微生物菌种的选育和保藏--诱变育种

四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢诱变处理： ➢诱变剂的处理方式： ✔单因子处理：采用单一诱变剂处理出发菌株； ✔复合因子处理：两种以上诱变因子共同诱发菌体突变，包括①两种或多种 诱变剂先后使用；②同一种诱变剂的重复使用；③两种或多种诱变剂的同时使用。 ➢诱变剂的处理方法： ✔直接处理方法：将菌悬液用物理、化学因子处理，然后涂平板分离突变株； ✔生长过程处理法：适用于诱变作用强而杀菌率较低的诱变剂，或在分裂过 程中只对DNA起作用的诱变剂，如NTG、LiCl、 秋水仙碱等；方法：可将诱变剂 加入培养基后涂平板；或先把培养基制成平板，将一定浓度的诱变剂和菌体加入平 板； 或摇瓶振荡培养处理；
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 制备单孢子(或单细胞)悬液： ➢ 目的：获得单孢子(或单细胞)均匀的悬液；
➢ 原因: 分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落；
➢ 方法:✔菌龄:对数期细胞、刚成熟的孢子母菌细胞悬浮液的浓度为106个/mL、
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 突变株的分离与筛选： ➢ 筛选方案:
➢ 筛选方法： ✔初筛：a.随机筛选：也称摇瓶筛选；随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛选； b.平板菌落预筛：在培养皿上诱变后从试样检出突变体的一种
琼脂平板筛选法,有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等; ✔复筛:对突变株的生产性能作比较精确的定量测定工作，代表方法：琼脂
放线 菌或细菌的浓度为108个/ mL左右;
✔菌悬液配制方法:离心洗涤前培养物，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬 液，放在盛有玻璃珠的三角瓶内振荡10min,令其分散，用无菌脱脂棉或滤纸过滤。 通过菌体计数，调整菌悬液的浓度供诱变处理。
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 诱变处理： ➢ 诱变剂种类的选择：物理诱变剂和化学诱变剂 ✔物理诱变剂：紫外线、χ射线、γ射线、等离子、快中子、ɑ射线、β射线、 超声波等； ✔化学诱变剂: 碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等； ➢ 最适诱变剂量选择： ✔诱变剂剂量表示方式：a.UV的剂量指强度与作用时间的乘积； b.化学诱变剂剂量：诱变剂的浓度和作用 时间的乘 积来表示； c.在育种实践中，常以杀菌率来作诱变剂 的相对剂量； ✔最适诱变剂量确定：a.依据：最适剂量应该使所希望得到的突变株在存活 群体中占有最大的比例； b.方法：通过比较剂量--存活率曲线和剂量-
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 诱变处理： ➢以紫外线诱变处理为例： ✔紫外灯应先预热20~30min； ✔将10ml菌悬液放在直径为9cm的培养皿中，液层厚度约为2mm,启动磁力 搅拌器，使用15w功率紫外灯管，照射距离为30cm左右，照射时间几秒至数十分 钟为宜，具芽孢的菌株需处理10min左右； ✔实验中避免光复活现象:处理过程应在暗室的红光下操作，处理完毕后，将 盛菌悬液的器皿用黑布包起来培养，然后再进行分离筛选；
微生物学基础
微生物菌种的选育和保藏
项目一 微生物菌种的选育
四、诱变育种
１
诱变育种概述
➢ 诱变育种概念：✔利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率
大幅度提高，然后设法采用简便、快速、高效的筛选方法，从中
挑选少
数符合目的的突变株，以供生产科研之用；
✔诱变：随机的；筛选：定向的（更重要）；
➢ 诱变育种的基本环节：
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 对出发菌株的选择要求： ➢ 生长快，营养要求粗放，发育早，产孢子多，对诱变剂敏感性高，已能积累少量 产品或前体物的菌株； ➢ 选取自然界新分离的野生型菌株，它们对诱变因素敏感，容易发生变异; ➢ 选取生产中由于自发突变或长期在生产条件下驯化而筛选得到的菌株，与野生型 菌株较相象，容易达到较好的诱变效果; ➢ 选取每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变可能效果迭加，积累更多 的提高。
➢ 实例:定向培育抗异烟肼的吡多醇高产突变株（异烟肼浓度左边低右边高）；
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 突变株的分离与筛选：营养缺陷型突变株的筛选 ➢ 与营养缺陷型突变株筛选有关的三类培养基： ✔ 基本培养基(MM[—])：仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需要的最低 成分的组合培养基； ✔完全培养基(CM[+])：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组 合培养基； ✔补充培养基(SM[A]或[B])：凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的 组合或半组合培养基，称补充培养基。 ➢ 与营养缺陷型突变株有关的三类遗传型个体： ✔野生型[A+B+]：指从自然界分离到的任何微生物在其发生人为营养缺陷突变前 的原始菌株； ✔营养缺陷型[A-B+]、[A+B-]：野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧 失某酶 合成能力的突变，只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长； ✔原养型[A+B+]：营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的菌株，其营
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 出发菌株的纯化： ➢ 目的：获得遗传性状基本一致的，并且稳定的变种； ➢ 原因: 遗传背景复杂的菌种诱变后负变率将增加;诱变史长的菌株，采用强烈诱 变剂处理，又不进行纯化分离，诱变效果差； ➢ 纯种分离方法:常用划线分离法和稀释分离法； ➢ 同步培养： ➢ 目的：获得生理状态一致的培养物； ➢ 原因: 突变率高，重现性也好； ➢ 方法: ✔细菌一般要求培养至对数生长期; ✔霉菌使用分生孢子，将分生孢子在液体培养基中短时间培养，使孢子 孵化，处于活化状态，并恰好未形成菌丝体。
块培养法；
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 突变株的分离与筛选：常见三类突变株（产量、抗性、营养缺陷型突变株）的筛选 ➢ 产量突变株的筛选---琼脂块培养法：
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 突变株的分离与筛选：常见三类突变株（产量、抗性、营养缺陷型突变株）的筛选
➢ 抗性突变株的筛选---梯度平板法：定向筛选抗药性突变株的有效方法；通过制备 琼脂表面存在药物浓度梯度的平板、在其上涂布诱变处理后的细胞悬液、经培养 后再从其上选取抗药性菌落等步骤，就可定向筛选到相应抗药性突变株；
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢后培养：指诱变后的菌悬液不直接分离于平板，而是立即转移到营养丰富的培养 基中培 养数代； ➢方法：将诱变处理后的菌体转移到适宜的培养条件下，培养几小时，让突变细 胞繁殖几代； ➢目的：✔诱变处理后发生的突变，通过繁殖即DNA复制，才能形成稳定突变体； ✔根据突变体表型延迟现象，通过后培养，使表型都得到充分表达； ✔后培养的培养基:一般培养基中加入足量的酪素水解物、酵母膏等富含 特种氨基酸、生长因子和ATP的营养物质；