沙门菌检验技术和方法

沙门菌的增菌液
四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)：含有胆盐，抑 制革兰氏阳性球菌和部分大肠埃希氏菌的生 长，而伤寒与付伤寒沙门菌仍能生长。
亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）：可对伤寒及 其他沙门菌作选择性增菌，亚硒酸与蛋白胨 中的含硫氨基酸结合，形成亚硒酸和硫的复 合物，影响细菌硫代谢，从而抑制大肠埃希 氏菌、肠球菌和变形杆菌的增殖。
➢ 现修改为：在接种TSI琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培 养基的同时增加一项营养琼脂（NA），经TSI琼 脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的选择后，可筛掉 大部分非沙门氏菌株，大大减少了工作量，同时 也满足了API 20E或 Vitek GNI鉴定的需要。
➢ 为保持与原标准的一致性，新标准也保留 了可以同时直接接种蛋白胨水 (供做靛基质 试验)、尿素琼脂 (pH7.2)、KCN 培养基的 内容。本部分还增加了对疑似菌落进行留 样确认的部分，以备必要时复查，这对生 化鉴定不确定的菌落进行进一步验证是非 常必要的。
沙门菌的菌落形态：产H2S的菌落为黑色 有金属光泽、棕褐色或灰色。菌落周围培 养基可呈黑色或棕色，有些不产H2S的菌 落，形成灰绿的菌落，周围培养基不变。
注：此培养基在制作过程中过分加热可使培 养基的选择性降低，与TTB或SC合用可获 得更高的检出率。
沙门菌的分离培养基
HE琼脂：在保证细菌所需营养的基础上，加 入了一些抑制剂，如：胆盐、柠檬酸盐、去 氧胆酸钠等，可抑制某些肠道致病菌和革兰 氏阳性菌的生长，但对革兰氏阴性的肠道致 病菌则无抑制作用。
样品液增加调整pH值。 选择性增菌：使用“TTB、SC”，取消“MM”。
分离培养基：使用BS、XLD、HE、科 玛嘉显色培养基。取消DHL、SS。
生化鉴定： 1.采纳API 20E或Vitek GNI为传统生化鉴定方法 的选择性替代方法。 2.生化鉴定项目进行调整：
➢ 原国标中生化鉴定是将可疑菌落同时接种于三糖 铁（TSI）琼脂、蛋白胨水 (供做靛基质试验)、尿 素琼脂 (pH7.2)、氰化钾 (KCN) 培养基和赖氨酸 脱羧酶试验培养基；
沙门菌检验
沙门菌概况
沙门菌是1885年由Salmon氏等在猪霍乱流行 时，分离出的猪霍乱沙门菌，由于Salmon氏 对本属细菌的发现贡献卓越，故定名为沙门 菌属。
沙门菌属是肠杆菌科中最重要的病原菌。它 是一群抗原结构、生化特性相似的革兰氏阴 性杆菌。血清型繁多，目前已发现的沙氏菌 有2500多个血清型和变种。我国自1911年至 90年代初已有255个血清型。
沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧 酶试验培养基内的反应结果
三糖铁琼脂
斜面
底层
产气
硫化氢
赖氨酸脱羧酶试验培养基
初步判断
-
+
＋（－）
＋（－）
＋
可疑沙门氏菌属
-
+
＋（－）
＋（－）
－
可疑沙门氏菌属
+
+
＋（－）
＋（－）
＋
可疑沙门氏菌属
+
+
＋/－
＋/－
－
非沙门氏菌
注：＋阳性，－阴性；＋（－）多数阳性, 少数阴性；＋/－阳性或阴性。
沙门菌在HE琼脂上的菌落形态：蓝绿色或 蓝色，多数菌株产H2S，中心呈黑色或几 乎全黑色。
沙门菌的分离培养基
XLD琼脂：培养基中含有去氧胆酸钠作指示 剂，在该浓度下的去氧胆酸钠也同时作为大 肠埃希氏菌的抑制剂 ，而不影响沙门菌属和 志贺菌属的生长。
XLD培养基分离沙门菌和志贺菌的敏感性超 过了传统的培养基，如：EMB、SS、BS。因 这些培养基尚有抑制志贺菌属生长的潜在因 素，故本培养基是分离鉴定沙门菌及志贺菌 属的可靠培养基。在国外广泛使用。
选择性 琼脂平 板
BS琼脂
沙门氏菌
菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色, 菌落周围培养基可呈黑色或棕 色；有些菌株形成灰绿色的菌落, 周围培养基不变
HE琼脂 蓝绿色或蓝色, 多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色, 中 心黑色或几乎全黑色；
XLD琼 脂
菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑 色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑 色中心
不分解乳糖，大部分菌株产H2S，发酵葡萄 糖产酸不产气。
最适培养温度为37℃，最适pH 7.2～7.6。
耐受胆盐，在粪便、土壤、食品、水中可 生存5个月至二年之久。
沙门菌的分布
沙门菌广泛存在于自然环境中。 通过沙门菌病患者或健康带菌的人和动物
的排泄物污染环境和食品。 易于污染的高危食物：畜禽肉类、蛋、奶
生化鉴定：生化管、 API 20 E生化鉴定试剂 盒、VITEK GNI＋生化 鉴定卡
沙门菌的检验程序
检样
前增菌法
25g样品＋BPW225mL
36±1℃
8~18h
1mL检样＋TTB10mL
42±1℃，18~24h 36±1℃ BS
40~48h
1mL检样＋SC10mL 36±1℃，18~24h
36±1℃ XLD(或HE、显色培养基) 18~24h
非如左述的各种反 应结果
ONPG＋
血清学鉴定
报告
非沙门菌
前增菌
称取25 g（mL）样品放入盛有225 mL BPW 的无菌均质杯中，以8 000 r/min～10 000 r/min均质1 min～2 min，或置于盛有225 mL BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍 打1 min～2 min。若样品为液态，不需要均 质，振荡混匀。无菌操作将样品转至500 mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行 培养，于36 ℃±1 ℃培养8 h～18h。
虽然沙门菌的血清型很多，但多数国家从人 体、动物和食品中分离出沙门菌仅约40~50 个血清型。而在一个国家中的一定时期只约 有10个血清型是比较常见的。
分类：
伤寒沙门菌(伤寒、副伤寒)-传染病防治法中 规定报告的乙类传染病。
非伤寒沙门菌-食品卫生标准的检测的主要 对象。
沙门菌的生物学特性
形态与染色性： 革兰氏阴性杆菌，无芽胞,一般无荚膜。 除鸡瘟沙门菌（S.pullorum)和鸡沙门菌
科玛嘉 显色培 养基
菌落为紫红色
接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养 基的同时，可直接接种蛋白胨水 (供做靛基 质试验)、尿素琼脂 (pH7.2)、氰化钾 (KCN) 培养基，也可在初步判断结果后从营养琼 脂平板上挑取可疑菌落接种。于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h, 必要时可延长至48 h。
赖氨酸脱 羧酶 ＋
＋
＋/－
反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸 脱羧酶3项中有1项异常, 按下表可判定为沙门氏菌。 如有2项异常为 非沙门氏菌。
沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
pH7.2 尿素
－
氰化钾 (KCN)
－
赖氨酸脱羧 酶
－
－
＋
＋
＋
－
＋
注：＋表示阳性；＋表示阴性。
判定结果
分别用接种环取增菌液1环, 划线接种于一 个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE 琼脂平板或显色培养基平板）。于36 ℃±1 ℃分别培养18 h～24 h (XLD琼脂平板、HE 琼脂平板、显色培养基平板) 或40 h～48 h (BS琼脂平板)，观察各个平板上生长的菌落。
沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的 菌落特征
甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清 学鉴定结果) 沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符合本群 生化特性) 沙门氏菌个别变体(要求血清学 鉴定结果)
反应序号2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门菌靛基质阳性变体两项结 果均为阳性；
反应序号3：补做ONPG，ONPG阴性，同时赖氨酸脱羧酶阳性为沙门菌； 但甲型副伤寒沙门菌赖氨酸脱羧酶为阴性。
沙门菌的分离培养基
亚硫酸铋琼脂（BS）：含有煌绿、亚硫酸铋 能抑制大肠杆菌、变形杆菌和革兰氏阳性菌的 生长，但对伤寒、副伤寒等沙门菌的生长无影 响。伤寒杆菌及其他沙门菌能利用葡萄糖将亚 硫酸铋还原成硫酸铋，形成黑色菌落周围绕有 黑色和棕色的环，对光观察可见有金属光泽。 该培养基制备过程不宜过分加热，以免降低其 选择性，应在临用时配制，超过48h不宜使用。
沙门菌辛酸脂酶
色原-特定结合物
色原＋特定结合物
无色
该表显示：只有在三糖铁斜面产酸、底层产酸；同时赖氨酸阴性的菌株可排 除。其他反应结果均有沙门菌属的可能，同时也均有不是沙门菌的可能。
沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
反应 序号
A1
硫化氢 （H2S）
＋
靛基 质
－
pH7.2尿 素
－
氰化钾 （KCN）
－
A2
＋
＋
－
－
A3
－
－
－
－
注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。
血清学鉴定中的菌体分群改为选择性试验 项目。
报告：综合以上生化试验和血清学鉴定的 结果,报告25g样品中检出或未检出沙门菌。
培养基的改变
旧标准
前增菌：BPW
增菌：MM(或TTB)、 SC
分离培养：BS、 DHL(或HE、WS、 SS)
生化鉴定：生化管
新标准
前增菌：BPW
增菌：TTB、SC
分离培养：BS、XLD、 显色培养基
及其制品。 沙门菌在肉类中不分解蛋白质，不产生靛
基质，所以当食品污染了沙门菌后，通常 没有感官性状的改变。
修订内容
前增菌:取消样品分类，前增菌液统一为“缓 冲蛋白胨水”。
对所有样品均进行8~18h前增菌。原标准只对 冻肉、蛋品、乳品等加工食品进行前增菌。
修改了样品的处理方式：增加拍击式均质器， 均质袋可直接培养。
(S.gallinarum)外均有动力。为周身鞭毛，并多 数有菌毛。 大小：1~3um×0.5~1um。
培养与生化特性
营养需求不高，需氧或兼性厌氧。普通营养 培养基上均能生长，能够利用柠檬酸盐作为 碳源。
在普通肠道选择性平板上基本上形成无色菌 落。菌落中等大小，半透明，表面光滑，边 缘整齐或呈锯齿状。
分离培养中的注意要点
非典型的沙门氏菌菌落形态：不存在典型 的或可疑的沙门氏菌菌落时，按如下步骤 检验非典型的沙门氏菌菌落。
HE和XLD琼脂：非典型的沙门氏菌在HE和 XLD琼脂上呈黄色菌落，带或不带黑色中 心。HE和XLD平板经24±2小时培养后，没 有典型的沙门氏菌菌落，则挑取2个或更多 个非典型的沙门氏菌菌落。
挑取可疑菌落
沙门菌的检验程序
可疑菌落
TSI（斜面、底层、产气、H2S），蛋白胨水（靛基质）， 尿素（pH7.2)，KCN，赖氨酸、营养琼脂(NA)
定商 系品 统化
生 化 鉴
H2S＋， 靛基质－
尿素－， KCN－ 赖氨酸＋
H2S＋，靛基质＋ 尿素－，KCN－ 赖氨酸＋
甘露醇+，山梨醇+
H2S－，靛基质－ 尿素－，KCN－ 赖氨酸＋/－
沙门氏菌属各生化群的鉴别
必要时按此表进行沙门菌生化群鉴定
项目 Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅴ
Ⅵ
卫矛醇 ＋
＋
－－Leabharlann ＋－山梨醇 ＋
＋
＋
＋
＋
－
水杨苷 －
－
－
＋
－
－
ONPG －
－
＋
－
＋
－
丙二酸 －
＋
＋
－
－
－
盐
KCN
－
－
－
＋
＋
－
注：＋表示阳性; －表示阴性。
沙门菌的增菌培养基
缓冲蛋白胨水(BPW) 肉汤：是基础增菌培养 基，不含任何抑制成分，有利于受损伤的沙 门菌复苏。使受损伤的沙门菌细胞恢复到稳 定的生理状态。一般用于加工食品或冷冻食 品的前增菌。
将已挑菌落的平板储存于2 ℃～5 ℃或室温 至少保留24 h，以备必要时复查。
生化试验
自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型 或可疑菌落，分别接种三糖铁（TSI）琼脂、 赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板； 取菌落一部分于斜面划线和底层穿刺。
接种针在接种TSI后不要灭菌，直接接种赖 氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板， 于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h，必要时可延 长至48 h。
BS琼脂：某些非典型菌株产生绿色菌落， 其周围培养基稍微或不呈暗色。如果BS平 板培养24±2小时后，没有出现典型菌落， 则不挑取任何菌落，让平板继续培养24±2 小时。如果经48±2小时培养后，仍没有典 型或可疑的菌落出现，则挑取2个或更多个 非典型的菌落。
沙门菌显色培养基
沙门菌显色培养基主要用于快速筛选、分 离沙门菌。其基本原理：利用沙门菌特异 性酶与显色基团的特有反应，使色原游离 出来，沙门菌在培养基上呈紫色或紫红色。 而大肠杆菌等其他肠道杆菌呈蓝绿色。
如为冷冻产品,应在45 ℃以下不超过15 min, 或2 ℃～5 ℃不超过18 h解冻。
增菌与分离
轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL, 转种于10 mL TTB 内, 于42 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。同时, 另取1 mL, 转种于10 mL SC 内, 于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。