酶联免疫吸附实验PPT课件
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四、注意事项 1、所有样品按传染源处理； 2、加试剂前应混匀，力求滴加准确； 3、加样应加在板孔的底部，避免产生气泡并迅速完成； 4、洗涤时各孔均需加满，洗涤必须彻底，防止产生假阳性； 5.温育的时间要严格控制。
第22页/共Leabharlann 3页自习五、 ELISA的影响因素
（一）固相载体 （二）抗原 （三）试验样品 （四）结合物
第3页/共43页
免疫标记技术 = 免疫技术 + 标记技术
抗原抗体反应 特异性
酶
示踪物标记 荧光素
同位素
灵敏性
免疫标记技术的主要特点： 高度特异性、高度灵敏性
第4页/共43页
免疫标记技术
放射物标记技术
酶标记技术
免疫荧光技术
其他标记技术
酶联免疫吸附技术
酶免疫组化技术
第5页/共43页
酶免疫技术(enzyme immunoassay)
第9页/共43页
常用酶及其底物
peroxidase (POD)
1.辣根过氧化物酶(HRP) 常用底物： (1)邻苯二胺(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。 (2)四甲基联苯胺(TMB)：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌 性, 但水溶性差。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，
最适吸收波长为 450nm。
2.碱性磷酸酶(AP) 常用底物 对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。 AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性较HRP差，且价 高，故应用不如HRP普及。
第10页/共43页
Colorimetric ELISA Substrates
第11页/共43页
ELISA常用的几种方法 (一)测定抗原的，主要有四种方法
记录结果有下列几种方法： 1、“+”或“-”：所有超过规定的O.D值（如O.D，0.4） 的标本均属阳性，此规定O.D值是根据事先测定大量阴 性标本所取得的，此规定值是阴性标本的上限。或者以 一组阴性标本O.D平均值加2～3个标准差作为阳性阈值。 2、直接以O.D值来表示，如0.4、0.7、1.2，O.D值越 大，阳性反应越强，但此数值是在固定实验条件下得到 的结果，而且每次实验都要有参考标本作对照。 3、以终点滴度表示：将标本作连续稀释，最高稀释度 能出现阳性反应者（即OD值仍大于阳性阈值，即为该 标本的滴度。
第26页/共43页
（四）结合物
在ELISA中，用酶标记的抗体或抗原统称为结合 物，此为进行ELISA检测的关键试剂。常规使用 ELISA法的主要问题是能够简便地制备酶结合物， 而此种制备好的酶结合物要求稳定，具有很高的 酶活性，抗原或抗体的特异性，产量高及成本低。
第27页/共43页
（五）洗涤剂与稀释剂
第8页/共43页
ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程 称为包被，加待测抗体, 再加相应酶标记抗体，生成抗 原--待测抗体--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物 反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗 体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同理也可 包被抗体，测定抗原含量。
由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果， 从而使测定方法达到很高的敏感度。
一、实验目的
• 掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理 • 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法 • 了解其他免疫标记技术
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二、实验原理
免疫学分析方法发展很快，特别是在使 用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使 原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性 方面都不能相比。继50年代的免疫荧光（IF） 和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后， 在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗 体的分析技术（酶免疫技术）。
第7页/共43页
ELISA的基本原理有三条：
（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面， 是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附， 并保持其免疫学活性；
（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合 物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；
（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加 入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在， 而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的
所用仪器如吸管、烧杯试管都要清洁，用于酶 结合和底物的吸管和容器一定要分开。试剂要 求标准化
第34页/共43页
六、ELISA的应用
ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原 则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原， 可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。酶免疫试 验（EIA）结合光学显微镜或电子显微镜可进行抗 原定位与结构的研究，用酶标记抗原或抗体结合免 疫扩散及免疫电泳可提高试验的敏感性。在实际应 用方面可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、 法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。 因此，它和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、
1.即表面抗原（HbsAg）和表面抗体（抗-HBs）、 2.e抗原（HBeAg）和e抗体（抗-HBe）、 3.核心抗原（HBcAg）和核心抗体（抗-HBc）
因核心抗原主要存在于肝细胞中，血清中不能表达，检测困难， 故只能检测二对半而不能检测三对，所以称为二对半。
HBV感染后的血清学指标:
HBsAg, HBsAb
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免疫标记技术（immunolabelling technique）
是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或 电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行 的抗原抗体反应。
特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、 免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。
第20页/共43页
结果判定：
1、临界值（CO，cutoff）的计算：临界值=阴性 对照孔OD均值N×2.1。
2、阴性对照孔OD (optical density)均值大于0.1 时重新实验，小于0.05时以0.05计算。 结果判定：样品OD值S/ CO≥1者为阳性， 样品OD值S/ CO＜1者为阴性。
对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚 培养物以及病毒接种动物的脏器等，它们当中存在着许多 非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲 和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。
第25页/共43页
（三）试验样品
血清、血浆或其他体液，均可作为ELISA的试验样品（标 本）。但应注意分离血清时，血液要求放置室温中凝固 收缩，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否则会使大部分IgM 和少量IgG丧失活性。关于人血清在保存过程中抗体的稳 定性报导尚不多。但一般认为作ELISA血清最好要新鲜， 若要贮藏，必须少量分装保存于低温冰箱，并防止反复 冻融。血浆可用肝素毛细管法采血，而血清可用滤纸片 法采血。
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（七）作用时间
(1) 任意确定一个时间，如20分钟或30分钟终止反应，测 定被检标本和阳性参考标本的O.D值。这样所得的数据要进 行校正，校正可按下列公式：
校正后O.D绝对值=被检标本的O.D值*（1.0/阳性标本的 O.D值） (2) 制备好一批酶结合物后预试时间，在反应温度固定时， 当阳性参考血清O.D值达到1.0时终止反应，记录这个时间， 如30分钟，以后用本批酶结合物测定待检样品时都采用同 一时间终止反应，这个办法不需要校正，比较方便。
第24页/共43页
（二）抗原
包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和 稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原 中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性 和特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫 学活性。
对大多数传染病和寄生虫病的血清学诊断中所用的抗 原并非要求十分严格，一般能用于补体结合试验的可溶性 抗原均可用于ELISA。
加入牛血清白蛋白（BSA）和吐温—20抑制非 特异性蛋白的竞争性吸附作用。 它们有良好的封阻作用
第28页/共43页
（六）底物
（1）底物在未被酶催化以前应该是无色的，而经 酶催化后有明显的颜色变化，这 样可使结果分辨清楚；
（2）所显色泽易干洗脱； （3）显色后的产物要求稳定，在作定量测定时所产生的有色物质应该是可溶性的； （4）价廉，易得而且无毒。
是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反 应相结合而建立的一种免疫检测技术。
就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原 或抗体的一种免疫学标记技术。
Ag + AbE
AgAbE
+ 底物
呈色反应
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酶联免疫吸附试验ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）
(五）洗涤剂与稀释剂 （六）底物 （七）作用时间 （八）结果判断 (九)试验的重复性（精确度） （ 十 ） 对 使 用 仪 器 要 求第23页/共43页
（一）固相载体
在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑 料管。但每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能 是有显著差别的。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型 及其表面性质有关。特别是塑料制品在加工过程中因工艺 不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差异，甚 至完全丧失吸附能力。因此，对每批制品在使用前，必须 经过实验室鉴定 。
第30页/共43页
（八）结果判断
ELISA的试验结果可用肉眼观察颜色反 应的深浅作出判断，也可用分光光度计作 精确测定。当然,后者更为正确。而肉眼观 察更为简便，而且也有一定正确性。
不论用哪种方法判定结果，每次都 要有阳性和阴性参考血清作对照，这样可 以消除一些外界的影响因素。
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(九)试验的重复性（精确度）
是一类常用的酶免疫技术。是将已知的抗原或抗体吸附在 固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。
ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于 多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病 等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗 原的定量测定。 ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动 化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于 一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于 血清流行病学调查。 本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的 循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。
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4 、 以 “ 比 值 ” 表 示 ： 求 出 被 检 标 本 的 O. D 值 与 一 组 阴 性 标 本 O. D 值 的 比 值 ， 例 如 为 阴 性 标 本 的 2 倍 或 3 倍 ， 即 为阳性，比值小于2.1而大于1.5为可疑，<1.5为阴性。 测定标本O.D值-空白O.D值 —————————————≥2.1 阴性对照O.D值-空白O.D值 如在此测定时以空白校正“O”点。
5、以“单位”来表示：在测定被检标本的同时，再测 定一个含已知单位数的阳性参考血清，用不同稀释度作 ELISA检测后，以O.D值为纵坐标，单位数为横坐标，画 出标准曲线。以后可根据被检标本的O.D值，从曲线上 找出相应的单位数，再乘于血清的稀释倍数，即可得出 被检标本的单位数。
第33页/共43页
（十）对使用仪器要求
乙肝表面抗原，存在于HBV感
HBeAg, HBeAb
染者的血清中,为感染指标之
一。 HBcAb(IgG,IgM)
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实验材料
1.HBsAg诊断试剂盒 2.HBsAg抗原（阳性对照），阴性血清，待 检血清
第19页/共43页
微孔条已经包被HBsAb
1、编号：微孔条按顺序编号。 2、加样：分别加入待检血清、阳性血清、阴性血清各50ul， 空白对照。 3、加入酶结合物：每孔中加入酶结合物50ul，空白对照孔不加， 轻拍混匀。 4、温育：贴上胶纸，37℃温育30分钟。 5、洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完往后扣干（每次保持 30-60秒的浸泡时间）。 6、显色：每孔加底物A、B各50ul，轻拍混匀，封口，37℃暗 置10-15分钟。 7、终止：每孔加终止液50ul，轻拍混匀。 8、测定：用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值，并记录结果， 读数在加终止液10分钟内完成。
1.竞争法 2.双抗体夹心法 3.改良的双抗体夹心法 4.抑制性测定法。
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第14页/共43页
第15页/共43页
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(二)测定抗体方面：所用的方法称为间接法，也 是目前最常用的方法. 第17页/共43页
三、实验步骤
乙肝病毒存在三对抗原抗体系统
四、注意事项 1、所有样品按传染源处理； 2、加试剂前应混匀，力求滴加准确； 3、加样应加在板孔的底部，避免产生气泡并迅速完成； 4、洗涤时各孔均需加满，洗涤必须彻底，防止产生假阳性； 5.温育的时间要严格控制。
第22页/共Leabharlann 3页自习五、 ELISA的影响因素
（一）固相载体 （二）抗原 （三）试验样品 （四）结合物
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免疫标记技术 = 免疫技术 + 标记技术
抗原抗体反应 特异性
酶
示踪物标记 荧光素
同位素
灵敏性
免疫标记技术的主要特点： 高度特异性、高度灵敏性
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免疫标记技术
放射物标记技术
酶标记技术
免疫荧光技术
其他标记技术
酶联免疫吸附技术
酶免疫组化技术
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酶免疫技术(enzyme immunoassay)
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常用酶及其底物
peroxidase (POD)
1.辣根过氧化物酶(HRP) 常用底物： (1)邻苯二胺(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。 (2)四甲基联苯胺(TMB)：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌 性, 但水溶性差。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，
最适吸收波长为 450nm。
2.碱性磷酸酶(AP) 常用底物 对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。 AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性较HRP差，且价 高，故应用不如HRP普及。
第10页/共43页
Colorimetric ELISA Substrates
第11页/共43页
ELISA常用的几种方法 (一)测定抗原的，主要有四种方法
记录结果有下列几种方法： 1、“+”或“-”：所有超过规定的O.D值（如O.D，0.4） 的标本均属阳性，此规定O.D值是根据事先测定大量阴 性标本所取得的，此规定值是阴性标本的上限。或者以 一组阴性标本O.D平均值加2～3个标准差作为阳性阈值。 2、直接以O.D值来表示，如0.4、0.7、1.2，O.D值越 大，阳性反应越强，但此数值是在固定实验条件下得到 的结果，而且每次实验都要有参考标本作对照。 3、以终点滴度表示：将标本作连续稀释，最高稀释度 能出现阳性反应者（即OD值仍大于阳性阈值，即为该 标本的滴度。
第26页/共43页
（四）结合物
在ELISA中，用酶标记的抗体或抗原统称为结合 物，此为进行ELISA检测的关键试剂。常规使用 ELISA法的主要问题是能够简便地制备酶结合物， 而此种制备好的酶结合物要求稳定，具有很高的 酶活性，抗原或抗体的特异性，产量高及成本低。
第27页/共43页
（五）洗涤剂与稀释剂
第8页/共43页
ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程 称为包被，加待测抗体, 再加相应酶标记抗体，生成抗 原--待测抗体--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物 反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗 体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同理也可 包被抗体，测定抗原含量。
由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果， 从而使测定方法达到很高的敏感度。
一、实验目的
• 掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理 • 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法 • 了解其他免疫标记技术
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二、实验原理
免疫学分析方法发展很快，特别是在使 用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使 原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性 方面都不能相比。继50年代的免疫荧光（IF） 和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后， 在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗 体的分析技术（酶免疫技术）。
第7页/共43页
ELISA的基本原理有三条：
（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面， 是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附， 并保持其免疫学活性；
（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合 物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；
（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加 入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在， 而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的
所用仪器如吸管、烧杯试管都要清洁，用于酶 结合和底物的吸管和容器一定要分开。试剂要 求标准化
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六、ELISA的应用
ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原 则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原， 可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。酶免疫试 验（EIA）结合光学显微镜或电子显微镜可进行抗 原定位与结构的研究，用酶标记抗原或抗体结合免 疫扩散及免疫电泳可提高试验的敏感性。在实际应 用方面可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、 法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。 因此，它和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、
1.即表面抗原（HbsAg）和表面抗体（抗-HBs）、 2.e抗原（HBeAg）和e抗体（抗-HBe）、 3.核心抗原（HBcAg）和核心抗体（抗-HBc）
因核心抗原主要存在于肝细胞中，血清中不能表达，检测困难， 故只能检测二对半而不能检测三对，所以称为二对半。
HBV感染后的血清学指标:
HBsAg, HBsAb
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免疫标记技术（immunolabelling technique）
是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或 电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行 的抗原抗体反应。
特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、 免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。
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结果判定：
1、临界值（CO，cutoff）的计算：临界值=阴性 对照孔OD均值N×2.1。
2、阴性对照孔OD (optical density)均值大于0.1 时重新实验，小于0.05时以0.05计算。 结果判定：样品OD值S/ CO≥1者为阳性， 样品OD值S/ CO＜1者为阴性。
对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚 培养物以及病毒接种动物的脏器等，它们当中存在着许多 非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲 和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。
第25页/共43页
（三）试验样品
血清、血浆或其他体液，均可作为ELISA的试验样品（标 本）。但应注意分离血清时，血液要求放置室温中凝固 收缩，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否则会使大部分IgM 和少量IgG丧失活性。关于人血清在保存过程中抗体的稳 定性报导尚不多。但一般认为作ELISA血清最好要新鲜， 若要贮藏，必须少量分装保存于低温冰箱，并防止反复 冻融。血浆可用肝素毛细管法采血，而血清可用滤纸片 法采血。
第29页/共43页
（七）作用时间
(1) 任意确定一个时间，如20分钟或30分钟终止反应，测 定被检标本和阳性参考标本的O.D值。这样所得的数据要进 行校正，校正可按下列公式：
校正后O.D绝对值=被检标本的O.D值*（1.0/阳性标本的 O.D值） (2) 制备好一批酶结合物后预试时间，在反应温度固定时， 当阳性参考血清O.D值达到1.0时终止反应，记录这个时间， 如30分钟，以后用本批酶结合物测定待检样品时都采用同 一时间终止反应，这个办法不需要校正，比较方便。
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（二）抗原
包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和 稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原 中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性 和特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫 学活性。
对大多数传染病和寄生虫病的血清学诊断中所用的抗 原并非要求十分严格，一般能用于补体结合试验的可溶性 抗原均可用于ELISA。
加入牛血清白蛋白（BSA）和吐温—20抑制非 特异性蛋白的竞争性吸附作用。 它们有良好的封阻作用
第28页/共43页
（六）底物
（1）底物在未被酶催化以前应该是无色的，而经 酶催化后有明显的颜色变化，这 样可使结果分辨清楚；
（2）所显色泽易干洗脱； （3）显色后的产物要求稳定，在作定量测定时所产生的有色物质应该是可溶性的； （4）价廉，易得而且无毒。
是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反 应相结合而建立的一种免疫检测技术。
就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原 或抗体的一种免疫学标记技术。
Ag + AbE
AgAbE
+ 底物
呈色反应
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酶联免疫吸附试验ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）
(五）洗涤剂与稀释剂 （六）底物 （七）作用时间 （八）结果判断 (九)试验的重复性（精确度） （ 十 ） 对 使 用 仪 器 要 求第23页/共43页
（一）固相载体
在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑 料管。但每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能 是有显著差别的。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型 及其表面性质有关。特别是塑料制品在加工过程中因工艺 不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差异，甚 至完全丧失吸附能力。因此，对每批制品在使用前，必须 经过实验室鉴定 。
第30页/共43页
（八）结果判断
ELISA的试验结果可用肉眼观察颜色反 应的深浅作出判断，也可用分光光度计作 精确测定。当然,后者更为正确。而肉眼观 察更为简便，而且也有一定正确性。
不论用哪种方法判定结果，每次都 要有阳性和阴性参考血清作对照，这样可 以消除一些外界的影响因素。
第31页/共43页
(九)试验的重复性（精确度）
是一类常用的酶免疫技术。是将已知的抗原或抗体吸附在 固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。
ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于 多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病 等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗 原的定量测定。 ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动 化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于 一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于 血清流行病学调查。 本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的 循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。
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4 、 以 “ 比 值 ” 表 示 ： 求 出 被 检 标 本 的 O. D 值 与 一 组 阴 性 标 本 O. D 值 的 比 值 ， 例 如 为 阴 性 标 本 的 2 倍 或 3 倍 ， 即 为阳性，比值小于2.1而大于1.5为可疑，<1.5为阴性。 测定标本O.D值-空白O.D值 —————————————≥2.1 阴性对照O.D值-空白O.D值 如在此测定时以空白校正“O”点。
5、以“单位”来表示：在测定被检标本的同时，再测 定一个含已知单位数的阳性参考血清，用不同稀释度作 ELISA检测后，以O.D值为纵坐标，单位数为横坐标，画 出标准曲线。以后可根据被检标本的O.D值，从曲线上 找出相应的单位数，再乘于血清的稀释倍数，即可得出 被检标本的单位数。
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（十）对使用仪器要求
乙肝表面抗原，存在于HBV感
HBeAg, HBeAb
染者的血清中,为感染指标之
一。 HBcAb(IgG,IgM)
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实验材料
1.HBsAg诊断试剂盒 2.HBsAg抗原（阳性对照），阴性血清，待 检血清
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微孔条已经包被HBsAb
1、编号：微孔条按顺序编号。 2、加样：分别加入待检血清、阳性血清、阴性血清各50ul， 空白对照。 3、加入酶结合物：每孔中加入酶结合物50ul，空白对照孔不加， 轻拍混匀。 4、温育：贴上胶纸，37℃温育30分钟。 5、洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完往后扣干（每次保持 30-60秒的浸泡时间）。 6、显色：每孔加底物A、B各50ul，轻拍混匀，封口，37℃暗 置10-15分钟。 7、终止：每孔加终止液50ul，轻拍混匀。 8、测定：用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值，并记录结果， 读数在加终止液10分钟内完成。
1.竞争法 2.双抗体夹心法 3.改良的双抗体夹心法 4.抑制性测定法。
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(二)测定抗体方面：所用的方法称为间接法，也 是目前最常用的方法. 第17页/共43页
三、实验步骤
乙肝病毒存在三对抗原抗体系统