《生物化学试验》实验五：改良Mohun法测定谷-丙转氨酶活性

临床意义
用本法测定血ALT正常值为40 U/ml以下
肝细胞中含ALT最丰富，因此当肝脏疾病致肝细胞 受损伤时，ALT即大量释放入血液，致使血清中ALT 活性增高。 测定ALT是检查肝功能的重要指标之一。 显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死， 中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞， 轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。
glutamate pyruvate
在520nm波长测定其光密度，与经同样处理标准
丙酮酸溶液比较，即可计算谷-丙转氨酶的活性。
pyruvate
2, 4-dinitrate phenylhydrazine
(brown) pyruvate dinitrate
phenylhydrazone
血清谷-丙转氨酶活性单位定义：每毫升血清在pH值7.4，
复习分光光度计的使用
（1） 开机，调波长，预热15-20分钟 （2）将待比色溶液倒入比色杯 • 高度2/3 - 4/5比色杯 • 手握毛面，注意光面整洁 • 依次放入样品室（空白管放第一槽，毛面朝向操作者）
（3）测定
T档 拉杆0档
调T100% ： 空白管
T档 拉杆1档
调T 0%, 转为A档 A=1.-----
1 、保温温度和时间要精确， 即谷丙转氨酶发挥催化作用环境
2 、概念：酶活性单位
3、 微量移液器的使用 P4
（1） 套吸头 （2） 吸取溶液： 按到第一档，垂直进入液面（0.5cm）
缓慢松开控制按钮，使之慢慢回到初始位置。 （3）移入试管中：吸头贴壁并有一定角度，将溶液全部吹出。
吸头弃于烧杯中，微量移液器放回盒内。
1.0
0.5
－
－
－
丙酮酸 0.4
0.1
0.1
50 ug/ ml
－
混匀, 37℃水浴准确保温30min
0.5
0.5
0.5
0.5
谷-丙转氨酶底物液
0.4mol/L NaOH溶液
－
0.5
－
－
混匀, 37℃水浴保温10min5.05.05.0
5.0
混匀, 室温静置10min, 520nm比色测吸光度A. 用空白管调零,测定标准管吸光度;用对照管调零,测定测定管吸光度
实验五
改良Mohun法测定谷-丙转氨酶活性
一、目的与要求：
了解谷－丙转氨酶活性测定 的原理及测定方法。
二、实验原理：
利用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，在ALT作用 下生成丙酮酸和谷氨酸
再利用2, 4-二硝基苯肼与丙酮酸反应，生成棕色
的丙酮酸二硝基苯肼
alanine
α-ketoglutarate
37℃保温条件下与底物作用30min后，每生成2.5ug的丙酮
酸为1谷-丙转氨酶单位，正常值为2-40单位/ml。
三、实验步骤：
试剂 (ml)
0.1mol/L 磷酸盐缓冲液
谷-丙转氨酶底物液 血清(肝匀浆)
2, 4-二硝基苯肼溶液
取干燥大试管4支，标号
测定管 对照管 标准管 空白管
0.4
0.4
0.6
A档 拉杆2、3、4档 测吸光度： 标准管、测定管
休息状态：拉杆1档 A=1.-----
四、结果、讨论：
谷丙转氨酶活性单位/每毫升肝匀浆=
m （A测定管 /A标准管 × 标准管中丙酮酸含量）
×1
2.5
0.1
m标准管中丙酮酸含量 = V标准管×C标准管 (0.4 ml × 50 ug/ ml)
五、注意事项：