如何确定ELISA试剂盒检测样本的稀释倍数？

如何确定ELISA试剂盒检测样本的稀释倍数？
酶联免疫吸附实验（ELISA，enzyme linked immunosorbent assay）是基于抗原抗体的特异性结合反应进行的免疫学实验之一。

试剂盒检测原理为将抗体（或抗原）包被于固相载体上，随后加入待测样本，样本中的待检抗原（或抗体）可与固相载体上的抗体（或抗原）相结合，再加入酶标记的抗体（或抗原），通过加入与酶反应的底物后显色，根据颜色的深浅可以判断样本中物质的含量，进行定性或定量分析。

ELISA 实验是经典的免疫学实验之一，要想得到理想的实验数据，需要操作者具备良好的操作技巧和严谨的实验设计。

在ELISA实验过程中，我们可能会遇到这样的问题：样本测定OD值超过标曲最高点OD值或者低于最低点的OD值，造成测定数据无法直接使用。

如何确定测定样本的稀释倍数？小编根据多年的实验经验总结出以下4种途径：1、通过文献预测该指标的含量
根据想要测定的指标及物种信息，查询相关研究文献是了解该指标在不同样本及不同处理条件下表达量的重要方法之一。

因为有相关的文献数据结果支持，前期我们也可以根据所查询的研究方法，对实验进行更合理的设计，例如，利用已知的刺激条件设定阳性对照，为后期正式测定提供更为丰富的样品，从而，起到检验试剂盒质量或避免出现样品测不出结果的现象。

当然，不同的实验条件，对结果都会有不一样的影响。

所以，文献数据结果对于实验仅起参考作用。

图1. 不同处理引起小鼠血清中干扰素水平变化图
注：图片引自：A vaccine-based nanosystem for initiating innate immunity and improving tumor immunotherapy. Nature Communications. （IF=11.878）；使用产品：Mouse IFN-α Elisa Kit，货号：SEKM-0149
图2. 不同京尼平苷处理引起HepG2细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6水平变化图
注：图片引自：Geniposide alleviates non‐alcohol fatty liver disease via regulating Nrf2/AMPK/mTOR signalling pathways. Journal of Cellular and Molecular Medicine.（IF=4.658）；使用产品：Mouse TNF-α ELISA KIT，货号：SEKM-0034；Mouse IL-1β ELISA KIT，货号：SEKM-0002；Mouse IL-6 ELISA KIT，货号：SEKM-0007
2、通过相关医学检测网站预测该指标的含量
通过第三方生物信息数据库进行查询，这里给大家推荐梅奥医学中心（mayo clinic laboratories，https:///index.html）。

梅奥医学中心是美国最大的非营利性综合医疗机构。

研究人员根据大量的临床检测结果，会定期在该网站更新正常人群各种指标的检测结果（包括免疫指标、生化指标、分子检测结果等），并且可以下载相关结果。

例如：人生长激素（HGH），梅奥医学中心数据库查询结果为：正常男性为
10-970 pg/mL，正常女性为10-3610 pg/mL。

Solarbio产品Human Growth Hormone ELISA KIT（货号：SEKH-0196）检测范围为31.2-2,000 pg/mL。

因此，绝大多数人
生长激素（HGH）检测样本测定值都在试剂盒范围内，选择该试剂盒进行测定正常
样本时可以不用进行稀释或进行2倍稀释，但如果是测定病人血清还需通过预实验
确定样品稀释倍数。

图3. 梅奥医学中心数据库官网图
图4. 人生长激素（HGH）查询图片
图5. 人生长激素（HGH）查询结果
例如：人白细胞介素2(IL-2)，在正常机体/细胞中，炎性因子表达水平是极低的，只在某些因素刺激下表达会大幅增长。

梅奥医学中心检测范围为：正常血清含量≤2.1pg/mL。

Solarbio产品Human IL-2 ELISA KIT（货号：SEKH-0008）检测范围为31.2-2000 pg/mL。

所以，选择该试剂盒进行测定，样本是测不出数据的。

但是，Solarbio
高敏ELISA试剂盒产品，Human IL-2 ELISA KIT（SEKH-0008(HS)），检测范围为0.625-40 pg/mL。

所以，选择该高灵敏试剂盒进行测定正常样本是可以测定出来的，对于经过处理后的样本则要通过预实验进行评估选择试剂盒的类型。

图6. 人白细胞介素2（IL-2）查询结果
3、通过预实验确定样本的稀释倍数
每个实验都有其创新点和独特性，不同的实验处理条件，样本收集时间点，个体的差异性等因素都可能影响样品中要分析物质的浓度水平，前两种方法都是仅供我们参考的方法，最为准确的方法是在开始正式的实验之前进行预实验，以确定所采用的稀释倍数，建议大家选择不同处理组别的随机样品进行梯度稀释，如2倍或10倍梯度稀释。

根据预实验的结果再进行正式实验。

4、合理设计实验
如何对样本中待测物质浓度水平进行预测，相信大家都有自己的一些体会，在我们的实验过程中该如何对实验进行设计呢？小编提出自己的一些建议：
4.1 实验设置对照组。

包括空白组，阳性对照组，这里提到的阳性对照组是指使用确定的刺激物处理的样本，如IL-6的检测可使用植物血球凝集素（PHA，货号：P8090）刺激细胞后收集上清。

4.2 样本保存。

样本的保存对实验结果的准确性有很大影响，有时测定不出结果很可能是样本中待测物质发生了降解。

样本应避免反复冻融，可以根据需要量在开始冻存前对样本进行分装；样本还应避免污染、溶血等问题。

4.3 预实验的进行。

此处所指预实验一是指ELISA预实验，即选择不同组别的样本进行梯度稀释确定合适的样本检测稀释倍数；二是指前期实验条件摸索时，因为不同的物质在体内的半衰期是不一样的，可进行多个浓度，多个时间点的采样。

科普知识：灵敏度（sensitivity）与检测范围（detection range）的区别灵敏度是用测定数个空白对照的平均值加上3倍标准差推算出的数值，检测范
围是通过标准曲线确定的范围值；样本OD值在标准曲线范围内计算得到的浓度是
准确的，越是位于标准曲线范围的中间区域准确度越高；样品的OD值低于最低检
测范围但高于灵敏度计算得到的数值是大致浓度，可以表明样本是阳性的，可判断
含有该种物质但含量较少。

如SEKH-0196Human Growth Hormone ELISA KIT，灵
敏度为15 pg/mL,检测范围为31.2-2,000 pg/mL。

参考文献
[1].Di-Wei Zheng, Fan Gao, Qian Cheng, Peng Bao, Xue Dong, Jinxuan Fan, Wen Song, Xuan Zeng, Si-Xue Cheng, Xian-Zheng Zhang. A vaccine-based nanosystem for initiating innate immunity and improving tumor immunotherapy. Nature Communications. 2020.
DOI: 10.1038/s41467-020-15927-0
[2].Bingyu Shen, Haihua Feng, Jiaqi Cheng, Zheng Li, Meiyu Jin, Lilei Zhao, Qi Wang, Haiyan Qin, Guowen Liu. Geniposide alleviates non‐alcohol fatty liver disease via regulating Nrf2/AMPK/mTOR signalling pathways. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2020. DOI:10.1111/jcmm.15139。