中药与制药微生物学实验
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二、实验内容
1.药物的微生物限度检查（二） 2.空气、皮肤细菌检查结果测定。 3.讲授基础培养基的制备方法（营养琼脂、营养肉汤）。 4.培养基的种类和用途
普通培养基、营养培养基、厌氧培养基、选择培养基 5.细菌在三种不同物理性状培养基上的接种方法(基本技能)
液体培养基
平板培养基 斜面培养基
双糖含铁半固体斜面培养基
②细菌总数的检查
2.外用药物的微生物检查: ①绿脓杆菌的检查：
②金黄色葡萄球菌的检查：
当前2页，共66页，星期日。
药品的微生物限度检查实验方法（一）
1.药品的预处理
口服药
外用药
2克药品加20毫升生理盐水， 研磨制成悬液
2.细菌培养
外服药
药品混悬液10毫升加入胆盐乳糖增菌液中 药品混悬液10毫升加入亚碲酸钠增菌液中
※方 法
1.平板划线接种法
（1）平行划线法
（2）分区划线法
2.琼脂斜面的接种方法
3.液体培养基接种法 4.半固体接种法
当前11页，共66页，星期日。
平行划线法
当前12页，共66页，星期日。
分区划线法
当前13页，共66页，星期日。
菌落
当前14页，共66页，星期日。
斜面移种技术
当前15页，共66页，星期日。
菌苔
当前16页，共66页，星期日。
液体移种技术
当前17页，共66页，星期日。
穿刺技术
当前18页，共66页，星期日。
药物的微生物限度检查方法（二）
取出前次实验培养物观察：
1.口服药物 1)细菌鉴定：
在胆盐乳糖增菌液中有无细菌生长： 增菌液变混浊―――――有
-----接种在伊红美兰琼脂平板培养基 上面。
菌膜 菌沉淀
对照
混浊生长
均匀浑浊
当前31页，共66页，星期日。
菌膜生长
当前32页，共66页，星期日。
当前33页，共66页，星期日。
当前34页，共66页，星期日。
当前35页，共66页，星期日。
肠道杆菌双糖铁培养基结果比较
当前36页，共66页，星期日。
※革兰染色步骤
• 1.制片：取标本（球杆混合物、牙垢） 涂片、干燥、固定
当前52页，共66页，星期日。
结核杆菌
当前53页，共66页，星期日。
抗生素体外抑菌试验（二）
记录纸片法结果 测量抑菌环直径
当前54页，共66页，星期日。
病毒的分离培养—鸡胚接种
病毒的培养方法：
• 动物接种 • 鸡胚培养 • 组织细胞培养
当前55页，共66页，星期日。
病毒的分离培养—鸡胚接种
当前56页，共66页，星期日。
方法：斜面化线接种；
（2）将亚碲酸钠增菌液培养物，无菌接种在卵黄高盐 琼脂平板培养基上面。
方法：分区划线接种。 37℃恒温孵育箱24小时培养后，观察结果。
当前20页，共66页，星期日。
细菌基本形态 球菌
螺形菌
杆菌
当前21页，共66页，星期日。
葡萄球菌
当前22页，共66页，星期日。
链球菌
当前23页，共66页，星期日。
2.结晶紫初染 1min——水洗
当前40页，共66页，星期日。
3. 碘液媒染
1min——水洗
当前41页，共66页，星期日。
4. 95% 酒精脱色
30s——水洗
当前42页，共66页，星期日。
5.沙黄复染 1min——水洗、滤纸吸干
当前43页，共66页，星期日。
当前44页，共66页，星期日。
6.油镜观察
G6玻璃滤菌器装置 洁净工作台
移动式 紫外光灯 鼓风式干烤箱
紫外线杀菌标本。
当前5页，共66页，星期日。
催化剂（钯粒）
厌氧工作站
厌氧培养罐
电热恒温培养箱
二氧化碳培养箱
当前6页，共66页，星期日。
实验二 药品的微生物限度检查（二）
细菌的形态学检查及培养接种技术
一、目的要求: 1、了解细菌培养接种技术 2、掌握细菌基本形态 3、掌握药品的微生物学检验程序和方法
6.显微镜下观察 细菌的基本形态: 球菌、枯草杆菌、霍乱弧菌。 特殊结构： 肺炎荚膜、变形鞭毛、破伤风芽胞。
当前7页，共66页，星期日。
※一、空气、皮肤的细菌检查结果
1、记录空气微生物培养结果（要记录本人所在实验台的结果）
• 菌落大小、边缘、颜色、粗糙（光滑）
2、记录皮肤微生物培养结果（要记录本人的实验结果）
比较消毒前后细菌菌落数，菌落特点。
当前8页，共66页，星期日。
※二、培养基的制备
培养基分类
根据物理性状分类： 液体培养基
半固体培养基
固体培养基
根据用途分类：
基础培养基
营养培养基
选择培养基
鉴别培养基
厌氧培养基
主要用于增菌 用于检测动力及保存菌种 用于分离鉴定细菌 普通琼脂培养基 血液琼脂培养基 SS培养基 双糖铁培养基 庖肉培养基
方法：分区划线接种。 2)细菌总数测定：
选择30-300个菌落平板，
细菌总数＝菌落数×稀释倍数
当前19页，共66页，星期日。
2.外用药
1)判定胆盐乳糖增菌液培养物及亚碲酸钠增菌液培养物有 无细菌生长：
增菌液变混浊―――有
2)细菌鉴定： （1）将胆盐乳糖增菌液培养物无菌接种在16烷三甲基溴
化胺琼脂斜面培养基上面。
当前9页，共66页，星期日。
※培养基的制备程序
※ 调配→矫正pH（7.0-7.6）→分装→ 灭菌（121.3℃，20-30 分钟）→放入冰箱冷藏备用。
• 因高压之后pH值会下降0.1左右，所以矫正pH时应比所 需的pH高。
• 鉴定是否有菌可将培养基置于37 ℃培养24小时，然后观 察。
当前10页，共66页，星期日。
实验五 药物的微生物限度检查（五）
一、目的要求
掌握药品的微生物学检验程序和方法 二、实验内容 以生化反应（IMViC）检测口服药中细菌的性质。
当前64页，共66页，星期日。
--------------------------------------------------
当前65页，共66页，星期日。
3.中草药、抗生素抑菌试验
1）中草药---大蒜汁、黄连、黄芩、黄柏。 2）抗生素---青霉素、庆大、氨苄、新诺明、生理盐水。
当前29页，共66页，星期日。
药物的微生物限度检查（三）
1）从伊红美兰琼脂平板培养基上----挑取黑色带有金属光泽的湿润菌落，接种在普通琼脂斜面培养
基上面，进行细菌的纯培养。 2）观察外用药物在16烷三甲基溴化胺琼脂斜面培养基上生长状况。
病毒的分离培养—鸡胚培养
当前57页，共66页，星期日。
菌丝
当前58页，共66页，星期日。
大分生孢子
小分生孢子
当前59页，共66页，星期日。
白念珠菌
当前60页，共66页，星期日。
新型隐球菌
当前61页，共66页，星期日。
青霉
当前62页，共66页，星期日。
曲霉
烟曲霉
黄曲霉
当前63页，共66页，星期日。
※２．抗酸染色 抗酸染色
原理:结核分枝杆菌含脂质多,不易着色,若加温或延长时间使
其着色后,再用3%盐酸酒精处理也不易脱色,称抗酸染色. 经 此染色后,结核分枝杆菌呈红色,其它呈蓝色.
步骤
当前51页，共66页，星期日。
抗酸染色步骤
i. 制片（涂片、干燥、固定）；
ii. 石炭酸复红初染（加热、 盖滤纸片） 5min ---水Байду номын сангаас； iii. 3％盐酸酒精脱色 （ 15S,水洗）； iv. 美兰复染（1min，水洗 ）-滤纸吸干 v. 镜检。
二、实验内容 1、药物的微生物限度检查（四） 1）将口服药物中的细菌分别接种：①蛋白胨水培养基； ②葡萄糖蛋白胨水培养基； ③枸橼酸盐（西蒙氏）培养基。 同时接种产气杆菌于上述培养管做对照，以备进行IMViC试验。 2）取接种在普通琼脂斜面培养基上面的外用药物中细菌进行血浆凝固酶检测,依 据 其反应结果,确定该菌的性质及名称。
吲哚试验
左：产气肠杆菌（—），右：大肠埃希菌（+）
当前66页，共66页，星期日。
实验一 药品的微生物限度检查（一）
实验室常用消毒灭菌设备
空气和皮肤细菌检查方法
目的要求: 1、了解微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备 2、了解空气、皮肤细菌检查方法 3、掌握药品的微生物学检验程序和方法
当前1页，共66页，星期日。
一.药品的微生物限度检查（一）
1.口服药物的微生物检查: ①大肠杆菌的检查：
记录被检菌色素的溶解性质、液化明胶的状况及菌苔粘稠度等。 革兰氏染色镜下观察其菌落形态。 根据上述被检菌落的生物性质和状况及细菌形态，确定该被检菌的 名称。
3）从卵黄高盐琼脂平板培养基上生长，挑取黄色的湿润菌落，接种 在普通琼脂斜面培养基上面，进行细菌的纯培养。
当前30页，共66页，星期日。
2.细菌的生长现象及代谢产物的观察
从上述三个稀释管中各取1ml
1ml 10-1
10-1
10-2
10-3
10-2
10-3
10-4 10-4
加溶化的琼脂培养基中，混匀，冷却后,置37℃恒温培养箱培养24小时 。
当前4页，共66页，星期日。
二.空气、皮肤细菌检查方法(验证)
三.微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备：
高压蒸汽灭菌锅 消毒煮沸器
结果
• 革兰阳性菌：紫色 • 革兰阴性菌：红色
当前45页，共66页，星期日。
3.中草药、抗生素抑菌试验
当前46页，共66页，星期日。
纸片法
当前47页，共66页，星期日。
实验四 药物的微生物限度检查（四）
病毒和细菌及其他病原微生物
一、目的要求 1、了解抗酸染色方法及各种病毒和细菌的菌落形态 2、掌握药品的微生物学检验程序和方法
大肠埃希菌
当前24页，共66页，星期日。
枯草杆菌
当前25页，共66页，星期日。
霍乱弧菌
当前26页，共66页，星期日。
细菌特殊结构
鞭毛
荚膜
芽孢
当前27页，共66页，星期日。
spore
破伤风梭菌
当前28页，共66页，星期日。
实验三 药品的微生物限度检查（三） 微生物的形态学检查及药物的敏感性试验
• 2.初染：结晶紫——1min——水洗 • 3.媒染：碘液——1min——水洗 • 4.脱色：95% 酒精——30s——水洗 • 5.复染：沙黄——1min—水洗、滤纸吸干 • 6.油镜观察：
当前37页，共66页，星期日。
当前38页，共66页，星期日。
1、制片
涂片、干燥、固定
当前39页，共66页，星期日。
一、目的要求: 1、了解细菌的生长现象及代谢产物的观察 2、掌握药品的微生物学检验程序和方法
二、实验内容 1.药物的微生物限度检查（三） 2.细菌的生长现象及代谢产物的观察 1）液体培养基---沉淀、浑浊、表面生长现象。 2）三葡、三链、大肠与副伤乙培养基的菌落特征、溶血环观察。
3）双糖含铁培养基--- 动力、气体、硫化氢、分解乳糖观察。 4）结核杆菌菌落的观察。
口用药
药品混悬液10毫升加入胆盐乳糖增菌液中
37℃,24小时 37℃,24小时
当前3页，共66页，星期日。
3.细菌总数测定
将剩余口服药以10-1 10-2 10-3 10-4 进行稀释(以生理盐 水稀释)
9ml生理盐水
取三个中试管
各管加9ml生理盐水
从剩余10ml悬液中取1ml
1ml
加入第一个稀释管中
2 、抗酸染色 3 、真菌培养物的观察------黑曲霉、木霉 、青霉菌菌落，白色念珠菌假菌丝，
酵母菌菌落的观察。 4 、记录中草药、抗生素抑菌试验结果 5 、观察鸡胚的结构
当前48页，共66页，星期日。
接种细菌的对应生化反应管
当前49页，共66页，星期日。
血浆凝固酶试验 玻片法
当前50页，共66页，星期日。
1.药物的微生物限度检查（二） 2.空气、皮肤细菌检查结果测定。 3.讲授基础培养基的制备方法（营养琼脂、营养肉汤）。 4.培养基的种类和用途
普通培养基、营养培养基、厌氧培养基、选择培养基 5.细菌在三种不同物理性状培养基上的接种方法(基本技能)
液体培养基
平板培养基 斜面培养基
双糖含铁半固体斜面培养基
②细菌总数的检查
2.外用药物的微生物检查: ①绿脓杆菌的检查：
②金黄色葡萄球菌的检查：
当前2页，共66页，星期日。
药品的微生物限度检查实验方法（一）
1.药品的预处理
口服药
外用药
2克药品加20毫升生理盐水， 研磨制成悬液
2.细菌培养
外服药
药品混悬液10毫升加入胆盐乳糖增菌液中 药品混悬液10毫升加入亚碲酸钠增菌液中
※方 法
1.平板划线接种法
（1）平行划线法
（2）分区划线法
2.琼脂斜面的接种方法
3.液体培养基接种法 4.半固体接种法
当前11页，共66页，星期日。
平行划线法
当前12页，共66页，星期日。
分区划线法
当前13页，共66页，星期日。
菌落
当前14页，共66页，星期日。
斜面移种技术
当前15页，共66页，星期日。
菌苔
当前16页，共66页，星期日。
液体移种技术
当前17页，共66页，星期日。
穿刺技术
当前18页，共66页，星期日。
药物的微生物限度检查方法（二）
取出前次实验培养物观察：
1.口服药物 1)细菌鉴定：
在胆盐乳糖增菌液中有无细菌生长： 增菌液变混浊―――――有
-----接种在伊红美兰琼脂平板培养基 上面。
菌膜 菌沉淀
对照
混浊生长
均匀浑浊
当前31页，共66页，星期日。
菌膜生长
当前32页，共66页，星期日。
当前33页，共66页，星期日。
当前34页，共66页，星期日。
当前35页，共66页，星期日。
肠道杆菌双糖铁培养基结果比较
当前36页，共66页，星期日。
※革兰染色步骤
• 1.制片：取标本（球杆混合物、牙垢） 涂片、干燥、固定
当前52页，共66页，星期日。
结核杆菌
当前53页，共66页，星期日。
抗生素体外抑菌试验（二）
记录纸片法结果 测量抑菌环直径
当前54页，共66页，星期日。
病毒的分离培养—鸡胚接种
病毒的培养方法：
• 动物接种 • 鸡胚培养 • 组织细胞培养
当前55页，共66页，星期日。
病毒的分离培养—鸡胚接种
当前56页，共66页，星期日。
方法：斜面化线接种；
（2）将亚碲酸钠增菌液培养物，无菌接种在卵黄高盐 琼脂平板培养基上面。
方法：分区划线接种。 37℃恒温孵育箱24小时培养后，观察结果。
当前20页，共66页，星期日。
细菌基本形态 球菌
螺形菌
杆菌
当前21页，共66页，星期日。
葡萄球菌
当前22页，共66页，星期日。
链球菌
当前23页，共66页，星期日。
2.结晶紫初染 1min——水洗
当前40页，共66页，星期日。
3. 碘液媒染
1min——水洗
当前41页，共66页，星期日。
4. 95% 酒精脱色
30s——水洗
当前42页，共66页，星期日。
5.沙黄复染 1min——水洗、滤纸吸干
当前43页，共66页，星期日。
当前44页，共66页，星期日。
6.油镜观察
G6玻璃滤菌器装置 洁净工作台
移动式 紫外光灯 鼓风式干烤箱
紫外线杀菌标本。
当前5页，共66页，星期日。
催化剂（钯粒）
厌氧工作站
厌氧培养罐
电热恒温培养箱
二氧化碳培养箱
当前6页，共66页，星期日。
实验二 药品的微生物限度检查（二）
细菌的形态学检查及培养接种技术
一、目的要求: 1、了解细菌培养接种技术 2、掌握细菌基本形态 3、掌握药品的微生物学检验程序和方法
6.显微镜下观察 细菌的基本形态: 球菌、枯草杆菌、霍乱弧菌。 特殊结构： 肺炎荚膜、变形鞭毛、破伤风芽胞。
当前7页，共66页，星期日。
※一、空气、皮肤的细菌检查结果
1、记录空气微生物培养结果（要记录本人所在实验台的结果）
• 菌落大小、边缘、颜色、粗糙（光滑）
2、记录皮肤微生物培养结果（要记录本人的实验结果）
比较消毒前后细菌菌落数，菌落特点。
当前8页，共66页，星期日。
※二、培养基的制备
培养基分类
根据物理性状分类： 液体培养基
半固体培养基
固体培养基
根据用途分类：
基础培养基
营养培养基
选择培养基
鉴别培养基
厌氧培养基
主要用于增菌 用于检测动力及保存菌种 用于分离鉴定细菌 普通琼脂培养基 血液琼脂培养基 SS培养基 双糖铁培养基 庖肉培养基
方法：分区划线接种。 2)细菌总数测定：
选择30-300个菌落平板，
细菌总数＝菌落数×稀释倍数
当前19页，共66页，星期日。
2.外用药
1)判定胆盐乳糖增菌液培养物及亚碲酸钠增菌液培养物有 无细菌生长：
增菌液变混浊―――有
2)细菌鉴定： （1）将胆盐乳糖增菌液培养物无菌接种在16烷三甲基溴
化胺琼脂斜面培养基上面。
当前9页，共66页，星期日。
※培养基的制备程序
※ 调配→矫正pH（7.0-7.6）→分装→ 灭菌（121.3℃，20-30 分钟）→放入冰箱冷藏备用。
• 因高压之后pH值会下降0.1左右，所以矫正pH时应比所 需的pH高。
• 鉴定是否有菌可将培养基置于37 ℃培养24小时，然后观 察。
当前10页，共66页，星期日。
实验五 药物的微生物限度检查（五）
一、目的要求
掌握药品的微生物学检验程序和方法 二、实验内容 以生化反应（IMViC）检测口服药中细菌的性质。
当前64页，共66页，星期日。
--------------------------------------------------
当前65页，共66页，星期日。
3.中草药、抗生素抑菌试验
1）中草药---大蒜汁、黄连、黄芩、黄柏。 2）抗生素---青霉素、庆大、氨苄、新诺明、生理盐水。
当前29页，共66页，星期日。
药物的微生物限度检查（三）
1）从伊红美兰琼脂平板培养基上----挑取黑色带有金属光泽的湿润菌落，接种在普通琼脂斜面培养
基上面，进行细菌的纯培养。 2）观察外用药物在16烷三甲基溴化胺琼脂斜面培养基上生长状况。
病毒的分离培养—鸡胚培养
当前57页，共66页，星期日。
菌丝
当前58页，共66页，星期日。
大分生孢子
小分生孢子
当前59页，共66页，星期日。
白念珠菌
当前60页，共66页，星期日。
新型隐球菌
当前61页，共66页，星期日。
青霉
当前62页，共66页，星期日。
曲霉
烟曲霉
黄曲霉
当前63页，共66页，星期日。
※２．抗酸染色 抗酸染色
原理:结核分枝杆菌含脂质多,不易着色,若加温或延长时间使
其着色后,再用3%盐酸酒精处理也不易脱色,称抗酸染色. 经 此染色后,结核分枝杆菌呈红色,其它呈蓝色.
步骤
当前51页，共66页，星期日。
抗酸染色步骤
i. 制片（涂片、干燥、固定）；
ii. 石炭酸复红初染（加热、 盖滤纸片） 5min ---水Байду номын сангаас； iii. 3％盐酸酒精脱色 （ 15S,水洗）； iv. 美兰复染（1min，水洗 ）-滤纸吸干 v. 镜检。
二、实验内容 1、药物的微生物限度检查（四） 1）将口服药物中的细菌分别接种：①蛋白胨水培养基； ②葡萄糖蛋白胨水培养基； ③枸橼酸盐（西蒙氏）培养基。 同时接种产气杆菌于上述培养管做对照，以备进行IMViC试验。 2）取接种在普通琼脂斜面培养基上面的外用药物中细菌进行血浆凝固酶检测,依 据 其反应结果,确定该菌的性质及名称。
吲哚试验
左：产气肠杆菌（—），右：大肠埃希菌（+）
当前66页，共66页，星期日。
实验一 药品的微生物限度检查（一）
实验室常用消毒灭菌设备
空气和皮肤细菌检查方法
目的要求: 1、了解微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备 2、了解空气、皮肤细菌检查方法 3、掌握药品的微生物学检验程序和方法
当前1页，共66页，星期日。
一.药品的微生物限度检查（一）
1.口服药物的微生物检查: ①大肠杆菌的检查：
记录被检菌色素的溶解性质、液化明胶的状况及菌苔粘稠度等。 革兰氏染色镜下观察其菌落形态。 根据上述被检菌落的生物性质和状况及细菌形态，确定该被检菌的 名称。
3）从卵黄高盐琼脂平板培养基上生长，挑取黄色的湿润菌落，接种 在普通琼脂斜面培养基上面，进行细菌的纯培养。
当前30页，共66页，星期日。
2.细菌的生长现象及代谢产物的观察
从上述三个稀释管中各取1ml
1ml 10-1
10-1
10-2
10-3
10-2
10-3
10-4 10-4
加溶化的琼脂培养基中，混匀，冷却后,置37℃恒温培养箱培养24小时 。
当前4页，共66页，星期日。
二.空气、皮肤细菌检查方法(验证)
三.微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备：
高压蒸汽灭菌锅 消毒煮沸器
结果
• 革兰阳性菌：紫色 • 革兰阴性菌：红色
当前45页，共66页，星期日。
3.中草药、抗生素抑菌试验
当前46页，共66页，星期日。
纸片法
当前47页，共66页，星期日。
实验四 药物的微生物限度检查（四）
病毒和细菌及其他病原微生物
一、目的要求 1、了解抗酸染色方法及各种病毒和细菌的菌落形态 2、掌握药品的微生物学检验程序和方法
大肠埃希菌
当前24页，共66页，星期日。
枯草杆菌
当前25页，共66页，星期日。
霍乱弧菌
当前26页，共66页，星期日。
细菌特殊结构
鞭毛
荚膜
芽孢
当前27页，共66页，星期日。
spore
破伤风梭菌
当前28页，共66页，星期日。
实验三 药品的微生物限度检查（三） 微生物的形态学检查及药物的敏感性试验
• 2.初染：结晶紫——1min——水洗 • 3.媒染：碘液——1min——水洗 • 4.脱色：95% 酒精——30s——水洗 • 5.复染：沙黄——1min—水洗、滤纸吸干 • 6.油镜观察：
当前37页，共66页，星期日。
当前38页，共66页，星期日。
1、制片
涂片、干燥、固定
当前39页，共66页，星期日。
一、目的要求: 1、了解细菌的生长现象及代谢产物的观察 2、掌握药品的微生物学检验程序和方法
二、实验内容 1.药物的微生物限度检查（三） 2.细菌的生长现象及代谢产物的观察 1）液体培养基---沉淀、浑浊、表面生长现象。 2）三葡、三链、大肠与副伤乙培养基的菌落特征、溶血环观察。
3）双糖含铁培养基--- 动力、气体、硫化氢、分解乳糖观察。 4）结核杆菌菌落的观察。
口用药
药品混悬液10毫升加入胆盐乳糖增菌液中
37℃,24小时 37℃,24小时
当前3页，共66页，星期日。
3.细菌总数测定
将剩余口服药以10-1 10-2 10-3 10-4 进行稀释(以生理盐 水稀释)
9ml生理盐水
取三个中试管
各管加9ml生理盐水
从剩余10ml悬液中取1ml
1ml
加入第一个稀释管中
2 、抗酸染色 3 、真菌培养物的观察------黑曲霉、木霉 、青霉菌菌落，白色念珠菌假菌丝，
酵母菌菌落的观察。 4 、记录中草药、抗生素抑菌试验结果 5 、观察鸡胚的结构
当前48页，共66页，星期日。
接种细菌的对应生化反应管
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血浆凝固酶试验 玻片法
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