DNA甲基化

重亚硫酸盐处理程序

一细胞处理

1 用PBS或者M2培养液将细胞洗干净，移入PCR管中，尽量少的带培养液（低于2ul），（此处可-20度保存），加入1.5ul LPK，离心。37度30-60分钟。（此处可-20度保存）。

2 加3ul RNase free水，计量总体积（约6ul），加入3M的NaOH（6ul样—0.66ul NaOH），搅动混匀使其终浓度为0.3M，总体积不超过10ul，37度Incubator孵育15min。，

3 2%的低熔点琼脂糖（用三蒸水提前配好），使用时在PCR仪上75度融化，在每个样中加入15ul后搅拌混匀，放回PCR仪，待12个样加完后依次全部吸出（约21ul）迅速放入加好mineral oil的2ml EP管中（mineral oil至少提前2 h 在4度预冷，或者至少在-20度预冷半小时），（加入琼脂糖后总体积最好不超过20ul），在移入EP管时不要产生气泡，然后将混合物在4度放置1-1.5 h（至少15min）。

二盐处理

将50度水浴锅打开，锡箔纸和冰备好。

1称取3.8g 亚硫酸氢钠sodium bisulfite（sigma）+4ml三蒸水（5M），称取0.11g 对苯二酚hydroquinonel 溶于1ml水中，然后后者混于前者，混匀，加入3M NaOH 1-1.2ml（经验值），将pH值调到5.0，然后50度水浴10min。（此剂量够12个左右的管子，每个管子2个珠子）

2 将珠子转移至一个新的2mlEP管，每管装2个珠子，加入500ul配好的亚硫酸盐溶液，然后加入100ul mineral oil（盖住液面即可，防盐挥发），用锡纸包好，冰浴15-30min。

3 冰浴后50度水浴4-16h，具体时间随实际情况而变。（以上操作必须避光）

三平衡及处理

1 将盐处理后的珠子转移到新管里，加入1ml TE，室温放置15min，重复洗三次。

(2 用0.3M NaOH 500ul洗两次，每次15min。

3 用1ml TE 再洗两遍，每次15min。