哮喘大鼠肺组织Akt蛋白表达上调对IL-4,IL-12和IL-13的影响

哮喘大鼠肺组织Akt蛋白表达上调对IL-4，IL-12和IL-13的影响
作者：徐慧,戴元荣,夏晓东,吴成云作者单位：温州医学院附属第二医院呼吸内科，浙江温州
【摘要】目的：研究Akt蛋白对支气管哮喘大鼠IL-4，IL-12和IL-13表达的影响。

方法：雄性SD大鼠24只，随机分为3组：对照组(C组)、哮喘组(A组)、渥曼宁青霉素组(Wortmannin，W组)，每组8只。

以卵白蛋白(OVA)致敏和激发建立大鼠哮喘模型。

各组大鼠于末次激发后24 h，放血处死。

酶联免疫吸附试验(ELISA)测定BALF中IL-4，IL-13和IL-12的浓度;免疫组化法测定肺组织中p-Akt
蛋白的表达;Western blot测定肺组织匀浆中p-Akt蛋白的含量。

结果：A组p-Akt蛋白的表达明显高于C 组，W组p-Akt蛋白的表达低于A组，但仍高于C组;BALF中IL-4，IL-13的含量A组明显高于C组，W组IL-4，IL-13的含量低于A组，但仍高于C组，BALF中IL-12的含量A组明显低于C组，W组IL-12的含量低于C组，但仍高于A组。

结论：哮喘大鼠模型中出现了Akt蛋白的激活，细胞因子失衡可能与Akt蛋白的激活有关。

【关键词】哮喘;细胞因子;磷脂酰肌醇3激酶;蛋白激酶B
Effect of up-regulation of protein Akt in lung tissue of asthmatic rat on IL-4，IL-12 and IL-13 XU Hui，DAI Yuan-rong，XIA Xiao-dong，WU Cheng-yun，HE Jian-bo. Department of Respi-ratory Medicine，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325027
Abstract: Objective: To study the effect of protein Akt in asthma airway inflammation of asthmatic rats on the cytokine IL-4，IL-13 and IL-12. Methods: Twenty-four male adult Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into the control group (C)，the asthma group (A) and Wortmannin group (W). The rats’ asthma models were established，in which rats were sensitized with OVA and Al (OH)3，and repeatedly exposed to aerosolized ovalbumin. The rats were sacrificed at 24 hours afer last challege，Meanwhile the concentration of IL-4，IL-13 and IL-12 in BALF were measured with ELISA. The expressions of p-Akt protein were detected with Immuno-histochemistry (IHC). The level of p-Akt in lung homogenate was measured with Western blot. Results: The expressions of p-Akt protein of lung tissues in the group A were higher than those
in group C，and the expressions of p-Akt protein of group W were lower than that of group A，but higher than that of group C. The concentration of IL-4 and IL-13 in BALF of group A were significantly higher than that of group C and those of group W were lower than those of group A but higher than those of group C. The concentration of IL-12 in BALF of group A was significantly lower than that of group C and that of group W was lower than that of group C，but higher than that of group A. Conclusion: The protein Akt is activated in the asthmatic rats model，and the imbalance of cytokine and the airway inflammation in the asthmatic rats model maybe regulated by activation of Akt.
Key words: asthma;cytokine;PI3K;PKB/Akt
细胞因子是参与非特异性免疫反应、炎症反应的一组小分子多肽和糖蛋白。

细胞因子网络失衡可能是哮喘发病的分子生物学基础之一，Th2优势应答是哮喘发病的始动和维持因素。

哮喘患者体内存在的受体信号转导机制调控着细胞因子、黏附分子和炎性递质对机体的作用。

目前的研究认为，PI3K/Akt
信号传导途径在哮喘发生、发展中起了重要作用。

本实验建立大鼠哮喘模型，测定肺组织中p-Akt蛋白的表达及肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中IL-4，IL-12和IL-13的浓度，进一步明确哮
喘的发病机制，为寻找更有针对性的治疗方法提供依据。

1 材料和方法
1.1 动物分组及模型的建立SPF级雄性SD(Sprague-Dawlay)大鼠32只，由温州医学院实验动物中心提供(SYXK(浙)2005-0061)，6～8周龄，体重(200±10)g，随机分为对照组(C组)、哮喘组(A组)和渥曼宁青霉素组(Wortmannin，W组)，每组8只。

A组和W组参照Temelkovski等[1]的方法建立哮喘模型，每日激发哮喘1次，共8周。

C组雾化吸入生理盐水，W组在模型组基础上，每次激发前半小时以Wortmannin 15μg/kg腹腔注射。

1.2 标本的采集与制备各组大鼠分别于末次激发后24 h内，10%水合氯醛溶液(5 mL/kg)腹腔麻醉，打开胸腔，分离肺组织，结扎左支气管，行右支气管灌洗，用10 mL的生理盐水分3次注入，并轻轻按摩肺组织，约30 s后回收BALF，回收率高于80%，回收液3 000 r/min离心15 min，取上清分装保存于-80 ℃备用。

切取左肺肺门中上、中下肺段组织，浸入4%多聚甲醛固定，5～6 h转入70%乙醇，石蜡包埋切片，备做免疫组化染色。

左肺肺门中上肺段组织迅速置于液氮，-80℃保存备用。

1.3 BALF中IL-4，IL-13和IL-12含量检测应用双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测BALF 中IL-4，IL-13和IL-12的含量，具体步骤按照试剂盒说明书进行。

1.4 免疫组化法检测肺组织p-Akt蛋白的表达兔抗p-Akt多克隆抗体购于美国Cell signal-ing公司，稀释度为1:100，按MaxvisionTM法(福州迈新生物技术有限公司)说明书操作步骤进行操作。

对照试验选用PBS代替一抗，其他步骤相同。

用image-pro plus图像分析软件测定阳性部位的平均吸光度。

1.5 Western blot法检测肺组织p-Akt表达
①取-80 ℃保存的肺组织100 mg，PBS润洗，加预冷的Western及IP裂解液，匀浆，冰后离心3 min，取上清，超声5 s×4次破碎细胞核，超速离心后收集上清。

②BCA法测定肺组织匀浆总蛋白浓度。

③蛋白质电泳和印迹电转移：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳配置质量分数为10%的分离胶和5%的浓缩胶，电泳条件：恒压，先80 V，待溴酚蓝到达分离胶后改电压为120 V，直至溴酚蓝跑到凝胶底部。

电泳结束后进行印迹转移，应用NC膜300 mA恒流电转60 min，转移完毕后分别用立春红和考马斯亮兰染膜和胶。

④Western blot分析：采用5%脱脂牛奶室温摇床封闭60 min，TBST洗膜，加入5%脱脂牛奶稀释的兔抗大鼠p-Akt多克隆抗体(1:800)，4 ℃过夜，次日加入5%脱脂牛奶稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗兔二抗(1:1 000)，同时加入GAPDH(1:10 000)，洗膜后，ECL显色、胶片曝光，用Quantity One凝胶软件分析系统分析计算其灰度值。

1.6 统计学处理方法组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐者用LSD检验，方差不齐采用Dunnett’s T3检验，两变量的相关分析用Pearson直线相关分析法。

2 结果
2.1 各组大鼠BALF液中IL-4，IL-13和IL-12浓度比较BALF中IL-4，IL-13的含量A组明显高于C组，W组IL-4，IL-13的含量低于A组，但仍高于C组;BALF中IL-12的含量A组明显低于C组，W组IL-12的含量低于C组，但仍高于A组。

详见表1。

2.2 各组大鼠肺组织p-Akt蛋白免疫组化检测结果p-Akt蛋白表达于细胞浆和细胞核，主要表达的
细胞有支气管上皮细胞、气道平滑肌细胞及散在的炎性细胞。

免疫组化结果显示，A组有强阳性表达，而C组只有极少量表达，A组表达量明显高于C组(P <0.01);W组有阳性表达，但较A组弱，p-Akt活化量明显低于A组(P <0.01)，高于C组(P <0.01)。

详见表2。

2.3 各组大鼠肺组织p-Akt的Western blot检测结果根据总蛋白浓度，电泳上样量为50μg，A组光密度值明显高于C组(P <0.01)，W组的光密度值明显低于A组(P <0.01)。

详见表3。

2.4 相关性分析肺组织匀浆中p-Akt蛋白含量与BALF液中IL-4(r=0.845)及IL-13浓度(r=0.849)之间均呈显著正相关，而与IL-12浓度(r=-0.917)间存在显著的负相关关系(均P <0.01，均n=18)。

3 讨论
PI3K信号转导途径可介导免疫炎性细胞激活、迁移，可能在哮喘的发病机制中发挥重要作用[2]。

PI3K存在多种异构体，根据PI3K的结构特点和底物分子不同可将其分为三大类，其中，IA类PI3K广泛表达于哺乳动物的肺、心、脑组织中。

PI3K的靶蛋白是Akt(又称蛋白激酶B)，故在实验研究中，通常以p-Akt的水平反映PI3K的活性[3]。

有研究显示，支气管哮喘患者及动物模型中，出现了p-Akt蛋白的活化，提示该信号转导通路可能与支气管哮喘的发病存在重要关系[4]。

Farghaly等[5]通过实验证明，IL-13引起支气管气道高反应是通过IA类PI3K P110δ催化亚单位介导的。

在这一实验中，研究者将支气管组织与IL-13一起孵育，结果发现，支气管组织出现了PI3K活性的增高，即检测到p-Akt水平的增加，同时出现了支气管收缩性的增加，而加用PI3K特异性抑制剂——渥曼宁青霉素则能抑制IL-13引起的这种气道高反应性。

另有研究发现，Th1/Th2平衡受到PI3K IA 类调节亚单位P85的影响[6]，IA类PI3K能诱导Th2反应，抑制Th1反应。

PI3K已经被证明是树突状细胞产生IL-12的内源性抑制剂[7]，在体内实验中，敲除了p85α基因的脾和骨髓所衍生的树突状细胞比野生型的树突状细胞能产生更多的IL-12[8]，树突状细胞过度产生IL-12可能导致免疫平衡向Th1方向偏离。

此项研究表明PI3K是通过控制IL-12的产生来调节Th1/Th2平衡关键点之一。

本实验用免疫组化和Western blot方法均检测到A组p-Akt表达显著高于C组，表明大鼠哮喘模型中出现了PI3K/Akt信号通路的激活。

A组BALF中IL-4和IL-13水平均明显高于C组和W组，而且与p-Akt存在显著正相关;而A组BALF中IL-12水平均显著低于C组和W组，且与p-Akt表达存在显著负相关，则可以理解为活化的Akt蛋白通过上调IL-4和IL-13、下调IL-12等细胞因子影响Th1/Th2平衡，参与了哮喘发病的慢性炎症过程，渥曼宁青霉素能通过调控细胞因子网络平衡，减轻哮喘气道炎症。

【参考文献】
[1] Temelkovski J, Hogan SP, Shepherd DP,et al.An improved murine model of asthma:selective airway inflammation,epi-thelial lesions and increased methacholine responsiveness following chronic exposure to aerosolised allergen[J].Thorax,1998,53(10):849-856.
[2] 孔志斌，王鸿程. 磷脂酰肌醇3激酶与肺部疾病[J]. 国际呼吸杂志,2007,27(1):67-70.
[3] Lin CH,Yeh SH,Lin CH,et al. A Role for PI-3 Kinase Signal-ing Pathway in Fear Conditioning and Synaptic Plasticity in the Amygdala[J].Neuron,2001,31(5):841-851.
[4] Myou S,Leff AR,Myo S,et al.Blockade of inflammation and airway hyperresponsiveness in immune
sensitized mice by dominant negative phophoinositide 3-kinase-TAT[J].Exp
Med,2003,198(10):1573-1582.
[5] Farghaly HS, Blagbrough IS, Medina-Tato DA,et al.Interleukin 13 Increases Contractility of Murine TrachealSmooth Muscle by a Phosphoinositide 3-kinase p110δDe-pendent Mechanism [J]. Mol Pharmacol,2008,73(5):1530-1537.
[6] Fukao T, Yamada T, Tanabe M, et al Selective loss of gas-trointestinal mast cells and impaired immunity in PI3K de-ficient mice[J].Nat Immunol,2002,3(3):295-304.
[7] Fukao T, Tanabe M, Terauchi Y, et al. PI3K mediated nega-tive feedback regulation of IL-12 production in DCs [J]. Nat Immunol,2002,3(9):875-881.
[8] Ward SG, Finan P. Isoform specific phosphoinositide 3-kinase inhibitors as therapeutic agents [J].Curr Opin Pharmacol,2003,3(4):426-434.。