MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项

MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项
MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项
一、MTT原理
MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-2)-3,5-diphenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490 nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，须被溶解后才能检测。

这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

二、MTT溶液的配制方法
通常，此法中的MTT浓度为5 mg/mL。

因此，可以称取MTT 0.5 g，溶于100 mL的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22 μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT吸光度最好在0-0.7范围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5 mg/mL保存在-20oC长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

我一般都把MTT
粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往细胞培养板中加，没必要一下子配置那么多液体，尤其当MTT 变为灰绿色时就绝对不能再用了。

MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好使用透明的一次性乳胶手套.配成的MTT需要无菌环境，MTT对微生物很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.
配制MTT时用PBS（pH=7.4）溶解。

PBS配方：Nacl 8 g ＋Kcl 0.2 g ＋Na2HPO4 1.44 g ＋KH2PO4 0.24 g调pH为7.4,定容1.0 L。

三、普通MTT法实验步骤：
1：接种细胞。

用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200 uL。

2：培养细胞。

同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3：呈色。

培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5 mg/mL用PBS 配制，pH=7.4) 20 uL.继续孵育4 h，终止培养，小心移除孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。

每孔加150 uL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。

4：比色。

选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

四、药物MTT法实验步骤：
A：贴壁细胞：
1：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 uL,铺板使待测细胞调密度1000-10000孔（边缘孔用无菌PBS填充）。

2：5% CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。

一般5-7个梯度,每孔100 uL,设3-5个复孔。

建议设5个，否则难以反应真实情况。

3：5% CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

4：每孔加入20 uL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5% MTT），继续培养4 h。

若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5：终止培养，小心吸去孔内培养液。

6：每孔加入150 uL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测仪OD=490 nm处测量各孔的吸光值。

7：同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。

B：悬浮细胞：
1：收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40 uL；②加Actinomycin D（有毒性）10 uL用培养液稀释(储存液100 mg/mL，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10uL；④细胞悬液50uL（即5×104cell/孔），共100 uL加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。

每板设对照（加100 mL 1640培养基）。

2：置37℃，5% CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

3：每孔加入10 uL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5% MTT），继续培养4 h。

（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD=570 nm（630 nm校准）测量各孔的吸光值）。

4：离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 uL 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测仪OD=570 nm （630 nm校准）测量各孔的吸光值。

5：同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。

五、注意事项：
(1)选择适当得细胞接种浓度。

(2)避免血清干扰。

一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。

在
呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

(3)设空白对照。

与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。

其他试
验步骤保持一致，最后比色以空白调零。

(4)MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关
系。

(5)用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多
少MTT和DMSO合适根据书上说的加200 uL 1640培养基，20 uL MTT，150 uL DMSO加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定。

(6)一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/mL，MTT加20 uL，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150 uL DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。