粪大肠菌群的测定

15.7mg硫代硫酸钠可去除样品中1.5mg活性氯，硫代硫酸钠用量可 根据样品实际活性氯量调整。
4 .无菌水:取适量实验用水，经 高压蒸汽灭菌20min， 备用。 5. 硫代硫酸钠( Na2S2O3.5H2O)。 (去除游离氯) 6.乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2O8Na2 .2H2O)。 7.乙二胺四乙酸二钠溶液: ρ (C10H14N2O8Na2 .2H2O) =0.15 g/ml 称取15g乙二胺四乙酸二钠,溶于适量水中，定容至100ml,此溶液可保存 30d。 8.硫代硫酸钠溶液: ρ ( Na2S2O3.5H2O) =0.10 g/ml 称取15.7g硫代硫酸钠， 溶于适量水中，定容至100ml，临用现配。
2. 浓缩乳糖蛋白胨培养液： (此溶液用于检验大肠菌群) 按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸馏水外，各组分用量 增加至三倍。 (即按上述配方比例三倍 (除蒸馏水外) ，配成三倍浓 缩的乳糖蛋白胨培养液)
①在何种情况下用多少三倍浓度的培养基接种？ 答：接种体积为10ml时，试管内应装入有3倍浓度乳糖蛋 白胨培养液5ml。
• 三、肯定要加塞子的，我们用的塞子是软材料 (好像是软橡胶？ 白色的，塞子中间另有一 个可以活动的塞子，能保证加塞后的试管透气，其实用什么材料不重要的。
• 四、需要的仪器设备为：生化培养箱、无菌操作台 (空气精华级别100) 、高压灭菌锅、 冰箱、干燥箱。
五、干扰和消除
1.
,能破坏微生物细胞内的酶活性，导
若接种量过高，培养液应加倍成分。这是由于样品的量大 的情况下，培养液稀释大,各种成分的相对浓度就会不足， 就不能满足细菌的生长要求，存在实验失败的概率。因此， 合理调整样品量和营养液浓度的比例需要反复实验和多组 对照。
3. EC培养液： (
)
将上述成分或含有上述成分的市售成品加热溶解于1000ml 水中，然后分装于有玻璃倒管的试管中，115℃高压蒸汽灭菌20min， 灭菌后pH值应在6.9左右。 (检验粪大肠菌群)
5 mL 3
10 mL 1 10 mL 1 10 mL 1
90 ml
9 ml
点位布设及采样频次按照GB/T14581 (水质 湖泊和水库采样技术指导 ) 、 HJ/T494 (水质 采样技术指导) 和HJ/T91 (地表水和污水监测技术规范 ) 的相关规定执行。
(一) 采集 1.采集微生物样品时，采样瓶不得用样品洗涤，采集样品于灭菌的采样瓶
致细胞死亡,可在样品采集时加入
溶液消除干
扰。
2.
具有细胞毒性，能破坏微生物细胞内的酶
活性，导致细胞死亡，可在样品采集时加入
消除干扰。
本标准所用试剂除另有说明，均为符合国家标准的
；
实验用水为新制备的蒸馏水或去离子水。
： (初发酵)
( 溴甲酚紫其pH变色范围5.2(黄色)~6.8(紫色)，它的作用是 。粪大肠在发酵过程中会产酸产气，从而使发酵管变黄并且有气泡。)
7. 一般实验室常用仪器和设备。 注:玻璃器皿及采样器具试验前要按无菌操作要求包扎，121℃高压蒸汽灭菌 20min备用。 (或者干热灭菌)
1.
将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。
每个样品至少用
接种。同一接种水样量要有
。
相对未受污染的水样接种量为10mL 、1mL 、0. 1mL 。 (每个
群浓度值。
乳糖蛋白胨培养液是国标规定的用于水源水中总大肠菌群的测定的 培养基。 配成的乳糖蛋白胨培养液呈澄清透明的紫色(下左一) ，它适用于大肠 菌群，粪大肠菌群，大肠杆菌的测定。
胆盐三号 (胆酸-脱氧胆酸钠盐混合物) ：三号胆盐用途用于抑制革兰氏阳 性菌的生长。
1884年革兰氏染色法被发明，用于细菌的形态观察和分类，根据革兰氏染色 反应的基本特征，细菌可以主要分为两大类：G阳性 (G+) 和G阴性 (G-) 。 前者经过染色后细菌细胞仍然保留初染结晶紫的蓝紫色，后者经过染色后细 菌细胞则先脱去了初染结晶紫的颜色，带上了复杂蕃红或沙黄的红色。
中。清洁水体的采样量不低于400 ml,其余水体采样量不低于100 ml。
2.采集河流、湖库等地表水样品时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插 入水中，约距水面10~15cm处，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使样品灌入瓶内 然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平往 前推。 采样量一般为采样瓶容量的80%左右。样品采集完毕后，迅速扎上无菌包装 纸。
粪大肠菌群作为常见的指示细菌，是总大肠菌群的一部分， 可以准确地 反映出水质受污染的情况，粪大肠菌为总大肠菌群的一个亚种,直接来自粪 便，除了它耐热，在44-44.5℃的高温条件下仍可生长繁殖，其他特性均与 总大肠菌群相同。
粪大肠菌群特性： ①是总大肠菌群的一部分 ②直接来自粪便，生长于人和温血动物肠道中的一组肠道细菌 (粪便污染 指示菌) ③耐热，在44-44.5℃的高温条件下仍可生长繁殖。 (耐热大肠菌群)
将10g蛋白胨、3g牛肉寖膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水 中，调节溶液pH为7.2—7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混 匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于115℃高压灭菌器中灭菌 20min，贮存于冷暗处备用。 (此溶液用于检验大肠菌群)
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液：1.6g溴甲酚紫用无水乙醇定容到100mL。
3.从龙头装置采集样品时,不要选用漏水龙头，采水前将龙头打开至最大, 放水3~5min,然后将龙头关闭，用火焰灼烧约3min灭菌或用70%~ 75%的酒精 对龙头进行消毒，开足龙头，再放水1min，以充分除去水管中的滯留杂质。 采样时控制水流速度，小心接入瓶内。
4. 采集地表水、废水样品及一定深度的样品时，也可使用灭菌过的专用 采样装置采样。在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以 免不同层次的搅扰。
(1) 初发酵
将样品加入
培养基的试管中，37℃初发酵富集培养，大肠
菌群在培养基中生长繁殖分解乳糖产酸、产气，产生的酸使溴甲酚紫指
示剂由紫色变为黄色，产生的气体进入倒管中，指示产气。 (
)
(2) 复发酵
44.5℃复发酵培养，培养基中的胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，
最后
。通过查MPN表，得出粪大肠菌
本标准适用于地表水，地下水、生活污水及废水中粪大肠菌 群的测定
本标准适用于地表水，地下水、生活污水及废水中粪大肠菌 群的测定 ③延迟培养法《水和废水监测监测分析方法》
粪大肠菌群是水质污染的重要指标之一。 目前, 我国 地表水及废水中粪大肠菌群的监测方法主要有传统的多管 发酵法(MTF) 及滤膜法(MF)。 无论是哪一种方法，都是利用其可在高温生长并发酵乳糖 产酸、产气的特点，所以实验过程最终要的环节是严格地 控制好温度。
是总大肠菌群的一部分，主要来自粪便。
又称耐热大肠菌群( thermotolerant coliforms)。44.5℃
培养24h，能发酵乳糖
的需氧及兼性厌氧革兰氏
阴性无芽孢杆菌。
2、最大可能数most probable number ( MPN) 又称稀释培养计数，是利用统计学原理，
经培养后产生的目标微生物阳性数,查表估算一定体积样品中目标 微生物存在的数量(单位体积存在目标微生物的最大可能数)。MPN/L
五管)
受污染水样接种量根据污染程度接种1mL 、0. 1mL 、0.01mL 或
0. 1mL 、0.01mL 、0.001mL 等。使用的水样量可参考下表1。
对于受到污染的样品，先将样品稀释后再按照上述操作接种， 以生活污水为 例，先将样品稀释104倍，然后按照上述操作步骤分别接种10ml、1ml和0.1ml。
乳糖蛋白胨培养基里富含蛋白胨，其 氮源和矿物质;
即为给菌株提供必需的
乳糖成分是为大肠菌群的发酵提供可发酵糖类;

氯化钠的添加量为5%，主要是为了维持渗透压的平衡; 溴甲酚紫为pH指示剂，酸性呈黄色，碱性呈紫色。 因此，能够发酵产酸的细菌的培养液变黄，如果并有产气者则可在小 倒管里看到明显的气泡;
反之，不产酸的细菌培养后液体呈紫色，不产气的在小倒管里收集不 到气体。
0
0
0
0
90
90
90
90
例
当样品接种量小于1ml时，应将样品制成稀释样品后使用。 ①1、0.1、 10-2，三个梯度来做。第一个梯度是先稀释10倍，然后三倍的蛋 白胨接种10ml。0.1的就用稀释的10倍中间样品加1ml；10-2就再稀释10倍加 1ml。 ②0.1, 0.01, 0.001 ；吸取10 ml充分混匀的样品，注入盛有90ml无菌水 的三角烧瓶中，混匀成1:10稀释样品，然后三倍的蛋白胨接种10ml；再吸取 1:10稀释样品10 ml充分混匀的样品
粪大肠菌群是大肠菌群的一种，是生长于人和温血动物肠道中的一组 肠道细菌，随粪便排出体外，约占粪便干重的1/3以上，故称为粪大 肠菌群。
受粪便污染的水、食品、化妆品和土壤等物质均含有大量的这类菌群。 若检出粪大肠菌群即表明已被粪便污染。
它主要来源于人畜粪便,通常可
。
城镇污水处理厂污染物排放标准 GB 18918－2002
注意事项：
1、本品中需要115℃下高压灭菌20min (大多数培养基121℃高压灭菌15min 的灭菌条件) 这是因为，本品中含有乳糖，121℃灭菌会使乳糖降解，碳化。 2、试验对于接种量要求10-100CfU (CfU指单位体积中的细菌、霉菌、酵母 等微生物的群落总数。) ，若接种量过高，培养液应加倍成分。这是由于样 品的量大的情况下，培养液稀释大,各种成分的相对浓度就会不足，就不能 满足细菌的生长要求，存在实验失败的概率。因此，合理调整样品量和营养 液浓度的比例需要反复实验和多组对照。
胆盐在EC培养基中的作用是什么？ 答：胆盐是猪或牛的苦胆中提取的，在EC培养基中作用是杀灭粪大肠 菌群以外其它杂菌，有利于粪大肠菌的生长。
EC培养基 115℃高压蒸汽灭菌20min
培养基保存注意: 配制好的培养基避光、干燥保存，必要时在5℃土3℃冰箱 中保存，通常瓶装及试管装培养基不超过3~6个月。 配制好的培养基要避免杂菌侵入和水分蒸发，当培养基颜 色变化，或体积变化明显时废弃不用。
5.如果采集的是含有活性氯的样品，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸
钠溶液，以除去活性氯对细菌的抑制作用(每125 m1容积加入0.1 ml
的
溶液);
6.如果采集的是重金属离子含量较高的样品，则在采样瓶灭菌前加入 乙二胺四乙酸二钠溶液，以消除干扰(每125 ml容积加入0.3 ml的乙 二胺四乙酸二钠溶液)。
习题：
1.为什么在地表水环境质量标准中改用粪大肠菌群指标代替总大肠菌
群？
答：为了有效控制生活污水对地表水质的影响。因为已经证明用粪大 肠菌群作为卫生学指标比用总大肠菌群更有代表性，粪大肠菌群只存 在于温血动物的肠道中，而总大肠菌群在某些水质条件下能在水中自 行繁殖，不能真实地代表水体受粪便污染的程度。 目前，粪大肠菌群 被认为是水体受粪便污染的最实用的指示菌。
(逐级多次稀释)
当样品接种量小于1ml时，应将样品制成稀释样品后使用。按无菌操作 (观看 大肠菌群) 要求方式吸取10ml充分混匀的样品，注入盛有90ml无菌水的三角 烧瓶中，混匀成1:10稀释样品。吸取1:10的稀释样品10ml注入盛有90 ml无菌 水的三角烧瓶中，混匀成1:100稀释样品。其他接种量的稀释样品依次类推。
1. 采样瓶:500ml带螺旋帽或磨口塞的广口玻璃瓶。 (
)
2 . 高压蒸汽灭菌器: 115℃ (培养基) 、 121℃可调 (无菌水、玻璃器皿) 。
3 . 恒温培养箱或水浴锅:允许温度偏差37℃士0.5 ℃、 44℃士0.5℃。
4. pH计:准确到0.1pH单位。
5. 接种环:直径3mm。
6. 试管: 300ml、50ml、20ml。
• 试管的规格大约为长度--cm,直径2--2.5cm,小玻璃管的长度大约2-3cm直径约0.3-0.5cm 。 操作的时候是把小的玻璃管 (一端封闭)开口的一端朝大试管底部放入，至于需要多少支。 要看你一次做几个样品，几个倍数，我们一般准备30--50套。
• 二、不管是什么培养基，我们都是自己配制，试剂商店里可以买到的 (按方法中所列试剂 品种购买。