基因敲除动物模型
动脉粥样硬化（LDLR）小鼠模型介绍
动脉粥样硬化（LDLR）小鼠模型介绍
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种复杂的慢性炎症疾病，包括冠状动脉疾病、心肌梗死、多种亚型脑卒中、外周血管疾病和主动脉瘤，主要特征是动脉壁上斑块积聚。
基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型是目前较为认可的探讨动脉粥样硬化发病机制及寻找新药物靶点的关键工具，也应用于潜在抗动脉粥样硬化药物的药理和毒理研究。
载脂蛋白E(ApoE)、低密度脂蛋白受体(LDLR)和B类Ⅰ型清道夫受体(SR-B1)等基因的表达促进机体脂质、胆固醇和低密度脂蛋白等转运和代谢，维持血管正常功能，敲除这些基因会引起脂质转运及代谢紊乱从而诱发动脉粥样硬化及并发症的发生发展。
LDLR是介导胆固醇进入细胞的主要受体，ApoB 100作为 LDL主要的载脂蛋白，在高脂肪饲料喂养的动物中与富含甘油三酯的VLDL浓度呈正相关。
LDLR被敲除或沉默影响胆固醇的转运，破坏细胞内胆固醇平衡，造成胆固醇聚积在动脉壁，诱发AS。
LDLR基因敲除(LDLR -/-)小鼠AS模型具有在人类家族性高胆固醇血症中观察到主动脉瓣和主动脉根部的病变特征，是目前在AS研究领域中应用最多的基因工程动物模型之一。
LDLR基因突变也是当前研究的一个热点，目前至少已发现180种LDLR基因突变型，一些研究通过构建LDLR基因突变小鼠来研究基因突变导致的动脉粥样硬化发病机制。
基因敲除小鼠的实验流程
基因敲除小鼠的实验流程
一、前期准备
1、检索标记基因：采用全基因组测序技术或大规模基因组关联分析法筛选出敲除对研究有重要作用的基因；
2、设计敲除构建：根据筛选出的基因特异性序列，对基因进行深入分析，结合已有研究成果，根据基因的功能和结构确定可有效敲除的基因结构模型；
3、制备修饰质粒：根据设计模型，制备适当的质粒，使其具有足够的重组能力和具有全套的特异性对象；
4、选择载体：选择合适的载体（含有敲除的质粒），使敲除的基因更容易被载入小鼠细胞中进行修饰；
二、基因敲除实验
1、小鼠胚胎动物模型：小鼠胚胎是敲除小鼠研究的传统动物模型，采用小鼠母体体外受精，利用载体质粒将敲除基因引入胚胎，敲除的基因将被遗传给后代小鼠；
2、小鼠嵌合体模型：采用基因修饰技术将敲除基因嵌入小鼠细胞的质粒，多功能的抗体定位蛋白可以用来将质粒载入小鼠细胞，利用抗体定位系统，将修饰的嵌入小鼠胚胎，诱导而成嵌合体，使敲除的基因能够传递给后代；
3、选择敲除后的小鼠：将敲除实验的小鼠孵化。
构建动物模型的方法
构建动物模型的方法动物模型是生物学、医学以及其他相关领域研究中使用的非常重要的工具。
这些模型能够帮助研究人员更好地分析动物的形态各种复杂的行为特征，并进行实验，以获得新的知识。
构建动物模型的方法有很多，在本文中，我们将介绍一些常见的构建动物模型的方法。
首先，生物学家可以采用“细胞培养”的方法，将多个动物的细胞放入一个培养基中，然后观察不同细胞的发育及其产物的表现。
这种方法通常用于研究各种细胞的发育及其表型，或者用于检测某种物质对细胞发育的影响。
其次，生物学家们也可以采用“模型动物实验”的方法，在实验室中建立各种动物模型，模拟动物的生活。
这种方法的主要目的是为了模拟动物的生活状况，探究动物的各种行为特征，从而为学术研究提供测量和评估数据。
第三，生物学家也可以采用“实时数据采集”的方法来构建动物模型，将相关行为特征的实时数据收集到系统中，以跟踪模型动物的行为和发育特征。
这种方法实时监测模型动物的行为特征，可以获得更多关于动物特征的信息，帮助研究人员更好地了解动物的行为和发育特征。
第四，生物学家也可以采用“实体动物实验”的方法，在实体实验中通过观察模型动物的行为和生理特征，来构建动物模型。
借助实验，研究人员可以更深入地了解动物的行为特征，以及不同环境、温度、营养状况等因素对动物形态和行为特征的影响。
最后，生物学家也可以采用“基因敲除”的方法，分析动物在遗传上的表现型特征，从而构建动物模型。
通过基因敲除，可以发现动物体内特定基因的表达对其行为特征或发育特征的影响。
这种方法对于研究基因调节机制以及基因-行为表型的相互关系很有帮助。
以上就是构建动物模型的几种常见方法。
它们为研究人员提供了有效地检测动物各种行为特征及发育特征的机会，使研究人员可以更深入地了解动物生活状况，从而促进和推进一系列生物学研究。
基因敲除型小鼠缩写
基因敲除型小鼠缩写基因敲除型小鼠（Knockout Mouse）是一种在实验室中经过基因编辑技术制造的小鼠模型。
通过敲除特定基因，科学家可以研究该基因在生物体发育、生理功能和疾病发展中的作用。
基因敲除型小鼠的出现为生命科学研究提供了重要工具，有助于我们更深入地理解基因对生命活动的影响。
在基因敲除型小鼠的制备过程中，科学家会选择目标基因，并使用基因编辑技术（如CRISPR/Cas9技术）将其敲除。
通过这种方式，小鼠的基因组中将不再包含目标基因的正常拷贝，从而使得该基因无法正常表达。
这样一来，科学家便可以观察到在缺失该基因的小鼠体内所产生的生理和行为变化。
基因敲除型小鼠的制备需要经过一系列复杂的实验操作。
首先，科学家需要设计合适的引物和合成寡核苷酸，用于引导CRISPR/Cas9系统精确剪切目标基因。
然后，利用载体将CRISPR/Cas9系统导入小鼠的受精卵中，使其在早期胚胎发育阶段就发挥作用。
经过一段时间的培养和发育，科学家便可以获得具有基因敲除突变的小鼠。
基因敲除型小鼠的制备不仅需要技术娴熟的实验操作，还需要对基因功能和细胞生物学等领域的深入理解。
科学家需要充分了解目标基因在生物体中的作用机制，以及其与其他基因的相互作用关系。
只有在对基因功能有清晰认识的基础上，才能准确选择目标基因，并制备出具有特定基因敲除突变的小鼠模型。
基因敲除型小鼠的应用范围非常广泛。
它们可以用于研究基因在发育过程中的作用，探究基因在特定组织和器官中的功能，以及揭示基因与疾病之间的关联。
通过对基因敲除型小鼠进行行为学、生理学和病理学等多方面的分析，科学家可以获取大量关于基因功能的宝贵信息。
基因敲除型小鼠是生命科学研究中的重要工具，为我们研究基因功能和疾病发展提供了有力支持。
通过制备基因敲除型小鼠模型，科学家可以更深入地了解基因的作用机制，从而为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
基因敲除型小鼠的研究将继续推动生命科学领域的发展，为人类健康做出更大的贡献。
几种基因敲除鼠简介
目录
• 基因敲除鼠概述 • 条件性基因敲除鼠 • 全敲除鼠 • 诱导性基因敲除鼠
01 基因敲除鼠概述
基因敲除鼠的定义
• 基因敲除鼠：通过基因工程技术，将特定基因从 老鼠体内敲除，从而产生具有特定表型特征的转 基因动物。
基因敲除鼠的用途
疾病模型
药物筛选
基因敲除鼠可以模拟人类遗传性疾病 的发生和发展过程，用于研究疾病的 发病机制和治疗方法。
全敲除鼠通常是通过将经过基因 编辑的胚胎干细胞注入早期胚胎 中，然后移植到代孕母鼠体内发
育而成。
全敲除鼠的应用
01
02
03
疾病研究
全敲除鼠可以模拟人类遗 传性疾病，用于研究疾病 的发病机制、病理生理变 化和药物筛选等。
药物研发
全敲除鼠可以用于评估新 药对特定基因缺陷的治疗 效果，加速药物的研发进 程。
部分基因敲除鼠
03
将特定基因部分敲除或敲低，产生具有部分缺失或降低该基因
表达的转基因动物。
02 条件性基因敲除鼠
条件性基因敲除鼠的原理
条件性基因敲除鼠是通过基因打靶技术，将特 定基因的启动子替换为可诱导的启动子，使得 基因的表达只在特定条件下被激活或沉默。
可诱导的启动子通常来源于激素响应元件或化 学诱导系统，如四环素响应系统、干扰素响应 系统等。
药物研发
利用条件性基因敲除鼠可以筛选出 对特定疾病有疗效的药物，缩短药 物研发周期并提高成功率。
条件性基因敲除鼠的优缺点
优点
条件性基因敲除鼠具有高度特异性，可以避免全身敲除基因带来的副作用；同 时，可以在特定时间和空间范围内研究基因的功能，提高实验的可控性和精确 度。
缺点
条件性基因敲除鼠的构建过程复杂，需要较高的技术要求和时间成本；同时， 诱导系统的效果可能受到多种因素的影响，如激素水平、给药方式等。
基因敲除小鼠
基因敲除小鼠摘要基因敲除小鼠是一种常用的实验动物模型，可以帮助科学家研究基因在生物体发育和功能中的作用。
本文将介绍基因敲除小鼠的定义、用途以及常用的敲除方法，帮助读者了解基因敲除小鼠在生物学研究中的重要性和应用。
引言基因敲除小鼠是指通过干扰或删除特定基因，使小鼠体内该基因表达受到抑制或消失的实验模型。
这种模型被广泛应用于基因功能研究、疾病机制研究以及药物开发等领域。
基因敲除方法基因敲除小鼠的制备有多种方法，其中最常用的是胚胎干细胞敲除和CRISPR/Cas9系统。
胚胎干细胞敲除胚胎干细胞敲除是一种传统的基因敲除方法。
首先，从小鼠胚胎中获得胚胎干细胞，然后通过基因转染或基因突变等方式，使目标基因发生敲除突变。
最后，将敲除的胚胎干细胞注入到早期小鼠胚胎中，形成敲除小鼠。
CRISPR/Cas9系统CRISPR/Cas9系统是一种新兴的基因编辑技术，已经在基因敲除小鼠制备中得到广泛应用。
该系统利用Cas9核酸酶和特定的引导RNA来定向切割目标基因的DNA链，从而导致基因发生敲除或突变。
基因敲除小鼠的应用基因敲除小鼠在生物学研究中有着广泛的应用，以下是其中几个重要的应用领域：基因功能研究通过敲除特定基因，科学家可以观察与该基因相关的表型变化，从而揭示该基因在生物体发育和功能中的作用。
这对于揭示基因调控网络、疾病机制的研究具有重要意义。
疾病模型研究基因敲除小鼠常被用来构建各种疾病模型，如癌症、心血管疾病等。
这些模型可以模拟人类疾病的发生和发展过程，为相关疾病的研究提供了有力的工具。
药物开发基因敲除小鼠在药物开发中也起着重要的作用。
通过敲除特定基因可以观察药物对目标基因的影响，从而评估药物的疗效和安全性。
结论基因敲除小鼠是一种重要的实验动物模型，被广泛应用于基因功能研究、疾病模型研究以及药物开发等领域。
不同的敲除方法可根据具体实验需求选择使用。
基因敲除小鼠在解析基因功能、揭示疾病机制和评估药物疗效方面发挥着重要的作用，为生物学研究提供了强大的工具。
TSC1转基因敲除小鼠动物模型的构建及敲除效果的初步研究
Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；４．Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｈｏｐｉｔａｌ ｏｆ Ｊｉ Ｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ
１３００２１，Ｃｈｉｎａ；５．Ｃｈｉｎａ－Ｊａｐａｎ Ｕｎｉｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００３３，Ｃｈｉｎａ）
ｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ．Ａｎｄ ｐ－Ｓ６ｏｆ ｔｈｏｓｅ ３ｔｒａｎｓ－
ｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｕｐ （Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｌｉｍｂ ｂｕｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ，
９．肿瘤医学省部共建协同创新中心，广东 广州５１００６０）
摘 要：目的 为探讨 ｍＴＯＲ 信号通路在骨骼发育过程中的机制作用，建立骨骼发育 相 关 的 ＴＳＣ１ 转 基 因 小 鼠，提
供稳定的动物模型。方法 取８周龄健康清洁级 ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ小鼠分别与肢芽 干 细 胞 特 异 性 重 组 酶 （Ｐｒｘ－１－Ｃｒｅ）小
ＷＡＮＧ Ｙａｎ５，ｅｔ ａｌ．（１．Ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；
２．Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；３．Ｏｒｔｈｐａｅｄｉｃ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｇｕａｎｇ ｄｏｎｇ
基因敲除小鼠原理
基因敲除小鼠原理
基因敲除是一种常用的遗传学实验技术，通过人工干预使目标基因无法正常表达。
基因敲除小鼠则是在小鼠模型中应用基因敲除技术。
基因敲除的原理是利用DNA重组技术制备特定的敲除载体。
该载体中携带有目标基因的一部分DNA序列，同时还含有选择标记基因和其他必要的DNA片段。
敲除载体经过转染进入靶细胞后，在细胞内会发生DNA重组，导致目标基因发生敲除。
继而，选择标记基因的表达使得细胞能够被筛选出来。
在基因敲除小鼠的制备上，可以通过体外受精的方式将敲除载体导入受精卵中，或者通过基因编辑技术如CRISPR/Cas9在早期胚胎阶段实现基因敲除。
随后，带有敲除基因的胚胎会被移植到代孕母鼠体内进行发育。
通过基因敲除小鼠模型，研究人员可以研究目标基因的功能以及生理、病理学功能。
这种技术广泛应用于研究基因对发育、生长、免疫应答、代谢、行为等方面的影响。
基因敲除小鼠模型也被用于疾病模拟，如研究癌症、神经系统疾病等。
总之，基因敲除小鼠是通过敲除目标基因实现对特定基因功能的研究，为深入理解基因的功能以及疾病发生机制提供了重要工具。
基因敲除小鼠的方法
基因敲除小鼠的方法基因敲除小鼠模型是生物医学研究领域中常用的实验动物模型之一。
通过对特定基因进行敲除，科研人员可以研究该基因在生物体内的功能和影响，从而深入了解该基因对生物体的生理和病理过程的调控作用，为人类疾病治疗和药物研发提供重要的实验基础。
下面我们将介绍关于基因敲除小鼠的方法。
一、基因敲除小鼠的原理和意义1.1 基因敲除原理基因敲除是指通过人工手段破坏特定基因的DNA序列，使其失去功能。
在小鼠模型中，通常利用基因敲除技术将目标基因进行突变或删除，从而观察小鼠在不同生理状态下的表型变化，探索目标基因在生物体内的功能和作用机制。
1.2 基因敲除的意义基因敲除小鼠模型可以帮助科研人员研究特定基因的生物学功能，了解其在生物体内的作用机制。
基因敲除小鼠模型也能够为疾病研究和药物开发提供重要的实验依据，有助于发现新的治疗靶点和疾病治疗方法。
二、基因敲除小鼠的制备方法2.1 基因敲除小鼠的选择在进行基因敲除小鼠实验前，首先需要选择合适的小鼠品系和基因靶向。
常用的小鼠品系包括C57BL/6、BALB/c等，而基因敲除的选择通常基于目标基因在疾病或生理过程中的重要性。
2.2 敲除载体的构建和筛选制备基因敲除小鼠需要先构建敲除载体，通常采用基因工程技术将靶向基因进行突变或删除，然后将这些构建好的载体导入至小鼠胚胎干细胞中，进行筛选和培养。
2.3 胚胎干细胞的培养与筛选在培养和筛选过程中，科研人员需要将导入敲除载体的胚胎干细胞引入小鼠胚胎中，然后进行体外培养和筛选，以筛选出正常的敲除基因小鼠。
2.4 敲除小鼠的鉴定和繁殖成功培育出的敲除小鼠需要进行PCR鉴定和繁殖，以得到稳定传代的敲除小鼠品系。
对敲除小鼠进行系统的表型观察和分析，以确定目标基因敲除后的表型变化。
三、基因敲除小鼠的应用和前景3.1 基因敲除小鼠在生物学研究中的应用基因敲除小鼠模型广泛应用于生物学研究领域，包括生理学、免疫学、神经科学、遗传学等各个领域。
基因敲除小鼠原理
基因敲除小鼠原理基因敲除是一种常用的遗传工程技术，它通过人为地改变生物体的基因组，使得某个特定基因在生物体中失去功能。
基因敲除技术在动物模型研究中得到了广泛的应用，特别是在小鼠模型的构建中发挥着重要作用。
下面将介绍基因敲除小鼠的原理及其应用。
基因敲除小鼠原理。
基因敲除小鼠是指通过基因工程技术，将小鼠的某个特定基因进行改变，使得该基因在小鼠体内失去功能。
基因敲除小鼠的构建通常分为以下几个步骤：1. 选择目标基因，首先需要选择需要敲除的目标基因，通常选择与某种疾病或生理过程相关的基因作为目标。
2. 构建敲除载体，将目标基因的敲除载体导入到小鼠的胚胎干细胞中，使得目标基因在胚胎干细胞中发生敲除。
3. 胚胎干细胞筛选，经过敲除载体导入后，对胚胎干细胞进行筛选，筛选出发生了基因敲除的干细胞。
4. 小鼠胚胎的移植，将发生了基因敲除的胚胎干细胞移植到受精小鼠卵母细胞内，通过体外培育和移植到母体小鼠子宫内，使得基因敲除小鼠的胚胎发育成熟。
5. 基因敲除小鼠的鉴定，对出生的小鼠进行基因型分析，确认是否成功构建了基因敲除小鼠模型。
基因敲除小鼠的应用。
基因敲除小鼠模型在生物医学研究中有着广泛的应用，主要包括以下几个方面：1. 功能基因研究，通过敲除特定基因，可以研究该基因在生物体内的功能及其对生物体生理过程的影响，为相关疾病的研究提供重要的实验模型。
2. 疾病模型构建，基因敲除小鼠模型可用于构建各种疾病模型，如肿瘤模型、免疫缺陷病模型等，用于研究疾病的发病机制及寻找治疗方法。
3. 药物筛选，基因敲除小鼠模型可用于药物的筛选和评价，通过观察敲除某个基因后对药物疗效的影响，为新药的研发提供重要参考。
4. 基因治疗研究，基因敲除小鼠模型可用于基因治疗的研究，通过敲除某个致病基因或导入正常基因，探索基因治疗的可行性及疗效。
总结。
基因敲除小鼠模型是一种重要的生物医学研究工具，通过对特定基因的敲除，可以研究该基因在生物体内的功能及其对生理过程的影响，为相关疾病的研究提供重要的实验模型。
基因敲除鼠 方法
基因敲除鼠方法
基因敲除鼠是一种利用基因编辑技术实现的实验动物模型。
它是通过对小鼠胚胎干细胞进行基因编辑，使其基因组中的目标基因发生永久性的敲除，从而实现对该基因功能的研究。
以下是基因敲除鼠的具体方法：
1.设计合适的基因编辑工具：选择合适的RNA引物或合成具有特定剪切酶活性的酶，如CRISPR/Cas9系统。
2.制备适当的DNA和RNA（或Cas9/sgRNA复合物）：将DNA或RNA分别转染到小鼠胚胎干细胞中，使其与靶基因发生靶向切割或插入。
3.筛选和鉴定：筛选和鉴定敲除细胞，将敲除细胞移植到小鼠胚胎中，培育出敲除小鼠。
4.对敲除小鼠进行验证：通过PCR或转录组分析等技术，确认敲除小鼠已经成功实现，从而得到目标基因敲除的实验动物模型。
需要注意的是，敲除基因会对小鼠的生理和行为表现造成影响，因此需要进行更加详尽的生理和行为分析，确保研究结果的可靠性。
基因敲除小鼠概念及原理
基因敲除小鼠概念及原理
基因敲除小鼠是一种通过基因敲除技术创造出来的实验动物模型。
基因敲除技术是一种新的分子生物学技术，建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上。
基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。
基因敲除小鼠的原理是利用基因同源重组进行基因敲除。
具体来说，通过同源重组将外源基因定点整合入小鼠的基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。
这种技术克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。
基因敲除小鼠具有广泛的应用前景和商业价值，特别是在发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科的研究和治疗中。
这种技术的出现为这些学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有重要的意义。
PirB基因敲除小鼠动物模型及其构建方法[发明专利]
![PirB基因敲除小鼠动物模型及其构建方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/3ccb8d4c5bcfa1c7aa00b52acfc789eb172d9ee8.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911120831.1(22)申请日 2019.11.15(71)申请人 西安医学院地址 710021 陕西省西安市碑林区含光北路74号(72)发明人 苟兴春 张晓华 王晓龙 姜朋涛 程江红 邱忠营 (74)专利代理机构 西安弘理专利事务所 61214代理人 燕肇琪(51)Int.Cl.C12N 15/90(2006.01)C12N 9/22(2006.01)C12N 15/85(2006.01)A01K 67/027(2006.01)(54)发明名称PirB基因敲除小鼠动物模型及其构建方法(57)摘要本发明公开了PirB基因敲除小鼠动物模型及其构建方法，通过以下方法获得：基于CRISPR/Cas9技术，将C57BL/6J小鼠PirB基因待敲除的特异性靶位点gRNA1和gRNA2分别与trancrRNA在25℃孵育10min形成发夹结构；将有活性的gRNA1、gRNA2、Cas9酶和制备好的含有cKO区、同源臂和loxP位点打靶载体显微注射入代孕小鼠受精卵中获得F0代小鼠，再依次获得F1代杂合子小鼠、F2代纯合子小鼠，即得到本发明PirB基因敲除小鼠的模型。
本发明对于PirB基因功能的研究和在体验证提供了良好的基础，特别是敲除PirB后对AD表型和病理学症状的研究具有很高的研究价值。
权利要求书2页 说明书8页序列表1页 附图4页CN 110804629 A 2020.02.18C N 110804629A1.PirB基因敲除小鼠动物模型，其特征在于，所述小鼠动物模型是通过以下方法获得：步骤1、基于CRISPR/Cas9技术，根据PirB基因信息确定C57BL/6J小鼠PirB基因待敲除的特异性靶位点gRNA1和gRNA2，所述gRNA1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述gRNA2的基因序列如SEQ ID NO.2所示；步骤2、通过PCR扩增C57BL/6J小鼠PirB基因的同源臂和cKO区域，采用in-fusion方法构建含有loxP位点的打靶载体；步骤3、将有活性的gRNA1、gRNA2、Cas9蛋白和含有loxP位点线性打靶质粒载体显微注射入代孕小鼠受精卵中，繁育获得F0代小鼠；步骤4、将步骤3中性成熟的阳性F0代小鼠分别与野生型异性小鼠交配繁殖一代，获得F1代杂合子小鼠；步骤5、将步骤4获得的F1代杂合子小鼠近交获得F2代纯合子小鼠，即为本发明构建的PirB基因敲除的小鼠动物模型。
怎样构建条件性基因敲除小鼠模型？
怎样构建条件性基因敲除小鼠模型？作为研究基因体内实验的利器，基因敲除小鼠对于科研人员来说自然不是一个陌生的领域。
然而，全身性基因敲除的小鼠存在着无法忽视的缺陷，即不能特异性地研究特定基因在特定组织内（及特定的时间）的功能。
此外，全身性基因敲除小鼠有时因某些基因对胚胎发育的影响而无法正常分娩，或因出生后严重的生理缺陷而过早死亡，或不能产生后代而不能获得纯合子动物模型。
因此，条件性基因敲除小鼠（conditional gene knock out or knock in）应运而生了（well，人就是那么聪明！）。
条件性基因敲除小鼠的设计利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理。
它们都是位点特异性重组酶系统。
这里以Cre/LoxP系统为例。
比如在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列，得到flox(flanked by loxP)小鼠。
将flox小鼠与带有细胞特异性表达Cre的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。
此外，若与控制Cre表达的其他诱导系统(比如CreERT2)相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。
Cre/loxP系统来源于噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两个组成成分：一个是一段长34bp的DNA序列(LoxP序列)，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
LoxP 的方向由中间这8个碱基决定。
这段LoxP序列是Cre重组酶识别的位点。
令一个组成部分是Cre重组酶。
它是由噬菌体编码的一种由343个氨基酸组成的蛋白。
Cre可以介导两个LoxP位点的重组，从而引起两个LoxP之间DNA序列的缺失。
如果将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下，可以得到Cre组织/细胞特异性表达的Cre小鼠，也叫Cre工具小鼠。
跟Flox小鼠交配之后，可以得到条件性基因敲除小鼠。
医学药物研发中的靶点鉴定和筛选方法
医学药物研发中的靶点鉴定和筛选方法概述：医学药物研发是一个复杂而庞大的过程，其中的靶点鉴定和筛选方法起着至关重要的作用。
靶点是药物作用所直接影响或调节的分子，确定合适的靶点对于药物研发来说至关重要。
本文将介绍医学药物研发中常用的靶点鉴定和筛选方法。
一、基因组学方法1. 基因组测序技术基因组测序技术提供了全面了解细胞内的基因组信息，可以帮助研究人员识别出与特定疾病相关的突变位点或遗传变异。
通过对患者样本与正常样本进行比较，可以筛选出可能与疾病相关的靶点。
2. RNA干扰技术RNA干扰技术允许科学家通过引入人工制造的小RNA分子来沉默指定基因，以评估目标基因敲除对细胞生理功能和致病机制等方面产生的影响。
这种方法有助于确定潜在药物作用于哪些靶点。
二、蛋白质组学方法1. 蛋白质互作网络分析蛋白质互作网络分析可以揭示蛋白质之间的相互作用关系，从而推断出可能的靶点。
基于蛋白质-蛋白质相互作用数据，科学家可以确定具有重要生物学功能的首要候选靶点。
2. 质谱技术质谱技术可以鉴定和测量复杂混合样品中的各种生物大分子，如蛋白质、代谢物等。
利用这种方法，研究人员可以识别出与特定疾病相关的差异表达的蛋白或代谢产物，进而选择适当的药物干预靶点。
三、化学生物学方法1. 高通量筛选（HTS）高通量筛选是一种通过自动化设备对大量药物候选化合物进行快速测试的方法。
在此过程中，针对目标分子进行大规模药理实验，并且根据结果进行初步筛选和优化。
这个过程被广泛应用于新药发现及开发。
2. 三维结构解析通过三维结构解析可以了解药物与靶点之间的空间相互作用，从而指导药物设计和靶向选择。
这种方法主要使用X射线晶体学、核磁共振（NMR）和电子显微镜等技术，对药物和蛋白质复合物的结构进行解析。
四、动物模型方法1. 基因敲除动物模型通过将目标基因敲除或改变其表达水平，研究人员可以观察到在整个生理系统中的变化，并发现与特定疾病相关的重要靶点。
基因敲除动物模型被广泛应用于基础医学和临床医学研究中。
基因敲除动物模型南方模式
基因敲除动物模型南方模式
基因敲除动物模型是研究基因功能的重要手段，其中常用的南方
模式则是基因敲除动物模型的一种。
该模型可以通过特定的方法，将
目标基因进行敲除或者改变其表达情况，从而探究该基因在生物体内
的作用及其相关机制。
下面，本篇文章将围绕基因敲除动物模型南方
模式进行阐述。
首先，基因敲除动物模型南方模式中的“南方”指的是一种DNA
杂交技术，它是一种检测DNA序列的方法。
我们通常可以通过这种方
法确定目标基因的位置及其特征，进行基因的全长克隆，通过分子克
隆方法将目标区域构建到适当的系统上，进行基因敲除、表达等遗传
学研究。
其次，在实际操作中，基因敲除动物模型南方模式常常需要用到CRISPR-Cas9技术。
CRISPR-Cas9技术是一种新型基因编辑技术，可以
通过操纵细胞中的Cas9酶，实现基因的准确剪切和修改。
利用该技术，我们可以对特定的基因进行敲除或者改变其表达情况，实现对生物体
的基因组编辑。
自然而然地，基因敲除动物模型南方模式的优点也就显而易见。
首先，它可以帮助我们快速验证目标基因在不同生物体中的生理功能
和表达特征，深入了解基因表达的相关机制；同时，该模型也可以作
为疾病模型进行研究，有助于发现并预防疾病的发生；最后，通过在
模型动物中人为敲除目标基因，我们也可以获得更多有价值的基因信息，有助于推动基因治疗和细胞治疗等领域的研究进展。
总之，基因敲除动物模型南方模式是基因功能研究中的重要工具，通过该模型，我们可以深入了解基因表达的相关机制，发掘更多有价
值的基因信息，并为基因治疗和细胞治疗等领域的发展奠定基础。
动物中敲除某种细胞的方法
动物中敲除某种细胞的方法动物中敲除某种细胞是一种常见的研究方法，常用于生物医学研究、基因功能研究等领域。
它能够帮助科研人员深入了解特定细胞在生物体内的功能和影响，为人类健康和疾病治疗的相关研究提供重要的参考。
本文将介绍动物中敲除某种细胞的方法，包括CRISPR/Cas9技术、siRNA敲除、基因突变体筛选等等，希望对相关领域的科研人员有所帮助。
一、CRISPR/Cas9技术CRISPR/Cas9是一种革命性的基因编辑技术，可以用于敲除动物体内特定的基因。
通过设计合适的CRISPR引物和引导RNA，将Cas9蛋白靶向到目标基因上，发生双链断裂并引起基因敲除。
在实验动物中，通过注射CRISPR/Cas9蛋白或质粒构建的介导RNA来实现特定细胞的基因敲除，从而研究目标细胞的功能和影响。
二、siRNA敲除siRNA是一种特异性靶向特定基因的小分子RNA分子，可以在细胞内引起特定基因的沉默和敲除，从而研究目标细胞的功能和影响。
在动物实验中，可以通过注射siRNA分子或构建载体来实现特定细胞内基因的沉默和敲除，为相关研究提供重要的实验支持。
三、基因突变体筛选利用化学或物理诱发基因突变来筛选特定细胞的敲除变异体，是一种常见的方法。
通过暴露动物体内的细胞于化学诱变剂或放射线等物理因素，诱发基因突变，并筛选出特定细胞的敲除变异体，从而研究其功能和影响。
四、基因敲除动物模型基因敲除动物模型是一种通过基因敲除技术构建的动物模型，可用于研究特定细胞的功能和影响。
通过设计合适的基因敲除策略和动物繁殖技术，可以得到特定细胞敲除的动物模型，为相关研究提供可靠的实验数据。
动物中敲除某种细胞的方法包括CRISPR/Cas9技术、siRNA敲除、基因突变体筛选等多种技术手段。
这些方法在生物医学研究、基因功能研究等领域具有重要的应用价值，为相关研究提供了重要的技术支持和理论指导。
希望本文内容能够对相关领域的科研人员有所启发和帮助。
基因敲除技术的原理与应用
基因敲除技术的原理与应用
基因敲除技术是基因工程领域常用的一种技术手段，它通过干扰特定
目标基因的表达，来研究该基因在生物体中的功能、调控及其对生物现象
的影响。
基因敲除技术的原理与应用十分广泛，对于生物学研究、疾病治
疗和农业改良有着重要的意义。
1.生物学研究：基因敲除技术被广泛用于研究基因在生物体中的功能
以及其对生物现象的影响。
常用的模式生物如小鼠、果蝇、斑马鱼等，通
过基因敲除技术产生基因敲除动物模型，可以帮助科学家研究基因的功能、调控机制和疾病机理。
2.疾病治疗：基因敲除技术可以用于治疗一些与单基因遗传病相关的
疾病。
通过针对致病基因的敲除，可以恢复或改变细胞的功能，从而治疗
疾病。
举例来说，基因敲除技术已经成功用于治疗部分遗传性免疫缺陷病、囊性纤维化、血友病等疾病。
3.肿瘤治疗：在癌症治疗中，基因敲除技术可以用于针对癌细胞中的
致瘤基因进行敲除，从而抑制肿瘤的生长和扩散。
此外，还可以对肿瘤的
信号通路进行调控，达到治疗肿瘤的目的。
4.农业改良：基因敲除技术可以应用于农业领域，通过有针对性地敲
除一些基因来改良植物的性状，提高农作物抗病性、抗旱性和耐盐性。
以
水稻为例，基因敲除技术已经成功应用于提高水稻对稻瘟病、稻瘟病菌和
稻瘟霉素的抗性。
总之，基因敲除技术具有广泛的应用前景。
它可以对生命科学研究、
疾病治疗和农业改良等领域做出重要贡献。
随着技术的不断发展和优化，
基因敲除技术的应用将会更加广泛，为人类的健康和农业产业发展带来更多的福利。
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PCR定义PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚 合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物 为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤， 体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的 过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速 特异地在体外扩增任何目的DNA干细胞，最常 用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使 用。常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这 类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾 向，是基因敲除的理想实验动物。
同源重组
将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微 注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源 DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重 组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组 中，从而得以表达。一般地，显微注射命中率较 高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射 低，但便于使用。
1、基因载体的构建 2、选择重组 3、同源重组体的测定
4、将同源重组体注射到E3.5囊胚
5、转移到假母体上，诞生嵌合体 6、生殖系的传递
基因载体的构建
把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的 DNA 分子都重组到带有标记基因的载体上，成为 重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生 理功能，所以一般设计为替换型载体。
The end,thank you!
选择筛选已击中的细胞
由于基因转移的同源重组自然发生率极低， 动物的重组概率为10－2～10－5，植物的概率为 10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正 发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常 用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的 特异位点表达法以及PCR 法。其中应用最多的是 PNS法。
基因敲除动物模型
概述
基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种 新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体 特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基 因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的 同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的 目的。
利用基因同源重组进行基因敲除
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组 原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细 胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技 术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同 源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞 基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源 重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型 中最普遍的使用方法。
表型研究
通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进 而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的 改变，达到研究目的基因的目的。
得到纯合体
由于同源重组常常发生在一对染色体上中一 条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基 因敲除模型，需要进行至少两代遗传。
PNS法
同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外 部分将被切除。随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体 内。置换型载体含有正负选择基因各一，正选择基因多为neo基因， 位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基 因在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端，常用HSV-tk基因，在 同源重组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机整合时，所有的序 列均保留（包括tk）。胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒的丙氧鸟苷 （GANC）转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排 除随机整合的细胞株。故同源重组时，G418（是一种氨基糖苷类抗生 素 ,在分子遗传试验中,是稳定转染最常用的抗性筛选试剂）和 GANC 都有抗性，随机整合时对G418有抗性，但对GANC敏感，细胞将被杀死， 无整合的将被G418杀死。用G418作正筛选，选出含有neo基因的细胞 株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk基因的细胞株，保留未含有tk 基因的同源重组细胞株。此方法是目前应用较广泛的一种策略。正向 筛选标记基因 Neo具有双重作用，一方面导致靶基因的插入突变；同 时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因产物可使细胞在含有新霉素 的培养基中生长。