反应体系的优化、引物浓度的优化、退火温度的优化等都会影响重叠延伸PCR的结果。
此外，为了提高扩增效率，还可以考虑添加DNA聚合酶的增稳剂、聚乙二醇等物质。
PCR衍生技术的原理和应用
PCR衍生技术的原理和应用一、PCR的原理PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种在体外扩增DNA片段的技术，其原理是通过反复进行DNA的复制，最终得到大量目标DNA片段。
PCR的原理主要包括以下几个步骤： 1. 反应体系的配制：PCR反应需要包含DNA模板、引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和聚合酶等关键成分。
2. Denaturation（变性）：将PCR反应体系加热至95℃，使DNA双链解开，得到单链DNA。
3. Annealing（退火）：将PCR反应体系温度降至50-65℃，使引物与DNA的互补序列结合。
4. Extension（延伸）：将PCR反应体系温度升至72℃，聚合酶将新的DNA链合成。
5. 重复步骤2-4：以上三步循环反复进行，使DNA分子指数级增加。
PCR的原理基于DNA的双链结构可变性和DNA聚合酶的体外聚合能力，能够在短时间内扩增目标DNA片段。
二、PCR的应用PCR技术已经广泛应用于许多领域，包括医学、生物学、法医学和环境科学等。
下面列举了PCR在不同领域的应用：1.分子诊断•PCR在临床诊断中的应用：PCR技术可以检测病原体、基因突变和单倍体多态性等，用于疾病的早期诊断和基因型鉴定。
•PCR在遗传疾病筛查中的应用：PCR可以检测染色体缺陷、遗传突变和基因变异等，有助于遗传疾病的筛查和诊断。
2.基因工程和遗传学研究•PCR在基因克隆中的应用：PCR可以从复杂的基因组中扩增目标基因，为基因克隆提供模板DNA。
•PCR在DNA指纹技术中的应用：PCR技术可以扩增特定的重复序列，用于DNA指纹图谱的构建和个体鉴定。
•PCR在基因表达研究中的应用：PCR可以检测基因的表达水平和转录变异，从而揭示基因功能和调控机制。
3.药物研发•PCR在药物快速筛选中的应用：PCR技术可以高通量地检测药物对特定基因的影响，用于快速筛选药物靶点和药效评价。
4.环境监测•PCR在微生物污染监测中的应用：PCR技术可以快速检测环境中的微生物污染，例如水源、土壤和食品中的致病菌。
重叠延伸PCR技术的基本原理及其简单运用
特点：
可简单迅速将两个DNA片段连在一起，用于嵌合体基因 的构建。此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重 组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术 很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产 物. 可以进行定点突变。 可以在两基因片段间加入其他序列——酶切位点或者标 签。 丰富的PCR的扩增范围，尤其在获得长DNA片段方面，省 去常规克隆的繁琐。
间不宜过长。高温会使 DNA 受到损伤，造成 DNA 酶终止合成。考虑
到DNA 聚合酶的扩增效率、错配率，每一轮反应的循环数控制在 20-
25 个为宜。循环次数过多，碱基错配的几率增大；循环次数太少，则
得不到足够的拷贝数进行下一轮反应。四条引物的TM值尽量保持相同
或一致，利于引物的灵活使用。
10
片段中间引入突 变
B基因： 上游（F2）与A基因终止密码子附近的序列及B基因5 ’ 端起始密码子附近的序列相对应，同样去除A基因终止密 码子TAA；下游（R2）与B基因的开放阅读框终止密码子 序列互补，并在5’末端添加酶切位点和2个保护碱基。
先分别用F1、R1，F2、R2扩增出A和B基因，然后再用F1 和R2将两基因连接起来，得到融合基因。
4
过程
设计引物
PCR扩增 基因两端
回收两端 片段
两端片段 退火延伸
扩增全长 基因
5
基本原理
6
两基因的引物设计
A基因： 上游（F1）与开放阅读框起始密码子附近的序列相对应， 并在5 ’末端添加酶切位点和3个保护碱基；下游（R1） 与A基因终止密码子附近的序列及B基因5’末端起始密码 子附近的序列互补，并去除A基因的终止密码子TAA
姓名：黄保洋 学号：20192118030 专业班级：生物化学与分子
重叠延伸PCR技术
反应机理
F2 引物 F1 引物
5’ 3’ 3’ 5’
基因B
5’ 3’
R2 引物
3’ 5’
基因A
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
R1引物
加入酶，buffer等反应液。PCR仪中解链， 退火——单链模板结合
5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’ 加入F1引物、R2引物
5’ 3’
5’
3’
无目标产物
5’ 3’
F1 引物
3’ 5’
R2 引物
重叠延伸PCR技术
（SOE PCR）
1. 重叠延伸PCR技术的概念
• 重叠延伸PCR技术(SOE PCR)是指在PCR技术的基础上，采 用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,通过重叠链的 延伸,将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术可以 很快获得依靠其它限制性内切酶消化的方法难以得到的产物，其 成功的关键是重叠互补引物的设计。SOE PCR在基因的定点突变、 长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独 特的应用。
答案： （1）越高 （2）引物2和引物3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失 去作用 （3）3 （4）2 （5）目的基因与载体结合 将重组DNA导入受体细胞
解析：重叠延伸PCR技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、 基因的定点诱变等方面有广泛的应用。老师要予以关注，在讲评中可适当拓展。G 与C碱基对之间是三个氢键，引物中G—C含量越多，越稳定。由图可知，因为引物 2、3有互补片段，但引物1、4没有互补片段。利用引物1、2进行扩增，可产生 两种DNA片段，利用引物3、4进行扩增，可产生 ，其中a、c 分别是以引物1和引物4扩增产生的DNA片段，是相同的DNA片段，b、d分别是以引 物2和引物3扩增的DNA片段，碱基序列是不同的，共三种。因为新的核苷酸链必须 从5′端到3′端，在第二阶段，含引物1和引物4的脱氧核苷酸链因为有互补的碱基序 列，而部分互补，并能互为模板进行延伸，但含引物2和引物3的脱氧核苷酸链虽 能部分互补，但因方向问题，不能延伸。
3个片段重叠延伸pcr比例
3个片段重叠延伸PCR比例PCR（聚合酶链式反应）是一种基因工程中常用的技术，通过在体外复制DNA片段，可以迅速扩增目标DNA序列。
3个片段重叠延伸PCR是一种特殊的PCR方法，它可以在同一反应中同时扩增3个相邻的DNA片段，并在这些片段之间引入重叠序列。
本文将介绍3个片段重叠延伸PCR的原理、操作步骤以及相关应用。
原理3个片段重叠延伸PCR的原理基于PCR的基本原理，通过两个反向引物和一个重叠引物，同时扩增3个相邻的DNA片段。
在引物设计上，每个片段的两个端部分分别与相邻片段的重叠序列相匹配，确保扩增时各片段能够连接起来。
重叠引物的设计需要考虑到引物的长度、GC含量和熔解温度等因素，以确保扩增效率和特异性。
在反应过程中，PCR反应液中含有4种核苷酸和聚合酶酶链，以及模板DNA和引物。
反应的温度循环包括变性、退火和延伸三个阶段，使引物与目标DNA序列进行特异性结合，聚合酶依次合成新的DNA链。
重叠引物在扩增过程中连接不同片段的DNA 段，最终得到完整的DNA序列。
操作步骤1.引物设计：根据目标DNA序列，设计两端引物和一个重叠引物。
两端引物的设计需考虑到其与相邻片段的重叠序列的匹配，重叠引物的设计需确保与各引物的熔解温度相近。
2.PCR反应体系组成：将所需核酸、引物和聚合酶按照比例准确加入PCR反应管中，确保反应体系配比正确。
3.温度循环：根据引物的特性和扩增片段的长度，设置合适的温度循环参数。
常规的循环程序包括变性（94-98°C）、退火（50-70°C）和延伸（68-72°C）等步骤。
4.分析扩增产物：可以通过琼脂糖凝胶电泳或其他方法，检测扩增产物的大小和纯度。
应用3个片段重叠延伸PCR在分子生物学研究中具有广泛的应用。
它可以用于基因克隆、基因组测序、遗传变异分析等领域。
在基因克隆中，3个片段重叠延伸PCR可以用于连接两个DNA片段之间的缺失序列，扩增目标片段并进行拼接。
pcr技术原理及应用
pcr技术原理及应用PCR技术原理及应用。
PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种重要的分子生物学技术，它能够在体外迅速、准确地扩增DNA片段。
PCR技术的原理基于DNA的复制过程，通过不断的循环反应，使得目标DNA片段得以扩增，从而满足了科研和临床诊断中对DNA的需求。
本文将系统介绍PCR技术的原理及其在生物学研究和临床应用中的重要性。
PCR技术的原理主要包括三个步骤，变性、退火和延伸。
首先是变性步骤，将DNA双链变性为两条单链。
然后是退火步骤，将引物与目标DNA序列结合。
最后是延伸步骤，利用DNA聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
这三个步骤循环进行，最终实现目标DNA片段的指数级扩增。
PCR技术在生物学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于基因克隆，通过PCR扩增目标基因片段，然后将其插入载体进行表达或进一步研究。
其次，PCR 还可以用于基因组DNA的检测，如在疾病诊断中对病原体的检测。
此外，PCR技术还被广泛应用于DNA指纹鉴定、基因突变分析等领域，为生物学研究提供了强大的工具。
除了在科研领域的应用，PCR技术在临床诊断中也扮演着重要的角色。
例如，在传染病的快速检测中，PCR技术能够快速、准确地检测出病原体的存在，为临床诊断提供了重要依据。
另外，PCR技术还可以用于肿瘤标志物的检测，对肿瘤的早期诊断和治疗起到了关键的作用。
总之，PCR技术作为一种重要的分子生物学技术，其原理简单而高效，应用范围广泛。
在生物学研究中，PCR技术为基因克隆、基因检测、DNA指纹鉴定等提供了有力的支持；在临床诊断中，PCR技术为传染病检测、肿瘤标志物检测等提供了快速、准确的方法。
随着技术的不断发展和完善，PCR技术必将在生物学研究和临床诊断中发挥越来越重要的作用。
重叠延伸pcr原理
重叠延伸pcr原理重叠延伸PCR（Overlap Extension PCR）是一种用于DNA片段重组的特殊PCR技术。
它的原理是通过两轮PCR反应，将两个不同的DNA片段在它们的重叠部分进行延伸，最终得到一个重组的DNA片段。
这种技术在分子生物学研究中有着广泛的应用，特别是在基因工程领域。
首先，我们来看一下重叠延伸PCR的基本原理。
在第一轮PCR中，我们需要设计两对引物，每对引物包含一个与目标DNA片段的末端相互重叠的序列。
这样，当PCR反应进行时，引物会将两个目标DNA片段的重叠部分进行延伸，形成两个带有重叠序列的DNA片段。
然后，在第二轮PCR中，我们使用这两个DNA片段作为模板，再次进行PCR反应。
这样，重叠部分会在第二轮PCR中连接起来，最终得到一个重组的DNA片段。
重叠延伸PCR的关键在于引物的设计。
引物的选择需要考虑到两个目标DNA片段的重叠部分，以及引物之间的相互作用。
通常情况下，引物的长度在20-30个碱基对之间，GC含量在40-60%之间，Tm值在55-65°C之间。
此外，引物的末端需要与目标DNA片段的重叠部分完全匹配，以确保延伸的准确性。
在实际操作中，重叠延伸PCR需要进行两轮PCR反应。
在第一轮PCR中，我们需要对引物的浓度、反应条件等进行优化，以确保两个目标DNA片段的重叠部分能够被准确延伸。
在第二轮PCR中，我们需要对引物的浓度、反应条件等进行进一步的优化，以确保重叠部分能够被准确连接。
此外，我们还需要对PCR产物进行酶切、测序等验证，以确保重组的DNA片段的准确性和完整性。
总的来说，重叠延伸PCR是一种用于DNA片段重组的特殊PCR技术，它的原理是通过两轮PCR反应，将两个不同的DNA片段在它们的重叠部分进行延伸，最终得到一个重组的DNA片段。
在实际操作中，我们需要对引物的设计、反应条件的优化、PCR产物的验证等进行精细的操作，以确保重组的DNA片段的准确性和完整性。
重叠PCR (Overlap
Cycling conditions
Pre-denaturation: Denaturation: Annealing: Extension: Extension: Finally:
98℃, 2 min.
98℃, 30 sec. 60℃, 30 sec. 72℃,1 min. 72℃,5 min. 4 ℃, ∞.
重叠PCR (Overlap PCR)的基 本原理 及其简单运用
刘梦鸽6.06.08
简介
重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称 SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重 叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源 的扩增片段重叠拼接起来的一项技术。
5 cycle
加入100 μM浓度的F和R引物各0.5 μl
Maker
目的基因条带 2154bp
胶回收得浓度： 40μg/mL
Cycling conditions
Pre-denaturation: Denaturation: Annealing: Extension: Extension: Finally:
98℃, 2 min.
98℃, 30 sec. 65℃, 30 sec. 72℃,2 min. 72℃,5 min. 4 ℃, ∞.
12 cycle
12
F2引物 R2引物
R2引物
突变碱基：可以在引物上换成任何其他碱基。
碱基同源区域：保证20bp左右，这样有利于Overlap PCR 得到目标序列。
8
上述反应体系中，反应液的加入有两种不同的方式
一种是先加入酶，模板（基因A和B）buffer，dNTP，水。经过5个循 环得到完整的目的基因。然后入引物，大量扩增目的基因。虽然这样操作 繁琐，但是可以得到特异性扩增产物。 另外一种是直接一步加入所有需要的反应液。虽然此操作简单省时， 但是会出现非特异扩增条带，影响胶回收，产量也会减少。
重叠延伸pcr技术及其在基因工程上的应用
重叠延伸PCR技术及其在基因工程上的应用1. 介绍重叠延伸PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种用于在DNA序列中特定区域进行增加或修改的重要工具。
它结合了两种PCR 技术，即延伸PCR和重叠PCR，能够在不需要进行复杂的克隆操作的情况下，实现特定DNA序列的扩增和修改。
在基因工程领域，重叠延伸PCR技术被广泛应用于基因的突变、合成和定向进化等研究领域。
2. 原理重叠延伸PCR技术主要依赖于两个PCR基本原理：延伸和重叠。
在延伸PCR中，引物和DNA模板结合后由热稳定DNA聚合酶进行DNA链的延伸，从而扩增目标DNA序列。
而在重叠PCR中，则通过设计引物使得重叠的部分在不同的引物对应的DNA片段间，从而实现目标DNA片段的扩增。
重叠延伸PCR技术则结合了这两种原理，通过巧妙的设计引物，可以在目标DNA序列特定区域进行精准的扩增和修改。
3. 应用在基因工程领域，重叠延伸PCR技术被广泛应用于基因的突变、合成和定向进化等研究领域。
通过合理设计引物序列，可以在基因的特定位点进行突变或插入，从而研究基因在结构和功能上的变化。
重叠延伸PCR技术还能够用于合成人工基因和调控基因表达水平，为基因工程研究提供了强有力的工具。
4. 个人观点在我看来，重叠延伸PCR技术是基因工程领域的重要利器，它不仅能够帮助研究人员快速高效地进行基因的改造和合成，也为基因工程研究提供了更大的灵活性和可能性。
随着基因工程领域的不断发展，重叠延伸PCR技术将会扮演更加重要的角色，为基因工程研究的进步和创新提供有力支持。
总结重叠延伸PCR技术作为一种重要的DNA工程技术，在基因工程领域扮演着重要的角色。
通过精准设计引物序列，可以在目标DNA序列特定区域进行扩增和修改，为基因工程研究提供了有力的工具。
未来，随着基因工程领域的不断发展，重叠延伸PCR技术将继续发挥重要作用，推动基因工程研究的进步和创新。
重叠延伸PCR技术在基因工程中的应用是非常广泛的，它不仅可以在基因编辑、合成和定向进化等领域发挥作用，还可以用于分析DNA序列和检测特定基因的存在。
对重叠延伸PCR技术原理理解及举例分析
对重叠延伸PCR技术原理理解及举例分析The undersdanding and analysis of the SOE PCR摘要：以南通市2012届高三第一次调研考试中的压轴题为例，简单分析了重叠延伸PCR 技术的概念和原理。
关键词：重叠延伸PCR；概念原理；举例分析中国图书分类号：G633.91 文献标识码：A最近进行的南通市2012届高三第一次调研考试中，生物试题的压轴题是一道与重叠延伸PCR技术的相关的试题，受该题的启发，笔者对重叠延伸PCR技术做了一些肤浅的总结，不妥之处敬请同行斧正。
1. 重叠延伸PCR技术的概念重叠延伸PCR技术(SOE PCR)是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,通过重叠链的延伸,将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。
该技术可以很快获得依靠其它限制性内切酶消化的方法难以得到的产物，其成功的关键是重叠互补引物的设计。
SOE PCR在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。
2. 重叠延伸PCR技术的原理重叠延伸PCR的的原理并不复杂，如果有两个基因或者一个基因和一个终止子，现在要将他们连接到一起，我们最先想到的是借助于内切酶和DNA连接酶的方法，但我们有时并不一定能找到合适的限制性酶切位点，或者找到了，但这些酶又非常的昂贵，而且可能只用一次，这样购买这些酶就变成了浪费，在这种研究背景下，重叠延伸PCR技术就应运而生了。
比如有两个基因，一个命名为M，一个命名为N，基因M和N序列如下所示：M的序列为5’-ATGCATGCTAGCTAGAACGCTACGCTGACTACCCCCTGATC-3’N的序列为5’-ATGCTAGTAGCTAGCCCCCCCCAGGGGATAATTTTTTAAAACG-3’现在要将它们连接到一起，首先必须要设计引物，假设引物的序列为：M1:5’-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3’M2:5’-GGGGGGCTAGCTACTAGCATGATCAGGGGGTAGTCAGCGT-3’N1:5’-ACGCTGACTACCCCCTGATCATGCTAGTAGCTAGGGGGGG-3’N2:5’-CGTTTTAAAAAATTATCCCCT-3’该过程的目的是将基因M、N通过PCR的方法连接起来，我们观察上面的引物M2和N1，会发现它们要比另外两条引物长很多，为什么要进行这样设计呢？原来这是因为在设计的时候将M2的3’端加入了20个N基因5’端的序列，在N1的5’端加入了20个M基因3’端的序列，然后再进行如下相关步骤：（1）以M1、M2扩增M基因，N1、N2扩增N基因（2）回收M、N基因（3）以M、N为共同的模板，M1和N2为引物，扩增M+N，这样就将M+N拼接起来了。
2023届高考二轮总复习试题 专题8 生物技术与工程 命题篇强化练10(专项命题一)
命题篇强化练10(专项命题一)1.[PCR技术及其应用](2022湖北黄冈一模)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增,从而获得目的基因的方法。
某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变,使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG),从而提高水蛭素的抗凝血活性,原理如图所示。
下列说法错误的是()注:引物突起处代表与模板链不能互补的突变位点。
A.过程①需要模板、含Mg2+的缓冲液、引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等B.若引物2的突变位点设计为A,则引物3的突变位点应设计为GC.经过过程④获得的杂交DNA有2种,只有其中一种可以经过过程⑤获得目的基因D.以过程⑤获得的目的基因为模板,可以使用引物1和引物4进行PCR2.[PCR技术及其应用](2022天津一模)通过设计引物,运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。
如图为基因工程中获取突变基因的过程,其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对,反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。
有关叙述不正确的是()A.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入载体B.在PCR反应体系中还需要加入4种游离的脱氧核苷酸、Taq DNA聚合酶等C.第3轮PCR,引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因D.第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/23.[PCR技术及其应用](2022北京一模)小鼠肿瘤转移抑制基因(kissl基因)仅在特定组织中表达。
在雌激素的诱导下,细胞内信号转导分子可以与kissl基因启动子的特定区域结合,激活kissl基因的转录。
研究者扩增了kissl基因启动子不同长度的片段P1、P2、P3和P4,分别构建这些片段与绿色荧光蛋白基因(G)融合的载体,转入体外培养的特定细胞中,在培养液中添加雌激素,以确定不同片段的转录活性。
重叠pcr原理
重叠pcr原理
重叠PCR是一种用于扩增DNA序列的特殊PCR方法。
它基于两个相互重叠的引物同时在反向和正向方向上进行PCR扩增，以产生重叠的片段。
重叠PCR通常用于在实验室中构建DNA片段、基因工程和分子生物学研究中。
重叠PCR的原理是基于引物的设计。
通常情况下，引物的设计应尽量避免相互补的序列，以减少非特异性扩增的产生。
然而，在重叠PCR中，引物的设计是特殊的。
引物的设计应使其相互重叠，并在PCR反应中同时作用。
这样，PCR扩增的产物将具有重叠的序列。
在重叠PCR反应中，两个引物的3'末端分别与目标序列的相应部分互补。
在PCR的早期循环中，两个引物将结合目标序列的两个相邻区域，并启动扩增反应。
在后续循环中，PCR 反应将在两个引物分别结合目标序列的两个相邻区域，并产生重叠的扩增产物。
重叠PCR还可以通过引入点突变、缺失或插入等修饰来构建新的DNA序列。
通过设计引物使其与目标序列的两个相邻区域有所重叠，并引入适当的修饰，可以在PCR扩增中产生带有特定修饰的重叠片段。
这些重叠片段可以用于构建新的DNA序列，进行基因工程操作或进行其他分子生物学研究。
总之，重叠PCR是一种特殊的PCR方法，通过引物的设计使其在PCR反应中同时作用，产生重叠的扩增片段，用于构建新的DNA序列或进行分子生物学研究。
对“对重叠延伸pcr技术原理理解及举例分析”一文的修正
对“对重叠延伸pcr技术原理理解及举例分析”一文的修正重叠延伸PCR技术是一种用于分离两个互补片段之间的重叠片段的新型聚合酶链反应（PCR）技术。
它由美国著名DNA组学专家艾伯特克里斯特（AlbertvonKistowski）在1993年发明，由于其应用技术简单、成本低、效率高，因此迅速受到生物学界的欢迎，并成为研究DNA序列的一种重要方法。
本文就对此前文章“对重叠延伸PCR 技术原理理解及其举例分析”做出修正，以更全面深入的了解这种技术的原理及应用。
先来详细介绍一下重叠延伸PCR技术的实验步骤及原理：首先，通过重叠片段标记法将被测样本的特殊片段特异性分离出来，并加入重叠延伸PCR反应系统；然后，添加双聚体酶（Taq polymerase）、dNTP（单核苷酸），以及一种促进PCR反应的配体；最后，将系统加热至95°C，使双聚体酶活化，然后逐渐降温至60°C，这就是重叠延伸PCR反应的原理。
重叠延伸PCR技术具有很多优势，被广泛应用于许多生物学领域，其中最为重要的是：首先，它可以有效分离特定的DNA特异片段，从而提高了检测效率；其次，它可以检测DNA片段的相对程度，以及在不同样本中的相对分布情况；最后，它可以以低成本、高效率的方式来分析复杂的DNA序列。
此外，重叠延伸PCR技术也可以被运用到一些其他的研究领域，例如鉴定病原体、检测疾病、筛选单一基因突变、检测菌株的耐药性等。
然而，重叠延伸PCR技术也存在一些缺点。
首先，它仅能检测指定片段，无法实现快速检测；其次，检测结果受到受体DNA程度的影响；最后，它仅适用于DNA片段的分析，不可用于其他类型的分子物质的分析。
综上所述，重叠延伸PCR技术在一些特定场景下优势明显，具有极高的应用价值和潜力。
但它仍需在一些方面进行改进才能充分发挥其实用性。
未来我们希望可以将重叠延伸PCR运用到更多的生物学研究中，以及在其它学科的应用。
重叠pcr原理
重叠pcr原理重叠PCR原理。
重叠PCR（Overlap extension PCR）是一种用于构建特定DNA序列的方法，它通过两轮PCR反应来实现。
这种方法可以在DNA分子的两个不相邻的区域上引入特定的突变、插入或删除，是分子生物学研究中常用的技术手段之一。
首先，我们需要准备两对引物，每对引物包括外向引物和内向引物。
外向引物用于扩增目标DNA的两侧，而内向引物则用于扩增目标DNA的重叠区域。
在第一轮PCR反应中，分别使用两对引物来扩增两个片段的DNA。
然后，将两个PCR 产物混合在一起，并进行第二轮PCR反应，这样就能够得到重叠的DNA片段。
重叠PCR的原理主要包括以下几个步骤：1. 引物设计，首先需要设计两对引物，确保它们能够在目标DNA序列上扩增出两个片段，并且这两个片段能够在重叠区域产生交叉。
2. 第一轮PCR反应，分别使用两对引物来扩增两个片段的DNA。
在这一步中，需要对PCR反应条件进行优化，确保两个片段的扩增效率和特异性。
3. PCR产物混合，将第一轮PCR反应得到的两个片段的DNA产物混合在一起。
4. 第二轮PCR反应，使用外向引物来扩增整个重叠的DNA片段。
在这一步中，需要对PCR反应条件进行进一步的优化，确保得到高纯度和高产量的重叠PCR产物。
通过重叠PCR，我们可以实现对DNA序列的精准编辑，包括点突变、插入、删除等操作。
这种方法在基因工程、蛋白质工程等领域具有广泛的应用，为研究人员提供了便利和灵活性。
总之，重叠PCR是一种强大的分子生物学技术，它通过两轮PCR反应来实现对DNA序列的精准编辑，为基因工程和蛋白质工程等领域的研究提供了重要的技术支持。
希望本文对重叠PCR的原理有所帮助，让读者对这一技术有更深入的理解。
利用重叠延伸PCR技术进行DNA的人工合成
利用重叠延伸PCR 技术进行DNA 的人工合成杨宇,吴元华3,郑雅楠 (沈阳农业大学植物保护学院,辽宁沈阳110161)摘要 重叠延伸PCR 技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板进行PCR 扩增,从而获得目的DNA 基因片段的方法。
该技术在目的基因的人工合成及外源蛋白在宿主中的高效表达等方面显示出良好的应用前景。
综述了重叠延伸PCR 技术的原理、反应条件的优化及其应用。
关键词 重叠延伸PCR ;基因合成中图分类号 Q789 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2006)09-1810-02Amplification of DNA Sequence w ith Overlap 2extension PCRYANG Yu et al (Plant Protection C ollege of Shenyang Agricultural University ,Shenyang ,Liaoning 110161)Abstract G ene splicing by overlap extension is an approach for recombining DNA m olecules at precise junctions irrespective of nucleotide sequences at the recombination site.T he prim ers are designed s o that the ends of the products contain com plem entary sequences.W hen the tw o products are m ixed ,de 2natured ,and reannealed ,the strands having the m atching sequences at their 3’ends overlap and act as prim ers for each other.T his sim ple and w idely ap 2plicable approach has great advantages over other recombinant DNA techniques in synthesis of gene.T his article summ arized the principle ,reaction condi 2tions ,and applications of the S OE 2PCR.K ey w ords S OE 2PCR ;Synthesis of gene DNA 的人工合成一直是基因研究工作的重要环节,目前获得目的基因的方法主要有2种:一种为采用PCR 的方法直接对模板的目的区域进行扩增;另一种为利用DNA 合成仪器直接合成单链的DNA 片段。
重叠延伸PCR
重叠延伸PCR重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物.重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计.重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。
以下是重叠延伸PCR的原理及两基因的引物设计：A基因：上游（F1）与开放阅读框起始密码子附近的序列相对应，并在5 ’末端添加酶切位点和3个保护碱基；下游（R1）与B基因终止密码子附近的序列及A基因5’末端起始密码子附近的序列互补，并去除A基因的终止密码子TAAB基因：上游（F2）与A基因终止密码子附近的序列及B基因5 ’端起始密码子附近的序列相对应，同样去除A基因终止密码子TAA；下游（R2）与B基因的开放阅读框终止密码子序列互补，并在5’末端添加酶切位点和2个保护碱基。
先分别用F1、R1，F2、R2扩增出A和B基因，然后再用F1和R2将两基因连接起来，得到融合基因。
重叠PCR的应用是非常广泛的，他的原理其实很简单：比如说有两个基因或者说一个启动子和一个基因，你要将他们连接到一起，我们首先想到的方法当然是借助于酶切的方法，但有时我们并不一定能构找到合适的酶切位点，或者说我们找到了酶切位点，但这种酶非常特殊或者又很贵，我们可能只用一次，这样购买酶就变成了一种浪费，难道没有别的办法了吗？当然有，那就是重组PCR技术。
举个例子可能更容易说明。
比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B。
A的序列为5-atgcatgctagctagaacgctacgctgactaccccctgatc-3，B的序列为5-atgctagtagctagccccccccaggggataattttttaaaacg-3。
重叠pcr原理
重叠pcr原理
重叠PCR（Overlap PCR）是一种常用的分子生物学技术，用
于合成具有重组DNA序列的片段。
重叠PCR的原理基于DNA片段的互相重叠。
在重叠PCR中，通常需要设计两个引物，这两个引物的末端各含有与目标序列相互重叠的片段。
这样，在PCR反应中，引物会首先与DNA
模板结合，并扩增片段的两个末端。
然后，两个扩增产物通过重叠互相为模板，并进行二次扩增，最终产生一个完整的
DNA片段。
重叠PCR通常分为两个步骤：第一个步骤是进行扩增，通过
反应体系中的引物与模板DNA结合，选择性地扩增出希望获
得的片段的两个末端。
功率：维度,第二个步骤是进行二次扩增，将两个扩增产物互相为模板，通过扩增合成出完整的
DNA片段。
这种方法通常用于构建重组蛋白或获得特定的DNA序列。
例如，可以通过重叠PCR在两个DNA片段之间插入不同的序列，实现DNA重组；或者可以使用重叠PCR扩增出特定的DNA
片段，用于进一步的分析和研究。
总之，重叠PCR利用了DNA片段的互相重叠特性，通过两次扩增反应合成出具有重组DNA序列的片段。
这种方法灵活、
高效，广泛应用于分子生物学和基因工程领域。
专题3 中学阶段通过PCR技术实现DNA重叠拼接的应用
专题3 中学阶段通过PCR技术实现DNA重叠拼接的应用（高中阶段生物学应考、备考用）PCR技术实现DNA重叠拼接的原理：将不同来源DNA的重叠拼接延伸，也是常规PCR技术的应用之一，它依据需要连接的不同DNA或基因的片段，设计出多对具有互补末端的2种DNA引物，先分段对模板DNA或基因进行扩增产生重叠链（一端具有互补序列的单链），再将PCR产物混合，其中的重叠链通过碱基互补配对结合、并互为模板而延伸，最终实现将不同来源的DNA片段重叠拼接，获得的重组DNA再通过PCR技术扩增后，可用于构建基因表达载体等。
专题破解习题精选1．（江苏常州高三统考）重叠延伸PCR技术是常规PCR技术的衍生，它依据需要连接的基因中核苷酸序列（或基因片段）设计出多对具有互补末端的引物，先分段对模板进行扩增，再将PCR产物混合，其中的重叠链将相互搭桥、互为模板而延伸，最终实现不同来源的扩增片段重叠拼接起来的目的，如下图1所示。
请分析并回答下列问题：（1）图1中的过程②在________个反应体系中进行，原因是_____________。
经过程②后，体系中存在不同长度的DNA片段，获取所需DNA的方法是____________。
①中引物2和引物3的游离部分分别与____________的部分序列同源。
（2）图1中的过程⑥________（填“需要”或“不需要”）另加引物，原因是_______________________。
进行②⑥⑧⑩过程时，需要在一定的缓冲溶液中进行，⑩过程除图示条件还需要加入_______________。
（3）重叠延伸PCR技术可用于基因的定点突变。
基因定点突变是根据目的基因（如图2蛋白A基因）的序列，设计4条单链寡核苷酸片段为引物（图2中的引物A→D），原理是取引物A、B进行PCR1反应，以及引物C、D进行PCR2反应，然后将需要的两个片段混合、延伸并大量扩增。
图2引物B和引物C中的“︿”代表____________，引物B和引物C碱基序列间存在的关系是_________________。
重叠延伸PCR对DNA片段进行定点双突变
578bp 10 μL
uOR F1M u 10 μL
1101bp 10 μL
dNTP M ixture (各 2. 5 mmol·L - 1 )
4 μL
上游引物 ( 10μmol·L - 1 )
Pa 1μL
下游引物 ( 10μmol·L -来自1 )uOR F1M uR e1μL
DNA 模板
PB - W1534 100 ng
up to 50μL
uORF1 + 2 Mu 10 μL
4 μL Pa 1μL Pb 1μL 纯化的 1101bp及 459bp片段各 200ng 0. 5μL
up to 50 μL
·80·
985bp 578bp uOR F1M u 1101 bp 459bp uORF1 + 2Mu
预变性 95℃ 3 m in 95℃ 3 m in 95℃ 3 m in 95℃ 3 m in 95℃ 3 m in 95℃ 3 m in
循环次数 25 25 25 25 25 25
末次延伸 68℃ 7 m in 68℃ 7 m in 68℃ 7 m in 68℃ 7 m in 68℃ 7 m in 68℃ 7 m in
1. 4 双位点突变 DNA 片段的克隆及测序 将上述重叠延伸 PCR 获得的双位点突变 DNA
片段经 琼 脂 糖 电 泳 、纯 化 回 收 及 双 酶 切 ( Sac I和 H indⅢ)后与同样经 Sac I和 H ind Ⅲ双酶切的载体 PGL3 - B asic连接 ,连接产物转化大肠杆菌 JM109, 采用含 50 mg·L - 1氨苄青霉素的 LB 平板筛选阳性 转化子 ,进一步用 PCR 及双酶切鉴定阳性克隆 ,并 取阳性克隆菌液委托上海英骏生物技术有限公司用 AB I3730 DNA 测序仪进行序列测定 ,测序引物为与 载体 PGL3 - B asic退火的 GLp rim er2: 5′- CTTTAT2 GTTTTTGGCGTCTTCCA - 3′,为反向测序 ,即从插入 片段的 3′端开始测序 。
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的抗逆能力 。其具 有的综合抗逆 能力是在 特殊生态 环 境下长期发育进化形成 的， 对其抗逆机理及其生物 特性
进行系统研究有助于揭开新 的生物抗逆机制。
研究 人员通 过 对 新疆 木 耳 蘑 菇 的化 学 成分 分 析 后， 发现该 菌子 实体 中含有 ｌ ８种氨基酸 ， 菌盖 、 菌柄氨 基酸含 量（ ｒ ／ｋ ｇ ） 分别 是 １ ９ ． ４ ６和 ｌ ３ ． １ ４ ； ８种必需 氨基 酸含量分 别是 ９ ． ２ ６和 ２ ． ４ １ ； 饱和脂 肪 酸有粗 脂肪 、 棕 榈酸 、 硬脂 酸、 棕 榈油酸、 花生四烯酸 ， 在 菌盖和 菌柄含
生 物 学教 学 ２ ０ １ ３ 年（ 第３ ８ 卷） 第４ 期
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６ ５・
重 叠 延伸 Ｐ Ｃ Ｒ技 术 及 其在 生物 学 中的应 用
李 守宇 （ 江 苏 省 宜 兴 第 一 中 学２ １ ４ ２ ０ ６ ）
摘 要 重叠延伸 Ｐ Ｃ Ｒ技术是一种通 过寡 聚核苷酸链之 间重叠 的部分 互相搭桥 、 互 为模板 ， 通 过多次 Ｐ Ｃ Ｒ扩增 ， 从而获 得 目的 重叠延伸 Ｐ Ｃ Ｒ技术 片段基因合成 融合基因构建 基 因定点诱变 Ｄ Ｎ Ａ基因片段的方法。该技术高效 、 快捷 、 经济 ， 在基因功能研究方面显示 良好 的应用前景 。 关键词
１ 重叠延伸 Ｐ Ｃ Ｒ技术简介 重叠延伸 Ｐ Ｃ Ｒ技术 （ Ｓ Ｏ Ｅ Ｐ Ｃ Ｒ） 是采 用具 有互 补 末 端 的引物 ， 使 Ｐ Ｃ Ｒ产 物形 成 了重 叠链 ， 从而 在 随后 的扩增反应 中通 过重 叠链 的延伸 ， 将 不 同来 源 的扩增 片段重叠拼接起来 的技术 。
量（ ｇ ／ １ ０ ０ ｇ ） 达到 ｌ ３ ． ４ ４和 １ ３ ． １ １ ； 不饱 和脂 肪酸 有 油
新疆木 耳蘑 菇 至今仍不 能人工 驯 化和 培育 ， 由于 其 肉质鲜美 、 营养丰富。每年收获季节 ， 人为过 度采收 现象较严重 ， 其 野生生长环境 已经受 到破坏 ， 近年来产 量也不断下 降。然 而菇价 却连年 飙升 ， 已达 ７ ０ ０元／ ｋ ｇ 干菇 ， 亟待采取 保护 和合理 开发利 用 为 目的的科 学研
究， 既为保护环境做 贡献 ， 尤为 当地农牧 民增 收创收提 供 出路 。
主 要参考文献
酸、 亚油酸 、 亚麻 酸 ， 含 量在 茵盖和菌病 占 ８ ６ ． ５ ６和 ８ ６ ．
２ ６ ； 蛋 白质含 量 在菌 盖 和菌 柄 中 （ ｇ ／ １ ０ ０ ｇ ） 分别 为 ｌ ９ ． ０ ６和 １ ５ ． ７ ６ ； 矿 质元 素含量丰 富 ， Ｚ ｎ含量为 ８ ２ ３ ｍ ｇ ／ ｋ ｇ ， 多糖含量 １ １ ． ３ ３ ％ Ｊ 。此 外 ， 还 含 有甙类 、 有机酸、 皂
聚合 酶链式 反应 （ Ｐ Ｃ Ｒ ） 是一种在体 外模拟发 生于
细胞 内的 Ｄ Ｎ Ａ快速扩增特定基 因或 Ｄ Ｎ Ａ序 列的 复制
１ ．１ 引物 设 计 重 叠互 补 引 物 的设 计 是 重 叠延 伸 Ｐ Ｃ Ｒ技术 成功 的关 键。相连 引 物间 的重 叠 区域 以 １ ５
—
关键 ， 并 且 尽 量 避 免 出 现 二 级 结 构 及 引 物 二 聚 体
等［ ］ 。
多种 Ｐ Ｃ Ｒ方法 ， 其 中重叠延伸 Ｐ Ｃ Ｒ技术 就是一项新 型 的Ｐ Ｃ Ｒ方法 ， 在 长片段 基 因 的合 成 、 融合 基 因 的构建 和基 因的定点突变 等方面 有其广 泛而独特 的应用 Ｏ
１ ． ２ Ｔ ａ ｑ酶 选择
为了最 大限度地避免 碱基 的错 配 ，
重叠延 伸 Ｐ Ｃ Ｒ反应应避免使用普通 Ｔ ａ ｑ酶 ， 因为Ｔ ａ ｑ ６ 新疆木一５月 中旬 ， 春雨 过后 或 经 冰 山雪水浸润之地 ， 气温多在 ｌ ５ ℃一 ２ １ ℃ 。此 时， 胡 杨林 地 、 新疆杨 、 怪 柳灌木 丛 附近 ， 木 耳蘑 菇会 大 量 出 菇， 有单 生 、 散生或 群生 ， 数 量 较密 集 。在 离林 地较 远
甙、 内酯 、 香豆素 、 生物碱 、 甾醇及 三萜 、 挥发 油、 强心苷 等化学成 分［ 。新 疆 木耳 蘑菇 不 但具 有 较 高 的营养
［ １ ］ 卯晓岚． １ ９ ９ １ ． 中国大型真菌． 郑州 ： 河 南科学技术 出版社 ， ６ ０ ４ ［ ２ ］ 朱铭莪 ， 薛泉红 ， 和文祥 ， 等． １ ９ ９ ９ ． 巴楚蘑菇研 究 Ｉ 营养成分 ． 西 北农林学报 ， ８ （ ３ ） ： ７ ７ — ８ ０ ［ ３ ］ 王俊燕． ２ ０ ０ ７ ． 新疆的珍贵食用 菌—— 白柄 马鞍菌． 食用 菌， （ ２ ） ：
的地 面草丛 中也有稀稀疏疏 、 零零 星星蘑菇破 土而 出， 可 能为泛洪期孢子被洪水输送而来导致 的出菇。 ５ 新疆木 耳蘑菇的营养成分
新疆木耳蘑 菇一 年一发 生 ， 出菇期 短而 迅速 ， 到６
月上旬几乎再找不到其踪迹 ， 是 欧亚 大陆腹 地干旱气候 区形成的独特耐旱型野生食用菌 ， 并 能在较 宽的温度范 围内生长 ， 并对极端高温有较强的耐受性。木耳蘑 菇发
过程 的技术 。此项技术在 现代 分子生物 学领域具 有非
常重要 的地位 ， 因其具有 简易、 高效 、 快速 、 易于操作 等 优点 已经成 为许多实验 的基础 。并且近 年来衍生 出了
２ ０个 碱 基 为 宜 ， 重 叠 区 域 中应 尽 量 避 免 富含 Ａ Ｔ
（ Ａ Ｔ Ｉ Ｔ Ａ， Ａ Ａ Ｔ 从 、 从ｒ Ｉ ｆ Ｉ ＇ Ａ Ａ等 ）的 序列 ， 因为 在 片段 合成过程 中， 接 头 区 富含 Ａ Ｔ的 区域 极 易发 生 错 配 。 同时 ， 在 引物 设计 中， 除 了需要 考虑 一般 Ｐ Ｃ Ｒ引物 设 计 的 问题外 ， 在 Ｔ ｍ值 的控制方面 ， 设计 的全部引 物最 好 有相 同或相近 的 Ｔ ｍ值 ， 以便扩增 步骤 的顺利进 行 ， 否则 可能会导致 引 物无法 组合使 用 ， 这 是引物 设计 的