基因敲除动物模型

选择筛选已击中的细胞
由于基因转移的同源重组自然发生率极低， 动物的重组概率为10－2～10－5，植物的概率为 10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正 发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常 用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的 特异位点表达法以及PCR 法。其中应用最多的是 PNS法。
PCR定义PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚 合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物 为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤， 体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的 过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速 特异地在体外扩增任何目的DNA。
ES 细胞的获得
现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常 用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使 用。常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这 类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾 向，是基因敲除的理想实验动物。
同源重组
将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微 注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源 DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重 组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组 中，从而得以表达。一般地，显微注射命中率较 高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射 低，但便于使用。
基因敲除动物模型
概述
基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种 新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体 特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基 因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的 同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的 目的。
利用基因同源重组进行基因敲除
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组 原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细 胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技 术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同 源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞 基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源 重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型 中最普遍的使用方法。
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Fra Baidu bibliotek
1、基因载体的构建 2、选择重组 3、同源重组体的测定
4、将同源重组体注射到E3.5囊胚
5、转移到假母体上，诞生嵌合体 6、生殖系的传递
基因载体的构建
把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的 DNA 分子都重组到带有标记基因的载体上，成为 重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生 理功能，所以一般设计为替换型载体。
表型研究
通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进 而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的 改变，达到研究目的基因的目的。
得到纯合体
由于同源重组常常发生在一对染色体上中一 条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基 因敲除模型，需要进行至少两代遗传。
PNS法
同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外 部分将被切除。随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体 内。置换型载体含有正负选择基因各一，正选择基因多为neo基因， 位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。负选择基 因在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端，常用HSV-tk基因，在 同源重组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机整合时，所有的序 列均保留（包括tk）。胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒的丙氧鸟苷 （GANC）转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排 除随机整合的细胞株。故同源重组时，G418（是一种氨基糖苷类抗生 素 ,在分子遗传试验中,是稳定转染最常用的抗性筛选试剂）和 GANC 都有抗性，随机整合时对G418有抗性，但对GANC敏感，细胞将被杀死， 无整合的将被G418杀死。用G418作正筛选，选出含有neo基因的细胞 株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk基因的细胞株，保留未含有tk 基因的同源重组细胞株。此方法是目前应用较广泛的一种策略。正向 筛选标记基因 Neo具有双重作用，一方面导致靶基因的插入突变；同 时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因产物可使细胞在含有新霉素 的培养基中生长。