药品微生物限度与无菌检查方法验证实验的要点及体会

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表2中上市抽验样品（液体制剂）的最少检验量
供试品装量V (ml)
≤1 1<V<5 5 ≤ V<20 20 ≤V<50 50 ≤V<100 50 ≤V<100(静脉给药) 100 ≤V ≤ 500 V>500 * 每种培养基各接种10支供试品
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为什么验证?
• 1）、采用经过验证的方法，是分析测量科学的基本 要求，是各种法规遵循工作的基础。药品微生物检 查作为整个药品质量体系中的一个环节，应与其他 检验项目一样，对方法和条件进行考察，以保证结 果的科学性，如鉴别、含量测定。 • 2）、验证的思想其实早已贯彻于微生物检测的诸多 方面：无菌环境验证（尘埃离子、浮游菌、沉降菌 检测）、灭菌器的验证、培养基灵敏度检测、阴性 对照、阳性对照等等。
• 验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每一 个环节均应有合理的证明（验证），保证其对结果判 断没有影响。 • 前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应在 验证范围内。已有标准规程（SOP）和充足实验证明的 前处理方法可以直接采用，但出现疑问应进一步研究 提高。 • 供试品中抗菌活性的去除是当前验证工作的重点。尤 其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。
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药物名称 抗栓再造丸 更年安胶囊 清热安宫丸 通宣理肺丸 肝德志胶囊 宁心安神胶囊 防癌胶囊 肠胃舒胶囊 骨络通酒
生产企业 辽宁华鑫药业有限公司 福州金象中药药业有限公司 江西国药药业有限公司 广东阳江制药厂 四川省通阳制药厂 广西南宁万士达制药厂 北京北卫药业有限公司 北京北卫药业有限公司 北京北卫药业有限公司
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菌种和实验用菌液
菌种保藏及应用参考方法：
干菌种（0代） 100ml液体培养基复苏（1代） 100ml液体培养基复壮（2代） 加100ml 20%无菌甘 油混匀，1ml/管冻存管分装，-20℃或-80℃保存 每次使用取1支自然（室温）解冻，取0.1ml接种至10ml 液体培养基（生孢梭菌用12ml硫乙醇酸盐流体培养基） 按规定培养、稀释（3代）
27 47 27
31 33 64
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怎么验证？
How?
• 利用供试品与微生物的差异，降低或消 除供试品的影响，通过模拟实验对降低 或消除效果加以检验。
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供试品污染微生物检查
供试品
前处理
稀释 溶解 分散 萃取 离心
一、方法验证实验的背景及程序
• 1、关于方法验证（背景） • 2、方法验证实验的一般原则和程序
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Байду номын сангаас
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1、关于方法验证（背景）
《中国药典》2005版 国食监注〔2005〕234号“关于颁布和执行《中国 药典》2005年版有关事宜的通知” 国药典发〔2005〕98号“关于执行《中国药典》 2005年版微生物限度检查法和无菌检查法有关 问题的说明” 中检药〔2006〕862号“第七届全国药品检验所抗 生素室主任工作会议暨全国药品微生物检验方 法及标准研讨会会议纪要”
抗菌活性去除效果的检验
• 应根据供试品的特点，选择敏感菌株，对 供试品抗菌活性去除效果加以检验（阳性 菌的回收实验），再按药典要求全面验证， 提高效率。
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选择敏感菌株
间接方法——文献、技术资料（可靠） 直接方法——预实验（体外抑菌实验） 参考选择： 一般中药选择枯草和金葡； 一般抗生素根据抗菌谱选择。
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为什么验证?
• 3）、2005版充分借鉴发达国家经验，将微生物检查 方法的验证实验进行了更加系统化的规定和要求。 验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每 一个环节均应有合理的证明（验证），保证其对结 果判断没有影响。 • 4）、有了系统的方法验证，可以避免以往因为阳性 菌选择不合理、方法不合理而造成的漏检、误判， 以保证结果的科学可靠，这一点无论对于当前无菌 检查的一次性报告，还是对于实验室认证认可、以 及新的药品注册管理办法的要求都是相一致的。
93
80 100 89 100 83 100 100
1
0 <70 0 <70 <70 <70 <70 <70 <70
67
51 <70 0 <70 <70 <70 <70 <70 <70
100
100 100 100 100 100 100 100 100 18 100
88
100 100 100 100 100 100 100 100 100
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为什么验证？
• 5）、验证的必要性（质量控制的新手段）：
不同企业以及同企业不同批次黄连上清丸稀释法 的回收率比较试验结果，可能反映了不同黄连上 清丸样品的质量差异。
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表5 七企业黄连上清丸稀释法的回收率比较实验结果 Tab 1 Recovery of dilute method in microbiological test of huanglianshangqingwan from 7 corporations
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无菌检查样品
三点体会：
三是对“检验数量”和“检验量”的把握应考虑 便于实际操作，比如处理100ml/袋的样品，取9袋样 品一次分配到一组三联滤器，“检验数量”大于药典 规定的6个，但“检验量”似乎不符合药典规定的每 袋样品取半量检验的规定，仅为1/3，但根据药典 “检验量”即为“一次实验所用供试品的总量（g或 ml）”的解释，这与先将6袋分配两个滤筒、再将剩 下3袋抽入一个滤筒作为阳性对照的方法一样，却更 节省时间。
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无菌检查样品
三点体会： 一是附录规定检验量的表格中不包括阳性对 照用样品量，虽然附录另处有专门说明，仍然 容易忽略；
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无菌检查样品
三点体会： 二是无菌检查时应强调“检验数量”，主要 是保证实验结果的代表性，而阳性对照实验和 验证实验仅须满足“检验量”总量要求即可， 以检验样品对实验结果的影响，即保证实验结 果的可靠性，验证实验可以由此减少大量的样 品；
[CMCC（B）44 102]
铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 黑曲霉
Candida albicans
Aspergillus niger
[CMCC（F）98 001]
[CMCC（F）98 003]
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菌种和实验用菌液
• 验证用菌种的保藏 使用频繁 传代限制（5代）
每支样品接入每管培 最少检验数量 养基的最小样品量 （瓶或支）
全量 半量 150mg 500mg 取100mg或1cm×3cm 整个材料*3 20*1 10 10 10*2 10 20*1 10 20*1
整个器具*3（切碎 或拆散开）
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表3注释
• *1 ：每种培养基各接种10支供试品。 • *2 ：抗生素粉针剂(≥5g)及抗生素原料药(≥5g)的 最少检验数量为6瓶(或支)，桶装固体原料的检验数 量为4个包装。 • *3 ：如果医用器械体积过大，培养基用量可在 2000ml以上，将其完全浸没。
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菌种和实验用菌液
枯草芽孢杆菌
金黄色葡萄球菌
生孢梭菌
Bacillus subtilis
[CMCC（B）63 501]
Staphylococcus aureus [CMCC（B）26 003] Clostridium sporogenes [CMCC（B）64 941] Pseudomonas aeruginosa [CMCC（B）10 104] Escherichia coli
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表6 同厂不同批黄连上清丸稀释法的回收率比较实验结果（1：200） Tab 2 recoverice of dilute method in microbiological test of huanglianshangqingwan from different batchs in same corporation (1:200)
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无菌检查样品
剂型 无 菌 检 查 样 品 样品特性 （质） 前处理方法 敏感菌选择 去除抗菌活 性方法选择
抗菌活性
取样量 （量）
检验数量
侧重无菌检查
检验量
侧重验证实验
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无菌检查样品
• 主要是取样量的问题 • 《中国药典》2005年版对无菌检查的 “检验数量”和“检验量”作了明确的 解释和规定。
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2、方法验证实验的一般原则和程序
• 验证什么？ • 怎么验证？
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验证什么？
What？
• 微生物检验： 某种样品采用某种方法得到一个检查结果。
①供试品影响
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②方法的有效性
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验证什么？
表8
选 择 敏 感 菌 株
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消渴丸
鼻渊丸 陀螺银屑胶囊 冠心丹参胶囊 龟龄集 肚痛健胃整肠丸 冠心丹参胶囊 糖尿乐胶囊 降糖宁胶囊 温胃舒胶囊
北京北卫药业有限公司
武汉中联药业集团公司 烟台中洲制药厂 内蒙古自治区包头制药厂 山西广誉远园药业有限公司 香港康恩堂制药厂 长春海王生物制药有限公司 哈尔滨中药六厂有限公司 通化茂祥制药有限公司 江苏聚荣制药有限公司
每支样品接入每管培 养基的最少样品量
全量 半量 2ml 5ml 10ml 半量 半量 500ml
最少检验数量 (瓶或支)
20* 10 10 10 10 10 6 6
表3中上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量
供试品装量M /支、瓶或个
M<50mg 50mg≤M<300mg 300mg≤M<5g M≥5g 外科用敷料棉花及纱布 缝合线、一次性医用材料 带导管的一次性医疗器具 （如输液袋） 其它医疗器具
100 中国药品生物制品检定所 <70
二、方法验证实验的几个要点
• 1、无菌检查法验证实验要点 • 2、微生物限度检查法验证实验要点 • 3、验证实验实例
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1、无菌检查法验证实验要点
• • • • 样品 菌种和实验用菌液 标准化操作 实验器材
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需前处理 样品
What？
①验证前处理方法对污染菌生长、检出的影响。
有抑菌作用
去除抑菌作用
③验证抑菌活性去除的有 效性，以及去除方法对污 染菌生长、检出的影响。
不需前处理
②可以通过验 证实验判断
无抑菌作用
检查
图1 药品微生物检查方法验证的一般程序与环节
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验证什么？ ——需要验证的重点环节
去除抗菌活性
稀释法 薄膜法 中和法 离心法
验证
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供试品中抗菌活性的去除
• 稀释法——降低供试品的相对浓度 • 薄膜法——利用体积差异分离 • 中和法——利用化学（生物）专属性灭 活 • 离心法——利用沉降系数差异分离
各方法组合运用，效果更佳！
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方法疑问实例——菌在何处？
• 离心集菌法：500r/min离心5min × × × r/min = × × × g？
表7 10ml菌悬液500r/min离心5min离心后离心管不同部位菌悬液的计数结果（cfu/mL）
金葡10-6 不离心菌悬液计数 离心管上部菌悬液计数 离心管中部菌悬液计数 离心管下部菌悬液计数 39 25 27 30 大肠10-6 23 23 20 21 铜绿10-6 47 62 40 49 枯草10-5 13 18 15 12 白念10-5 93 黑曲霉10-4 100
大肠 100 87 88 100 93 100 35 73 100
金葡 45 95 14 59 64 <70 52 22 7
枯草 46 41 15 100 41 <70 <70 47 61
白念 100 100 100 100 100 100 100 100 100
黑曲 95 91 92 100 100 100 81 86 92