黄芪和三七有效成分对脑缺血再灌注后细胞凋亡的影响

黄芪和三七有效成分对脑缺血再灌注后细胞凋亡的影响
欧阳翌国;丁煌;邓常清;唐映红;黄小平
【摘要】目的：从细胞凋亡角度探讨黄芪和三七有效成分配伍抗脑缺血再灌注损伤的作用机制。

方法将C57 BL／6小鼠随机分为：假手术组、模型组、黄芪甲苷（ASTⅣ）组、人参皂苷Rg1（ Rg1）组、人参皂苷Rb1（ Rb1）组、三七皂苷R1（ R1）组、四种有效成分配伍组、ASTⅣ＋Rg1组、AST Ⅳ＋Rb1组、AST Ⅳ＋R1组、阳性对照药依达拉奉组，给药3 d后，夹闭双侧颈总动脉造成脑缺血再灌注模型，再灌注24 h后， TUNEL法检测神经细胞凋亡，计算凋亡率，western-blot法测定脑组织caspase-3蛋白表达。

结果缺血再灌注后神经细胞凋亡率升高，caspase-3表达上调，各给药组均能降低神经细胞的凋亡率和caspase-3的表达。

ASTⅣ＋Rg1与AST Ⅳ＋R1降低凋亡率和caspase-3表达的效应分别大于各药物单用。

四种有效成分配伍组降低凋亡率的效应大于四种有效成分单用及AST Ⅳ＋Rb1，抑制caspase-3蛋白表达的效应大于各有效成分单用及AST Ⅳ＋Rb1、ASTⅣ＋R1。

结论黄芪甲苷与三七的主要有效成分配伍能增强对脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的抑制作用，ASTⅣ＋Rg1、ASTⅣ＋R1以及四种有效成分配伍对细胞凋亡的抑制作用增强。

%Objective To explore the mechanism of combination of Astragaloside IV and Panax notoginseng active in -gredient against cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods C57BL/6 mice were randomly divided into:sham, model,Astragaloside
Ⅳ(AST Ⅳ),Ginsenoside Rg1 (Rg1),Ginsenoside Rb1 (Rb1),Notoginsenoside R1 (R1), four active components
combination ,ASTⅣ+Rg1,ASTⅣ+Rb1,ASTⅣ+R1 and Edaravone ,pretreated for 3 d. After 1 h of the last administration ,the model of cerebral ischemic-
reperfusion injury was established by bilateral com-mon carotid artery (CCA) ligation followed by reperfusion ,then TUNEL method was used to detect apoptosis and ap-optosis rate was calculated ,expressions of caspase-3 proteins in brain tissues were tested by western-blot at 24 h after reperfusion .Results After cerebral ischemia-reperfusion , the apoptosis rate of nerve cell and the expression of caspase-3 protein in brain tissues were increased .All drugs could decrease the apoptosis
rate ,inhibit caspase-3 pro-tein expression .Furthermore , the decreased effects of AST Ⅳ+Rg1 and AST Ⅳ+R1 on the apoptosis rate and caspase-3 protein expression were better than those of the active components alone;In four active components combina-tion,the decrease of the apoptosis rate was stronger than that of four active components alone and AST Ⅳ+Rb1,the inhibition of caspase-3 was greater than that of four active components alone and AST Ⅳ+Rb1,ASTⅣ+R1.Con-clusion AST
Ⅳcombined with the effective components of Panax notoginseng had the potentiation on the inhibition of apoptosis .The inhibitory effect of AST
Ⅳ+Rg1 ,AST Ⅳ+R1 and four kinds of active ingredient combination on cell apoptosis are enhanced .
【期刊名称】《吉林医药学院学报》
【年(卷),期】2015(000)006
【总页数】4页(P437-440)
【关键词】黄芪甲苷;三七的有效成分;脑缺血再灌注;细胞凋亡
【作者】欧阳翌国;丁煌;邓常清;唐映红;黄小平
【作者单位】湖南中医药高等专科学校，湖南株洲 412012;湖南中医药大学，湖南长沙 410208;湖南中医药大学，湖南长沙 410208;湖南中医药大学，湖南长沙410208;湖南中医药大学，湖南长沙 410208
【正文语种】中文
【中图分类】R285.5
Effects of Astragaloside IV combined with active components of Panax not oginseng on apoptosis in brain tissues after cerebral ischemia-reperfusion in mice
OUYANG Yiguo
1,DING Huang
2,DENG Changqing
2,TANG Yinghong
2,HUANG Xiaoping
2*
(1.Hunan Traditional Chinese Medical College,Zhuzhou,Hunan Province,41 2012;2.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan Province,41 0208,China)
通讯作者：黄小平(1976-)，女(汉族)，副教师，硕士.
Key words：
stragaloside IV;active components of Panax notoginseng;cerebral ischemia -reperfusion;apoptosis
脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia-reperfusion injury，CIR)是指缺血脑组织在恢复血液灌注后，脑组织损伤进一步加重的现象
[1]。

脑缺血后神经细胞的损伤形式可分为急性损伤和迟发性损伤，而细胞凋亡是导致迟发性损伤的主要病理机制。

细胞凋亡是细胞在相关基因的控制下进行的自主的程序化的死亡过程。

在凋亡过程中，半
氨
天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease，caspase)，起到重要的调控作用
[2]。

caspase-3是caspase家族中重要成员之一，是细胞凋亡过程中最主要的终末效应部分，是细胞凋亡的必经之路
[3-4]，故caspase-3表达上调可作为细胞凋亡的标志。

依达拉奉是一种脑保护剂，其主要作用是清除自由基，抑制脂质过氧化，保护脑、血管内皮和神经细胞避免氧化损伤，临床上主要用于治疗脑梗死，具有确切的临床疗效。

近年来有研究表明
[5]，依达拉奉可明显减少急性脑缺血再灌注大鼠脑神经细胞凋亡数，故选择其作为本研究的阳性对照药。

中医认为气虚血
是缺血性中风的主要病理机制，故可用益气活血法进行治疗。

黄芪是常用的益气药，三七是常用的活血药，二者配伍，符合益气活血的治疗原则
[6]。

中药药化研究发现，黄芪中具有抗脑缺血作用的主要有效成分为黄芪
甲苷(以下简称AST Ⅳ)；三七中具有抗脑缺血作用的主要有效成分包括人参皂苷Rb1(以下简称Rb1)、人参皂苷Rg1(以下简称Rg1)和三七皂苷R1(以下简称R1) [7-8]。

本研究从脑缺血再灌注后神经细胞凋亡方面探讨黄芪和三七有效成分配伍抗脑缺血的作用机制，探索黄芪和三七有效成分配伍的组方规律，寻找其抗脑缺血的有效配伍组合，为黄芪和三七的进一步合理开发应用提供科学的实验依据。

三七皂苷R1对照品(批号：12051001，规格：20 mg/支)、黄芪甲苷对照品(批号：12061101，规格：20 mg/支)、人参皂苷Rb1对照品(批号：12051001，规格：20 mg/支)、人参皂苷Rg1对照品(批号：12052401，规格：20 mg/支)，以上
药品均由成都曼思特生物科技有限公司提供。

依达拉奉(批号：80-090711，规格：10 mg/支)，由南京先声东元制药有限公司提供，给药时用0.9%氯化钠稀释，配
成0.4 mg/mL溶液。

蛋白质抽提试剂盒(产品货号：KeyGEN，由南京凯基生物科技发展有限公司提供)、BCA蛋白质定量试剂盒(产品货号：AR0146，由武汉博士德生物工程有限公司提
供提供)、细胞凋亡检测试剂盒Ⅲ(FITC)(产品货号：MK1023，由武汉博士德生物
工程有限公司提供)、磷酸酶抑制剂复合物Ⅲ(产品货号：C500019-0001,由上海生工生物工程股份有限公司提供)；兔抗小鼠Caspase-3抗体(批号：SC7148，购自Santa Gruz Biotechnology)，兔抗小鼠β-actin抗体(批号：sc-130656，购自Santa Gruz Biotechnology)，均4℃保存；HRP-Goat Anti-Rabbit Ig(H+L)(批号：SA00001-2，购自Proteintech Group)，-20 ℃保存。

88只SPF级C57BL/6小鼠，雄性，体重20～25g。

饲养于SPF级动物实验室，相对湿度40%～60%、温度20～26 ℃。

根据前期实验结果
[9]，随机分为以下11组：1.假手术组，2.模型组，3.黄芪甲苷组，4.Rg1组，5.Rb1组，6.R1组，7.四种有效成分配伍组，8.黄芪甲苷+Rg1组，9.黄芪甲
苷+Rb1组，10.黄芪甲苷+R1组，11.阳性对照药依达拉奉组。

各组给药剂量:1、2组0.5%
甲基纤维素钠10 mL/kg;3组AST Ⅳ40 mg/kg;4组Rg1 50 mg/kg;5组Rb1 40 mg/kg;6组R1 10 mg/kg;7组AST Ⅳ和Rb1各
40 mg/kg,Rg1 50 mg/kg,R1 10 mg/kg;8组AST 40 mg/kg,Rg1 50 mg/kg;9
组AST Ⅳ和Rb1各40 mg/kg;10组AST 40 mg/kg,R1 10 mg/kg;11组依达拉
奉4 mg/kg。

第1-10组均灌胃给药，1次/d；第11组腹腔注射给药，2次/d。

连续给药3 d，末次给药1 h后进行造模。

乙醚麻醉小鼠，仰卧位固定，颈部手术，用动脉夹夹闭颈总动脉20 min，造成脑缺血。

假手术组也进行颈部手术，但不夹闭双侧颈总动脉。

再灌注24 h后，将小鼠迅速断头，取出脑组织做相应指标检测
[10]。

取视交叉后脑组织，固定、脱水、石蜡包埋，作冠状切片，厚度约为7 μm，TUNEL法测定神经细胞凋亡，计算凋亡率(%)。

取视交叉前脑组织，裂解、离心。

采用BCA法进行蛋白质定量，并计算含110μg 蛋白的裂解液容积作为上样量。

western-blot法检测caspase-3蛋白和内参照蛋白β-actin的表达。

用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测定caspase-3和内参蛋白(β-actin)的累积光密度值(IOD)，并以两者IOD的比值作为caspase-3的相
对表达量
[11]。

实验数据采运用SPSS16.0统计软件进行统计分析。

各组均数采用单因素方差分析，
方差齐者用最小显著性差异法检验。

P<0.05为有统计学意义。

各组神经元凋亡率的比较见图1。

与假手术组比较，模型组凋亡率显著升高(
P<0.01)。

与模型组比较，各给药组凋亡率显著降低(均
P<0.01)。

AST Ⅳ+Rg1组与AST Ⅳ+R1组降低凋亡率的效应分别大于各有效成分单用组(均
P<0.01)。

四种有效成分配伍组降低凋亡率的效应大于四种有效成分单用组及AST Ⅳ+Rb1组(均
P<0.01)，与阳性对照药依达拉奉组、AST Ⅳ+R1组、AST Ⅳ+Rg1组比较，差异无统计学意义(均
P>0.05)。

各组脑组织caspase-3蛋白表达的比较见图2。

与假手术组比较：
◇
P<0.05,
◇◇
P<0.01;与模型组比较：
△P<0.05,
△△
P<0.01;与AST Ⅳ组比较：
*
P<0.05,
**
P<0.01;与Rg1组比较：
□
P<0.05,
□□
P<0.01;与Rb1组比较：
■
P<0.05,
■■
P<0.01;与R1组比较：
☆
P<0.05,
☆☆
P<0.01;与四种有效成分配伍组比较：▲
P<0.05,
▲▲
P<0.01
与假手术组比较，模型组caspase-3表达显著升高(
P<0.01)。

与模型组比较，各给药组caspase-3表达显著下降(均
P<0.01)。

AST Ⅳ+Rg1组与AST Ⅳ+R1组降低caspase-3表达的效应分别大于各有效成分单用组(
P<0.01或
P<0.05)。

四种有效成分配伍组降低caspase-3表达的效应大于各有效成
分单用组、AST Ⅳ+R1组及AST Ⅳ+Rb1组(
P<0.01或
P<0.05)，与阳性对照药依达拉奉组、AST Ⅳ+Rg1组比较，差异无统计学意义(均
P>0.05)。

本研究结果显示，对小鼠进行脑缺血再灌注处理后，其脑组织发生细胞凋亡，caspase-3蛋白表达增加。

黄芪与三七的各种有效成分单用及配伍均可减轻缺血再灌注后神经细胞的凋亡，降低凋亡率，减少caspase-3蛋白的表达。

AST Ⅳ+Rg1与AST Ⅳ+R1降低凋亡率和减少caspase-3蛋白表达的效应分别大于各药物单用，表明黄芪甲苷与人参皂苷Rg1或三七皂苷R1配伍对神经细胞凋亡的抑制作用增强，可能具有协同增效作用。

四种有效成分配伍降低凋亡率的效应大于四种有效成分单用及AST Ⅳ+Rb1，减少caspase-3蛋白表达的效应大于四种有效成分单用及AST Ⅳ+Rb1和AST Ⅳ+R1，表明四种有效成分配伍能增强抗细胞凋亡的效应。

以上分析结果提示黄芪甲苷与三七的有效成分可以抑制脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的发生，黄芪甲苷与人参皂苷Rg1配伍、黄芪甲苷与三七皂R1配伍以及四种有效成分配伍对细胞凋亡的抑制作用增强。

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