液相色谱-串联质谱法测定化妆品中15种性激素

液相色谱-串联质谱法测定化妆品中15种性激素
周智明;罗卓雅
【摘要】LC MS/MS was applied to the determination of 15 sex hormones
in cosmetics (cream,emulsion or water preparation).The sample (0.20 g) was dispersed in 2 mL of saturated NaC1 solution and extracted twice with acetonitrile (2 mL each).0.2 mL of each of the solution of 200 g · L-1 K4
Fe(CN)6 and 200 g · L-1 (CH3COO)2Zn were added to the combined extract to precipitate the large molecular matrix.After centrifugation,the supernatant was taken and its volume was made up to 10 mL.Different programs were used in the gradient elution of estrogen hormones,male hormones and progestin hormones respectively,and in MS/MS analysis,the mode of ESI was applied to estrogen hormones and ESI+ was applied to male hormones and progestin hormones.Linear relationships between values of peak area and mass concentration of the 15 sex hormones were kept in the same range of 8.0-800μg · L-1,with detection limits (3S/N) in
the range of 0.05-0.4 mg · kg-1.Substantial samples of different batches were analyzed by this method,giving values of RSD's (n=6) in the range of 0.90％ to 4.3％,and of recovery ranged from 80.3％ to 121％.%采用液相色谱-串联质谱法(LG-MS/MS)测定了化妆品(膏霜、乳液或水剂)中15种性激素的含量.样品(0.20 g)与饱和氯化钠溶液(2mL)混匀分散,用乙腈(每次2 mL)提取2次.合并
提取液,加入200 g· L-1亚铁氰化钾溶液和200 g·L-1乙酸锌溶液各0.2 mL,混匀
使大分子物质沉淀,离心后取上清液,加水定容至10 mL.按不同的程序分别对雌激素、雄激素和孕激素进行梯度洗脱.质谱测定中对雌激素采用负离子模式,雄激素和孕激
素采用正离子模式.15种性激素的质量浓度均在8.0～800 μg·L-1内与其对应的峰面积呈线性关系,方法的检出限(3S/N)为0.05～0.4 mg·kg-1.经多批实样分析,所得测定值的相对标准偏差(n=6)为0.90％～4.3％,加标回收率为80.3％～～121％.【期刊名称】《理化检验-化学分册》
【年(卷),期】2018(054)002
【总页数】6页(P161-166)
【关键词】液相色谱-串联质谱法;化妆品;性激素
【作者】周智明;罗卓雅
【作者单位】广东省药品检验所,广州510180;广东省药品检验所,广州510180【正文语种】中文
【中图分类】O657.63
由于性激素能调节机体代谢，具有促进毛发生长、增加皮肤弹性、促进乳腺发育等作用，其易被非法添加在化妆品中。

滥用激素容易引发色素沉积、发育异常、内分泌失调等副作用，甚至会诱发癌症。

我国及欧盟化妆品规程中均明确规定，雌激素、雄激素、孕激素等性激素为化妆品禁用物质［1］。

目前，针对化妆品中激素检测的研究集中在糖皮质激素方面［2-3］，国内外文献报道的性激素的测定方法主要有液相色谱法［4-5］、薄层色谱法［6］、气相色
谱-质谱法［7］、酶联免疫分析法［8-9］、荧光法［10］和液相色谱-质谱法［11-14］等。

液相色谱-质谱法解决了其他方法选择性不高、灵敏度低、需衍生
化前处理等缺陷，受到了广泛的应用。

《化妆品安全技术规范》中采用高效液相色
谱法检测化妆品中7种性激素，因涉及激素种类少，存在不法商家非法添加法定
检验物质外的性激素以规避执法的情况。

因此，亟待建立多组分性激素的快速、可靠的检验方法。

本工作采用液相色谱-串联质谱法测定化妆品中15种性激素。

1 试验部分
1.1 仪器与试剂
岛津LC-MS 8040型液相色谱-三重四极杆质谱联用仪；Reeko Foterctor-60型
高通量全自动固相萃取仪；Eppendorf 5801R型高速离心机；Ika LabDancer型涡旋混合器；Millipore Milli Q Reference型超纯水发生器。

15种性激素混合标准储备溶液：1.0 g·L-1，称取雌三醇、雌二醇、炔雌醇、己烯雌酚、己二烯雌酚、睾酮、甲睾酮、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮、雌酮、黄体酮、己酸羟孕酮、17α-羟基黄体酮、左炔诺孕酮、炔诺酮等15种性激素标准品（纯度均大于98%）0.010 g于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，于-18℃下冷冻
保存。

15种性激素混合标准溶液：20 mg·L-1，分别移取1.0 g·L-1 15种性激素混合标
准储备溶液各1.0 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，于-18℃下冷冻保存。

使用时用乙腈（6+4）溶液稀释成所需质量浓度。

甲醇、乙腈为色谱纯；亚铁氰化钾、乙酸锌、氯化钠为分析纯；试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件
1）色谱条件 CAPCELL CORE C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7μm），柱温为30℃；进样量为5μL；流量为0.3 mL·min-1。

电喷雾正离子模式（ESI+）时，流动相为0.2%（体积分数，下同）甲酸溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脱程序：0～5.0 min时，A为60%；5.0～14.0 min时，A由60%降至20%；14.0～14.5 min时，A由20%升至60%，保持5.5 min。

电喷雾负离子模式（ESI-）时，流
动相为0.2%（质量分数，下同）氨水（A）和乙腈（B），梯度洗脱程序：0～2.0
min时，A为75%；2.0～2.5 min时，A由75%降至55%，保持4.5 min；7.0～7.5 min时，A由55%降至30%，保持2.0 min；9.5～10.0 min时，A由30%升至75%，保持5.0 min。

2）质谱条件电喷雾离子源（ESI），雌激素采用负离子模式，雄激素和孕激素采用正离子模式；毛细管温度为300℃，加热板温度为500℃；雾化气流量为3 L·min-1，干燥气流量为15 L·min-1；碰撞气压力为230 kPa；扫描方式为多反应监测（MRM）模式。

其余质谱条件见表1，表1中“*”为定量离子。

表1 质谱条件Tab.1 MS parameters峰号化合物电离模式质荷比m／z母离子子离子碰撞电压／V 1 43 2雌二醇ESI-271.4 183.2*，145.1 42，47雌三醇ESI-287.3 171.2*，145.1 34，炔雌醇ESI-295.5 145.1*，158.9 42，35 4雌酮ESI-269.5 145.1*，143.2 39，55 5己烯雌酚ESI-267.3 251.2*，237.1 25，31 6己二烯雌酚ESI-265.3 93.1*，249.3 27，28 7睾酮ESI+289.1 96.9*，108.9 22，26 8炔诺酮ESI+299.1 231.1*，109.1 17，25 9甲睾酮ESI+303.2 96.8*，108.7 23，27 10 17α-羟基黄体酮ESI+373.2 332.3*，109.1 7，37 11左炔诺孕酮ESI+313.2 245.2*，109.1 18，30 12黄体酮ESI+315.2 97.15*，109.1 22，24 13醋酸甲地孕酮ESI+385.2 325.2*，267.2 13，20 14醋酸甲羟孕酮
ESI+387.2 327.3*，123.2 12，29 15己酸羟孕酮ESI+429.3 313.3*，97.1 13，3 45
1.3 试验方法
称取样品0.20 g于10 mL具塞塑料离心管中，加入饱和氯化钠溶液2 mL，在涡旋混合器上混合使样品分散，加入乙腈2 mL，涡旋提取2 min，以转速4 000 r·min-1离心5 min。

移取上层（乙腈层）于10 mL具塞塑料离心管中，下层氯化钠溶液用乙腈2 mL重复提取一次，合并两次提取液，加入200 g·L-1亚铁氰化钾溶液0.2 mL、200 g·L-1乙酸锌溶液0.2 mL，涡旋混匀，以转速4 000 r·min-
1离心5 min。

上清液转移至10 mL玻璃试管中，用水稀释至刻度，混匀后，过0.22μm滤膜，按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论
2.1 色谱行为
15种性激素的提取离子色谱图见图1。

2.2 色谱条件的选择
流动相的组成影响化合物的峰形和离子化效率，试验发现：以乙腈为流动相时，各激素的信号响应优于甲醇为流动相。

试验选用乙腈和水作为流动相。

在正离子模式下，水相中加入甲酸有利于目标物的离子化；在负离子模式下，水相中加入氨水可以改善峰形、提高灵敏度。

试验结果表明：流动相中加入0.2%甲酸溶液和0.2%氨水能达到最佳的灵敏度。

试验选择的流动相见1.2节。

图1 15种性激素的提取离子色谱图Fig.1 Extracted ion chromatograms of the 15 sex hormones各峰号对应的化合物同表1
采用CAPCELL CORE C18色谱柱对15种性激素进行分离，等度洗脱时分离效果较差，试验选用梯度洗脱对6种雌激素、9种雄激素和孕激素进行分离。

试验选择的梯度洗脱程序见1.2节。

2.3 质谱条件的选择
采用直接进样方式将混合标准溶液注入离子源，对15种性激素的MRM条件进行优化。

在正离子和负离子模式下进行全扫描，试验结果表明，雌激素在负离子模式下，可获得较高丰度的［M-H］-母离子，雄激素和孕激素在正离子模式下，可获得较高丰度的［M+H］+母离子。

根据母离子和响应最高的两组碎片离子进行定性，并对碰撞电压进行优化。

试验选择的质谱条件见1.2节。

2.4 样品前处理条件的选择
性激素属脂溶性、弱极性化合物，样品类型包括膏霜类、乳液和水剂等3类。

为了减少操作步骤并获得尽可能高的提取效率，试验采用饱和氯化钠溶液分散、有机溶剂萃取的方法对样品中性激素进行提取。

试验考察了提取溶剂为甲醇、乙腈、无水乙醇，提取时间为0.5，1，2，3 min，以及提取次数为1次、2次、3次时的提取效果。

结果表明：以乙腈为提取溶剂、涡旋提取2 min、重复提取2次，能达到满意的提取效率。

试验进一步考察了大分子基质沉淀剂亚铁氰化钾和乙酸锌的用量对测定的影响。

结果表明：200 g·L-1亚铁氰化钾溶液0.2 mL、200 g·L-1乙酸锌溶液0.2 mL能较完全地沉淀大分子物质，有效避免了基质对质谱检测的干扰。

试验选择的样品前处理条件见1.3节。

2.5 标准曲线及检出限
按仪器工作条件对15种性激素混合标准溶液系列进行测定，并以15种性激素的峰面积对其质量浓度进行线性回归。

结果表明：15种性激素的质量浓度均在
8.0～800μg·L-1内呈线性，线性回归方程、相关系数见表2。

以3倍信噪比计算检出限（3S／N），结果见表2。

表2 线性回归方程、相关系数及检出限Tab.2 Linear regression equations，correlation coefficients and detection limits化合物线性回归方程相关系数检出限w／（mg·kg-1）雌三醇y=3.471×105x-3.871×1030.999 2 0.1雌二醇
y=1.944×105x-1.690×103 0.998 7 0.1炔雌醇y=7.472×104x-1.344×103 0.997 0 0.2雌酮y=4.493×105x-7.088×103 0.998 9 0.1己烯雌酚
y=3.011×105x+3.445×103 0.995 6 0.1己二烯雌酚
y=1.928×106x+1.953×104 0.996 3 0.05睾酮y=2.771×107x-2.834×104 0.999 5 0.1炔诺酮y=6.606×105x-7.430×103 0.999 3 0.2甲睾酮
y=6.834×105x-5.992×103 0.998 8 0.2 17α-羟基黄体酮y=4.887×106x-
6.485×103 0.999 6 0.1左炔诺孕酮y=2.332×105x-2.654×103 0.998 6 0.4黄体酮y=1.371×106x-3.713×103 0.999 8 0.1醋酸甲地孕酮
y=4.104×106x+1.158×104 0.999 9 0.05醋酸甲羟孕酮y=2.779×106x-
1.093×104 0.999 8 0.1己酸羟孕酮y=4.104×106x+1.158×1040.999 9 0.1
2.6 精密度和回收试验
按试验方法对膏霜、乳液、水剂等3种常见剂型的化妆品样品进行分析，计算加标回收率和测定值的相对标准偏差（RSD），结果见表3。

表3 精密度和回收试验结果（n=6）Tab.3 Results of tests for precision and recovery（n=6）化合物基质类型测定值w／（mg·kg-1）回收率／%加标量30 mg·kg-1加标量7.5 mg·kg-1加标量1.5 mg·kg-1 RSD／%7.32 114 102 81.2 2.2乳液87.5 87.5 96.4水剂85.7 81.7 108雌二醇膏霜8.34 100 106 95.2 3.8乳液102 92.9 80.9水剂102 90.5 80.3炔雌醇膏霜7.65 90.0 93.1 117 4.1乳液91.4 98.1 118水剂89.1 85.9 108雌酮膏霜7.75 89.6 95.9 119 4.0乳液95.1 94.0 85.3水剂88.4 94.1 95.6己烯雌酚膏霜6.97 96.2 94.7 85.6 2.9乳液90.6 90.5 80.7水剂87.1 84.6 114己二烯雌酚膏霜7.13 95.9 91.0 105 3.9乳液93.3 90.5 80.9水剂86.5 87.8 80.5睾酮膏霜8.14 102 109 101 3.8乳液114 115 104水剂113 104 108炔诺酮膏霜8.16 95.0 103 112 3.7乳液110 112 118水剂110 113 117甲睾酮膏霜8.63 101 109 102 4.3乳液112 114 121水剂108 118 118 17α-羟基黄体酮膏霜8.80 98.3 106 119 3.0乳液107 112 119水剂108 107 119左炔诺孕酮膏霜7.81 94.7 105 98.4 3.3乳液113 113 111水剂112 107 107黄体酮膏霜8.28 101 104 116 0.90乳液115 114 111水剂雌三醇膏霜115 114 115
表3（续）回收率／%化合物基质类型测定值w／（mg·kg-1）加标量30 mg·kg-1加标量7.5 mg·kg-1加标量1.5 mg·kg-1 RSD／%醋酸甲地孕酮膏霜8.91 105
113 107 4.1乳液114 120 119水剂109 112 110醋酸甲羟孕酮膏霜8.81 101 109 106 3.6乳液112 114 119水剂109 111 116己酸羟孕酮膏霜7.76 102 104 112 4.1乳液103 109 113水剂107 110 119
由表3可知：测定值的RSD为0.90%～4.3%，加标回收率为80.3%～121%。

2.7 样品分析
按试验方法对20批丰胸美体类、5批祛痘类和5批美白祛斑类化妆品进行分析，结果表明：有1批丰胸美体类化妆品中检出2 872.4 mg·kg-1己烯雌酚。

《化妆品安全技术规范》中7种性激素的检测方法为高效液相色谱法（二极管阵
列检测器），在进样过程中样品的基质干扰较大，且激素种类较少，很难对试验结果做出准确判断。

本工作建立了液相色谱-串联质谱法测定化妆品中15种性激素
的分析方法，采用乙腈作为提取剂，用亚铁氰化钾和乙酸锌从提取液中沉淀大分子。

本方法准确快速、抗干扰性好，能填补现有检测方法的缺漏，有效提高监管水平。

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