【精选】Trizol法提取细菌总RNA

实验三Trizol法提取细菌总RNA
一、实验原理
Trizol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，保护RNA的完整性。

加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。

RNA存在于水样层中。

收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。

无论是人、动物、植物还是细菌组织，Trizol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≧1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。

Trizol试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。

所有的操作可以在一小时内完成。

Trizol
抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。

二、主要试剂和器材
Trizol 溶液氯仿异丙醇 75%乙醇 0.1% DEPC水
超净工作台 2.0 mL离心管（无Rnase）移液枪紫外分光光度计
石英比色皿泳槽和模具电泳仪凝胶成像系统大肠杆菌
三、实验步骤
（一）. 采用 Trizol 溶液提取细菌的总 RNA
1. 挑取大肠杆菌菌单菌落，培养至稳定期，取菌液
2.0 mL 于2.0 mL离心管离心得菌体；
2、每管加入 1 mL Trizol 溶液，盖紧管盖，激烈振荡15 s，室温静置5 min 4℃，12000 g，离心 10 min；取上清转入(约 1 mL)新的 2.0 m L离心管中；
3、每管加入 0.2 mL 的氯仿(0.2 体积 Trizol)，盖紧盖，剧烈振荡 15 s；室温静置 3 min；4℃, 12000 g, 离心 10 min；小心吸取上层水相，转入另一新的 2.0mL 离心管，测量其体积；（加氯仿时应充分震荡使其充分乳化。

）
4、加入1倍体积的氯仿，盖紧盖，剧烈振荡 15 s；室温静置 3 min；4℃，12000 g，离心 10 min；小心吸取上层水相，转入另一已编号新的 2.0mL 离心管；
5、加入 0.5 mL 的异丙醇(0.5 体积 Trizol)，轻轻颠倒混匀；室温，静置 10 min；4℃，12000 g，离心 10 min，RNA 沉于管底；小心吸去上清；
6、加1 mL75%的乙醇(预冷)，并轻柔颠倒，洗涤沉淀；4℃，7500 g，离心 5 min；小心弃上清，微离，吸去剩余乙醇，室温干躁 10 min；
7、各管用 30μL DEPC 处理过的双蒸去离子水溶解，55-60℃温育5 min，分装，-80℃贮存(可贮存5周)；
（二）. RNA 浓度的测定
取10 µL RNA 样品以双蒸水稀释至 2 mL，转入预先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干的石英比色皿中，小心排除气泡，以等体积的双蒸水作为空白对照，在紫外分光光度计中分别测定 260 nm、280 nm的光吸收值，根据公式计算 RNA 的浓度。

RNA 浓度(µg/µL)= OD260 × 稀释倍数(200)× 40(µg/mL)/1000
纯 RNA 样品的 OD260/OD280 比值为 1.8~2.0，若低于该值，表明存在蛋白质污染，可重新用酚∕氯仿抽提。

该值为 2.0 时，RNA 纯度为最高。

（三）. RNA 质量检测
将 RNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测，目的在于检测 23 S 和 16S 条带的完整性和它们的比值。

一般认为，如果 23 S和16 S 条带明亮、边缘清晰，并且23 S的亮度在 16 S 条带的两倍以上，则 RNA的质量较好。

(1) 将洗净、干燥的电泳槽和模具，水平放置在工作台上；
(2) 准确称取 0.15 g琼脂糖加入15 mL 1 × TAE 中，摇匀，在微波炉内将琼脂糖溶液以最短时间完全溶解(中火档 2 min)，待冷却至60℃时，加入 EB(终浓度为µL/mL)，充分混匀；
(3) 插入适当的梳子，将温热的凝胶倒入胶模中，凝胶厚度为 3~5 mm，置于室温下凝固；
(4) 待凝胶凝固后，小心移去梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶 1~2 mm；
(5) 用微量移液器将样品8µL与上样缓冲液2µL混合并将混合液小心加入上样孔内，同时加入合适分子量范围的 DNA 分子量标准作为对照（2000bp）；
(6) 盖上电泳槽盖，调节电压 100 V，电泳 15min 左右；
(7) 电泳完毕后将凝胶置于紫外透射检测仪上观察结果，用凝胶成像系统照相保存。

四、注意事项
1. RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA 分解酶的污染。

EP管及Tip头都要用0.1%处理(0.1% DEPC浸泡过夜后，高压蒸
气灭菌)。

用于RNA实验的试剂，须使用DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装，使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。

最好在超净台内操作。

2、提取时操作带一次性手套、口罩等，小心、细致、晃动及每次移液要轻；在操作过程中避免讲话等。

这样做的唯一目的就是两个，一是小心RNAse的污染降解RNA；二是动作过度暴力破坏RNA的完整性。

3、电泳液需新鲜配制。

电泳槽和模具需预先进行处理。

4. 一般RNA电泳应该是做甲醛变性电泳，但是一般的琼脂糖电泳也可以，需要上样量稍微大些，并且跑电泳的时间越短越好(这样也是为了减少外界RNAse对RNA的降解)，跑完电泳立刻观察。

5、需要用EB染色，Genefinder染色效果不好，其对双链DNA的效果好。

6、器材的处理：尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。

（1）用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。

（2）然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。

RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。

测量学试卷 第 4 页（共 7 页）
《测量学》模拟试卷
1．经纬仪测量水平角时，正倒镜瞄准同一方向所读的水平方向值理论上应相差（A ）。

A 180° B 0° C 90° D 270°
2. 1：5000地形图的比例尺精度是（ D ）。

A 5 m B 0.1 mm C 5 cm D 50 cm
3. 以下不属于基本测量工作范畴的一项是（ C ）。

A 高差测量
B 距离测量
C 导线测量
D 角度测量
4. 已知某直线的坐标方位角为220°，则其象限角为（D ）。

A 220°
B 40°
C 南西50°
D 南西40°
5. 由一条线段的边长、方位角和一点坐标计算另一点坐标的计算称为（A ）。

A 坐标正算 B 坐标反算 C 导线计算 D 水准计算
6. 闭合导线在X 轴上的坐标增量闭合差（ A ）。

A 为一不等于0的常数
B 与导线形状有关
C 总为0
D 由路线中两点确定
7. 在地形图中，表示测量控制点的符号属于（D ）。

A 比例符号
B 半依比例符号
C 地貌符号
D 非比例符号
8. 在未知点上设站对三个已知点进行测角交会的方法称为（A ）。

A 后方交会 B 前方交会 C 侧方交会 D 无法确定
9. 两井定向中不需要进行的一项工作是（C ）。

A 投点
B 地面连接
C 测量井筒中钢丝长度
D 井下连接
10. 绝对高程是地面点到（ C ）的铅垂距离。

A 坐标原点
B 任意水准面
C 大地水准面
D 赤道面
11．下列关于等高线的叙述是错误的是：（A ） A ． 高程相等的点在同一等高线上
B ． 等高线必定是闭合曲线，即使本幅图没闭合，则在相邻的图幅闭合
C ． 等高线不能分叉、相交或合并
一、单项选择题（每小题1 分，共20 分）
在下列每小题的四个备选答案中选出一个正确的答案，并将其字母标号填入题干的括号内。

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D ． 等高线经过山脊与山脊线正交
12．下面关于非比例符号中定位点位置的叙述错误的是（B ） A ．几何图形符号，定位点在符号图形中心 B ．符号图形中有一个点，则该点即为定位点 C ．宽底符号，符号定位点在符号底部中心
D ．底部为直角形符号，其符号定位点位于最右边顶点处
13．下面关于控制网的叙述错误的是（D ） A ． 国家控制网从高级到低级布设
B ． 国家控制网按精度可分为A 、B 、
C 、
D 、
E 五等 C ． 国家控制网分为平面控制网和高程控制网
D ． 直接为测图目的建立的控制网，称为图根控制网
14．下图为某地形图的一部分，各等高线高程如图所视，A 点位于线段MN 上，点A 到点M 和点N 的图上水平距离为MA=3mm ，NA=2mm ，则A 点高程为（A ）
A ． 36.4m
B ． 36.6m
C ． 37.4m
D ． 37.6m
15．如图所示支导线，AB 边的坐标方位角为''30'30125 =AB α，转折角如图，则CD 边的坐标方位角CD α为（ B ）
A ．''30'3075
B ．''30'3015
C ．''30'3045
D ．''30'2925
16．三角高程测量要求对向观测垂直角，计算往返高差，主要目的是（D ） A ． 有效地抵偿或消除球差和气差的影响
B ． 有效地抵偿或消除仪器高和觇标高测量误差的影响
C ． 有效地抵偿或消除垂直角读数误差的影响
D ．有效地抵偿或消除读盘分划误差的影响
17．下面测量读数的做法正确的是（ C ） A ． 用经纬仪测水平角，用横丝照准目标读数
A N M
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36
35
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B ． 用水准仪测高差，用竖丝切准水准尺读数
C ． 水准测量时，每次读数前都要使水准管气泡居中
D ． 经纬仪测竖直角时，尽量照准目标的底部
18．水准测量时对一端水准尺进行测量的正确操作步骤是（ D ）。

A 对中----整平-----瞄准----读数 A 整平----瞄准----读数----精平 C 粗平----精平----瞄准----读数 D 粗平----瞄准----精平----读数
19．矿井平面联系测量的主要任务是（ D ）
A 实现井上下平面坐标系统的统一
B 实现井上下高程的统一
C 作为井下基本平面控制
D 提高井下导线测量的精度
20． 井口水准基点一般位于（ A ）。

A 地面工业广场井筒附近
B 井下井筒附近
C 地面任意位置的水准点
D 井下任意位置的水准点
21水准测量中，为了进行测站检核，在一个测站要测量两个高差值进行比较，通常采用的测量检核方法是双面尺法和 。

22直线定向常用的标准方向有真子午线方向、_____磁北方向____________和坐标纵线方向。

23地形图符号一般分为比例符号、_半依比例符号_________________和不依比例符号。

24 井下巷道掘进过程中，为了保证巷道的方向和坡度，通常要进行中线和____________的标定工作。

25 测量误差按其对测量结果的影响性质，可分为系统误差和_偶然误差______________。

27 象限角的取值范围是： 0-90 。

28 经纬仪安置通常包括整平和 对中 。

29 为了便于计算和分析，对大地水准面采用一个规则的数学曲面进行表示，这个数学曲面称为 参考托球面 。

二、填空题（每空2分，共20分）
测量学试卷 第 7 页（共 7 页）
30 光电测距仪按照测量时间的方式可以分为相位式测距仪和 差分 。

竖盘分划误差
32．水准测量
利用水准仪测定两点间的高差
33．系统误差
由客观原因造成的具有统计规律性的误差
34．视准轴
仪器望远镜物镜和目镜中心的连线
35．简述测回法测量水平角时一个测站上的工作步骤和角度计算方法。

对中，整平，定向，测角。

观测角度值减去定向角度值
三、名词解释（每小题5分，共20分）
四、简答题（每小题5分，共20分）
36．什么叫比例尺精度？它在实际测量工作中有何意义？
图上0.1毫米在实地的距离。

可以影响地物取舍
37．简述用极坐标法在实地测设图纸上某点平面位置的要素计算和测设过程。

38．高斯投影具有哪些基本规律。

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测量学试卷 第 9 页（共 7 页）
39．在1：2000图幅坐标方格网上，量测出ab = 2.0cm, ac = 1.6cm, ad = 3.9cm, ae = 5.2cm 。

试计算AB 长度D AB 及其坐标方位角α
AB 。

40．从图上量得点M 的坐标X M =14.22m, Y M =86.71m ；点A 的坐标为X A =42.34m, Y A =85.00m 。

试计算M 、A 两点的水平距离和坐标方位角。

a
b d c
e B
A
1200
1400
1600
1800
五、计算题（每小题10分，共20分）
测量学标准答案与评分说明
一、一、单项选择题（每题1分）
1 A；
2 D；
3 C；
4 D；
5 A；
6 C；
7 D；
8 A；
9 C；10 C；
11 A；12 D；13 B；14 A；15 B；16 A；17 C；18 D；19 A；20 A
二、二、填空题（每空2分，共20分）
21 变更仪器高法
22 磁北方向
23 半依比例符号（或线状符号）
24．腰线
25．偶然误差
26．数字注记
27 大于等于0度且小于等于90度（或[0°, 90°]）
28 对中
29 旋转椭球体面
30 脉冲式测距仪
三、三、名词解释（每题5分，共20分）
31竖盘指标差：在垂直角测量中，当竖盘指标水准管气泡居中时，指标并不恰好指向其正确位置90度或270度，而是与正确位置相差一个小角度x, x即为竖盘指标差。

32 水准测量：利用一条水平视线并借助于水准尺，测量地面两点间的高差，进而由已知点
的高程推算出未知点的高程的测量工作。

33 系统误差：在相同的观测条件下，对某量进行了n次观测，如果误差出现的大小和符号
均相同或按一定的规律变化，这种误差称为系统误差。

34视准轴：望远镜物镜光心与十字丝中心（或交叉点）的连线。

四、四、简答题（每题5分，共20分）
35
（1）在测站点O上安置经纬仪，对中，整平（1分）
（2）盘左瞄准A点，读数L A，顺时针旋转照准部到B点，读数L B，计算上半测回角度O1=L B-L A；
（2分）
（3）旋转望远镜和照准部，变为盘右方向，瞄准B点读数R B，逆时针旋转到A点，读数R A，计算下半测回角度O2=R B-R A；
（3分）
（4）比较O1和O2的差，若超过限差则不符合要求，需要重新测量，若小于限差，则取平均值为最终测量结果O = （O1+O2）/2
（5分）
36
图上0.1mm对应的实地距离叫做比例尺精度。

（3分）
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其作用主要在于：一是根据地形图比例尺确定实地量测精度；二是根据地形图上需要表示地物地貌的详细程度，确定所选用地形图的比例尺。

（5分）
37
要素计算：从图纸上量算待测设点的坐标，然后结合已有控制点计算该点与控制点连线之间的方位角，进而确定与已知方向之间所夹的水平角，计算待测设点到设站控制点之间的水平距离。

（3分）测设过程：在设站控制点安置经纬仪，后视另一控制点，置度盘为0度，根据待定方向与该方向夹角确定方向线，根据距离确定点的位置。

（5分）
38
高斯投影的基本规律是：
（1）（1）中央子午线的投影为一直线，且投影之后的长度无变形；其余子午线的投影均为凹向中央子午线的曲线，且以中央子午线为对称轴，离对称轴越远，其长度变形也就越大；
（2）（2）赤道的投影为直线，其余纬线的投影为凸向赤道的曲线，并以赤道为对称轴；
（3）（3）经纬线投影后仍保持相互正交的关系，即投影后无角度变形；
（4）（4）中央子午线和赤道的投影相互垂直。

评分说明：答对一条得2分，答对三条即可得满分。

五、五、计算题（每题10分，共20分）
39
bd = ad – ab = 1.9cm，因此△X = -38m；
ce = ae – ac = 3.6cm, 因此△Y = -72m; （3分）(或由图根据比例尺和距离计算A、B两点的坐标)
因此距离为：81.413m （6分）AB的方位角为：242°10′33″（10分）（方位角计算应说明具体过程，过程对结果错扣2分）
40
△X = X A– X M = 28.12m, △Y = Y A– Y M = -1.71m (2分) 距离d = (△X2 + △Y2)1/2 = 28.17m （5分）
方位角为：356 °31′12″（应说明计算过程与主要公式）（10分）
可通过不同方法计算，如先计算象限角，再计算方位角。

说明：在距离与方位角计算中，算法公式对但结果错各1分
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