酪氨酸酶抑制剂及对黑素生物合成的影响

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(收稿日期:2002-09-23)
・综述・
酪氨酸酶抑制剂及对黑素生物合成的影响
闫军陈声利李春阳
摘要　酪氨酸酶是皮肤黑素生物合成的关键酶、限速酶,可以酪氨酸酶为靶点筛选增白美容的药物,用于治疗色素沉着性皮肤病。

综述了已用于临床的氢醌、熊果苷、曲酸、壬二酸等药物,以及近年来通过各种途径筛选得到的酪氨酸酶抑制剂及其脱色素的机制。

关键词一元酚单氧酶黑素类
酪氨酸酶(tyrosinase,Tyr)是一种含铜的金属酶,每一个亚基含两个金属铜离子,两个铜离子分别与蛋白质分子中的组氨酸结合,另有一个内源桥基将两个铜离子联系在一起,构成Tyr催化氧化反应活性中心。

酪氨酸等物质与酶形成过渡态络合物时,主要是羟基与酶的活性中心上的原子键合而发生作用。

Tyr是皮肤黑素生物合成的关键酶[1],它不仅决定黑素合成的速率,还是黑素细胞分化成熟的特征性标志[2]。

Tyr的活性与黑素合成量相关,控制其活力即可控制黑素生成量[3]。

抑制Tyr活性的药物可治疗黄褐斑等色素沉着性皮肤病。

一、化学合成的Tyr抑制剂
氢醌是皮肤科常用的和使用最久的脱色剂,其脱色机制仍不十分清楚。

有人认为氢醌与Tyr的底
作者单位:250001济南市皮肤病防治院(闫军、陈声利);山东大学齐鲁医院皮肤科(李春阳)物酪氨酸相似,从而竞争性抑制了Tyr活性,影响黑素的形成。

另一观点认为氢醌有Tyr介导的细胞毒作用,氢醌分子极易扩散到黑素细胞中的黑素小体内,由于氢醌的化学性质与黑素形成的前期物质酪氨酸相似,故它参与黑素合成代谢,阻断Tyr催化的酪氨酸到L-多巴的反应,从而阻断了黑素细胞合成的一个或多个步骤。

同时氢醌在Tyr作用下被氧化成有毒性的半醌基物质,使黑素细胞胞膜脂质发生氧化,导致细胞膜结构破坏,引起细胞死亡[426]。

抗高血压药物卡托普利(巯甲丙脯酸)、α2-肾上腺素能受体阻断药育亨宾(yohimbine)对黑素生物合成亦有影响,测试结果表明两种药物均可抑制Tyr的活性。

卡托普利是一个非竞争性的不可逆的Tyr抑制剂,蘑菇Tyr抑制试验证明卡托普利与酶上的铜离子不可逆结合,这可能是由于形成了卡托普利-铜复合物和卡托普利与酶的富含半胱氨酸位点形成立体交叉结合键。

卡托普利还可与酶促反应
的产物醌形成无色的不稳定的结合物,因此,阻止黑素生成[7]。

在育亨宾拮抗培养的人黑素细胞α2-肾上腺素能受体的试验中,发现育亨宾有显著下调Tyr活性的作用,黑素细胞与100mmol/L育亨宾接触12h,Tyr的活性降低30%,48h后仅存20%,抑制作用与剂量有关。

育亨宾导致的Tyr的活性降低是可逆的,48h后撤除药物,90%酶可恢复活性。

尽管育亨宾可显著抑制Tyr的活性,但对细胞的增殖、DNA的翻译或DNA的合成没有影响。

对孵化的黑素细胞碎片育亨宾不降低Tyr的活性,只对完整的细胞起作用。

另外,对Tyr的提取显示,在加入育亨宾的培养过程中Tyr的活性没有降低,表明药物不是直接抑制酶的活性。

免疫印迹试验结果显示育亨宾不能有效的降低黑素细胞中Tyr蛋白的数量,这些研究说明育亨宾是通过未被确认的信号途径降低黑素细胞中Tyr活性的[8]。

2,3,4,5-四羟基二苯乙烯对蘑菇Tyr有强抑制作用,比曲酸的作用强32倍,对蘑菇Tyr抑制的动力学和机理研究显示:以L-酪氨酸作为底物,2, 3,4,5-四羟基二苯乙烯是非竞争性的可逆性的抑制物。

K im等[9]阐明了2,3,4,5-四羟基二苯乙烯和它的类似物对蘑菇Tyr和鼠黑素瘤B-16中Tyr 的抑制作用。

2,3,4,5-四羟基二苯乙烯和Tyr有高亲和力,在10mmol/L和100mmol/L,2,3,4,5-四羟基二苯乙烯对鼠黑素瘤B-16中的Tyr基因的表达无影响。

因此,2,3,4,5-四羟基二苯乙烯的脱色作用是通过可逆性的抑制Tyr活性而不是抑制酶的表达和生成,羟基取代物的数量和位置似乎在羟化二苯乙烯抑制Tyr活性中起重要作用。

胱胺及其衍生物抑制黑素生物合成的研究发现,人黑素瘤细胞(MM418c5)和黑素细胞在含50mmol/L胱胺培养时不断的脱色素,胱胺从培养基中去除后是无毒和可逆的,半胱胺、二硫苏糖醇和苯硫脲作用较小,谷胱甘肽、半胱氨酸和胱氨酸是没有活性的,胱胺在接近生理浓度时对黑素合成路径有多种抑制作用[10]。

苯甲醛肟和苯甲醛-O-烃基肟对Tyr催化L -多巴氧化的评估试验表明,苯甲醛肟仅有微弱的抑制Tyr的作用,对位和间位有一个或两个羟基或甲氧基取代的衍生物可降低Tyr的活性,乙酰苯肟和三羟基取代的苯甲醛肟无抑制作用[11]。

苯甲酸在2510℃和810℃p H5160空气饱和的溶液中,对Tyr的α、β、γ同工酶有抑制作用。

是α、β同工酶的部分非竞争性抑制剂和γTyr的单纯的竞争性抑制剂。

在相同的动力学研究条件下,平衡透析实验表明:苯甲酸在缺乏有机反应物时结合α、γ同工酶。

平衡透析得到的离解常数与抑制实验决定的动力K i值符合良好。

苯甲酸与α、γTyr的最大结合摩尔比显著小于1∶1[12]。

二、植物来源的天然Tyr抑制剂
(一)糖苷类:1988年日本学者Akiu等从杜鹃花科植物熊果的叶中分离到一种具有脱色作用的单体物质—熊果苷,这是氢醌的一种天然存在形式,氢醌-β-D-葡萄糖苷的脱色作用可能与分子结构中存在的氢醌基团有关。

利用培养的人黑素细胞探讨了熊果苷的脱色机制,在没有达到细胞毒浓度时,熊果苷抑制Tyr的活性,不影响Tyr mRNA的表达,有效抑制了黑素的产生。

动力学和酶抑制机理研究证实熊果苷是一个可逆的竞争性酶抑制剂,分别用L-酪氨酸和L-多巴作为底物研究,发现了熊果苷竞争Tyr与L-酪氨酸结合的活性位点[13]。

Nishimura等[14]比较了氢醌-α-葡萄糖苷与熊果苷抑制黑素生成的作用与细胞毒性,在浓度为1 mmol/L时,氢醌-α-葡萄糖苷没有细胞抑制,而熊果苷已显出严重的抑制作用。

结果显示氢醌-α-葡萄糖苷与熊果苷抑制黑素生成的作用一样,但没有细胞毒性。

此外,使用两种糖苷均可使褐色豚鼠黑素生成降低80%,但对人类正常的角质形成细胞毒性却有非常大的差异。

Jin等[15]研究发现以芦荟素和熊果苷共同处理,对抑制Tyr具有协同作用,芦荟素和熊果苷抑制人Tyr和蘑菇Tyr的活性是相似的,IC50值分别为011mmol/L、0104mmol/L,酶动力学Lineweaver2Burk曲线显示芦荟素抑制Tyr的作用是非竞争性的,K i值513mmol/L,而熊果苷是竞争性的。

0101mmol/L芦荟素和0103mmol/L熊果苷可抑制80%蘑菇Tyr的活性,具有协同抑制作用。

另外,从大黄根茎的丙酮提取物中筛选出的3, 4′,5-三羟二苯乙烯-4′-O-β-D-(2″-O-没食子酰)葡萄糖苷和3,4′,5-三羟二苯乙烯-4′-O -β-D-(6″-O-没食子酰)葡萄糖苷也显示了强大的抑制Tyr及影响黑素生物合成的作用[16]。

(二)苯丙素类:来自于五加科新鲜人参叶中的肉桂酸、白头翁根的4-羟基-3-甲氧基肉桂酸、非洲草药的2-羟基-4-甲氧苯甲醛及其衍生物等苯丙素类化合物均为Tyr抑制剂。

肉桂酸抑制
Tyr催化酪氨酸的作用比L2多巴强[17]。

4-羟基-3-甲氧基肉桂酸ID50值0133mmol/L,与茴香醛、茴香酸、苯甲酸、苯甲醛、肉桂酸,肉桂醛比较显示强大的抑制Tyr活性,鉴于苯甲醛、肉桂醛强大的作用及茴香醛较茴香酸作用强,Tyr抑制剂分子中醛基是官能团,甲氧基取代能提高抑制Tyr的活性[18]。

2-羟基-4-甲氧苯甲醛是混合型Tyr抑制剂, ID50为0103mmol/L,可通过几种途径抑制酶催化的氧化反应,醛基一般易于和生理上起重要作用的亲核性基团,如巯基、氨基或羟基等结合,尤其能和伯胺形成席夫碱,醛基化合物除还原作用外还有螯和作用[19]。

丁香酚、阿魏酸、姜黄色素等具有4-羟基的芳香环肉桂酰和α,β不饱和的羰基芳香化合物可能是重要的Tyr抑制剂[20]。

另外,苯丙素类似物龙胆酸甲酯也显示具有局部皮肤增白作用,其作用包括抑制黑素细胞的色素沉着、选择性抑制Tyr、降低氢醌相关的细胞毒、无潜在的诱导哺乳动物细胞突变作用。

100mg/ml龙胆酸甲酯对Tyr相关蛋白1 (TRP-1)显示微弱的作用,对Tyr相关蛋白2 (TRP-2)没有作用[21]。

(三)黄酮类:Kubo等[22]发现从番红花(鸢尾科)的新鲜花瓣中提取出的黄酮醇———山萘酚。

具有抑制蘑菇Tyr催化L2多巴氧化的活性,其ID50值0123mmol/L。

而它的3-0-葡萄糖甙衍生物无此作用。

抑制作用的动力学Lineweaver2Burk曲线分析发现山萘酚是竞争性抑制作用,该作用可能是螯合酶上的铜离子。

黄酮醇类良姜素、山萘酚、槲皮苷对Tyr的抑制活性来自于它们能螯合酶中的铜离子。

而对应的黄酮类,柯因、芹黄素和木犀草素不能螯合酶中的铜离子。

由此看出具有游离的3-羟基是必要的活性官能团,螯合作用似乎是黄酮醇特有的。

黄酮醇类以不同的方式影响酶的活性。

一方面,良姜素抑制一元酚酶活性但并非作为辅因子起作用;山萘酚则既不作为辅因子,也不抑制一元酚酶的活性。

另一方面,这3种黄酮醇都能通过螯合酶中的铜离子抑制二元酚酶的活性[23]。

Badria等[24]从27种黄酮类化合物中筛选出6种对黑素生物合成有潜在影响的化合物,试验中发现,包括α-酮羰基的黄酮类化合物显示有活性,这可能解释为α-酮羰基的黄酮类化合物与L-多巴非常相似有关。

研究揭示了源自天然产物的一类新的Tyr抑制剂,经筛选有10种朝鲜传统的茶叶对Tyr的抑制作用,绿茶的作用最强,其活性最强的成分为(-)-表儿茶素-3-O-没食子酸盐(ECG)、(-)-没食子酸儿茶素-3-O-没食子酸盐GCG和(-)-表没食子酸儿茶素-3-O-没食子酸盐(EGCG)。

所有的儿茶素没食子酸盐均具有活性点。

Tyr抑制作用的动力学分析揭示GCG竞争Tyr上的天然酪氨酸的结合位点[25]。

Sasaki等[26]利用生物活性分离法从柑橘果皮中分离出一种Tyr抑制剂3′,4′,5,6,7,8-六甲氧基黄酮,ID50值4612mmol/L比苯甲酸的作用强,是一种对黑素生成的强有效的抑制剂。

三、微生物来源的Tyr抑制剂
(一)壬二酸:又名杜鹃花酸,是天然的直链饱和C9二羧酸。

1978年从糠秕马拉色菌培养液中分离出,并认为该物质是引起花斑癣患者脱色斑的原因。

可选择作用于功能活跃的黑素细胞,对功能正常的黑素细胞影响较小。

体外实验证明,壬二酸能抑制Tyr活性,抑制黑素的形成;能破坏正常黑素细胞的氧化系统,对黑素细胞的超微结构有损伤。

有人发现,它对鼠和人的黑素瘤细胞有选择性细胞毒作用,并有抗肿瘤细胞增殖作用。

其机制是与壬二酸抑制了肿瘤细胞线粒体电子传递键以及DNA合成中的限速酶核糖苷酸还原酶有关。

(二)曲酸:化学名5-羟基-2-羟甲基-4-吡喃酮。

1907年Sato首先从溜曲霉分离出使肤色变白的物质,1953年从aspergillus alba葡萄糖发酵液分离鉴定出其化学结构,之后发现,该物质亦可从丙酸杆菌发酵而得。

曲酸的作用机制是通过与Tyr 上作为辅酶的铜嵌合,而抑制Tyr。

曲酸并可阻断黑素之中间生成物,达到其抑制黑素生成、淡化黑斑的美白效果。

研究发现曲酸可通过非经典方式抑制Tyr的活性,几分钟后即可观察到初始速度降低到稳定的抑制速度,这种时间依赖性,不会随酶与抑制剂的优先结合而改变。

动力学数据得到与假定原理一致的结果,包括快速形成酶抑制剂复合物,随后酶抑制剂复合物产生缓慢的可逆反应,动力学参数描绘的抑制类型为产物的非线性回归曲线[27]。

曲酸在水溶液中不稳定,且容易与金属结合,因此新的发展是使用曲酸的油溶性衍生物如曲酸二棕榈酸盐。

除上述酪氨酸酶抑制剂外,还有大量正在研究和试用于临床的药品,如抗坏血酸磷酸酯镁、(R)-
5-苯基-2-硫　唑烷、铜-金属硫蛋白、(2E)-烯醛、麦芽酚等。

可以看出,从植物、微生物中筛选酪氨酸酶抑制剂是研究的热点和方向。

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(收稿日期:2002-11-08)
・综述・
黑素瘤疫苗的研究进展
张正华 刘维达
摘要　近10多年来,恶性黑素瘤在全世界的发病率不断增加,主要与紫外线照射,尤其是儿童期日晒伤,皮肤类型以及多发性痣等有关。

该病恶性程度较高,易发生转移,目前的治疗方法仍不理想。

近年来随着分子生物学的发展和基因工程技术的出现,黑素瘤疫苗的研究有很大飞跃,为黑素瘤特异性主动性免疫治疗提供了一种重要手段。

文中主要就目前的黑素瘤疫苗的类型和临床试验方面加以综述。

关键词　黑素瘤 癌症疫苗
作者单位:210042南京,中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所。