人类丝氨酸消旋酶的同源模建及其与多肽类抑制剂的分子对接_赵勇山

人类丝氨酸消旋酶的同源模建及其与多肽类抑制剂的分子对接
赵勇山
郑清川*
张红星
楚慧郢
孙家钟
(吉林大学理论化学研究所,理论化学计算国家重点实验室,长春
130023)
摘要：利用同源模建和分子动力学模拟方法构建了人类丝氨酸消旋酶(hSR)的三维结构,并利用profile -3D 和procheck 方法评估了模型的可靠性.在此基础上用分子对接程序(affinity)将多肽类抑制剂A 和B 分别与hSR 进行对接,获得了其复合物结构的理论模型.通过配体与受体之间相互作用能和结构分析给出了此类抑制剂与hSR 的具体结合方式,明确了hSR 与此类抑制剂结合时起重要作用的氨基酸残基,为基于人类丝氨酸消旋酶三维结构的药物设计提供重要的参考信息.关键词：人类丝氨酸消旋酶;分子动力学模拟;
分子对接;
同源模建
中图分类号：O641
Homology Modeling of Human Serine Racemase and Its Molecular Docking with Peptide Inhibitors
ZHAO Yong -Shan
ZHENG Qing -Chuan *
ZHANG Hong -Xing
CHU Hui -Ying
SUN Chia -Chung
(State Key Laboratory of Theoretical and Computational Chemistry,Institute of Theoretical Chemistry,Jilin University,
Changchun 130023,P.R.China )Abstract ：The three dimensional structure of human serine racemase (hSR)was modeled and refined using homology modeling and molecular dynamics simulation.This model was assessed by profile -3D and procheck,which confirmed that the refined model was plex structures of peptide inhibitors with hSR were obtained and investigated through ligand -receptor docking studies by a molecular docking program,affinity.The binding pattern predicted by the affinity module revealed that important residues interacted with the peptide inhibitors and the module provided further refinement of the hSR/inhibitor binding interaction that may be used as a basis for new structure -based design efforts.Key Words ：Human serine racemase;
Molecular dynamics simulation;
Molecular docking;
Homology
modeling
[Article]
物理化学学报(Wuli Huaxue Xuebao )
Acta Phys.-Chim.Sin .,2009,25(3)：417-422
Received:November 4,2008;Revised:December 11,2008;Published on Web:January 13,2009.
*
Corresponding author.Email:zhengqch@;Tel:+86431-88498962.
国家自然科学基金(20573042)、国家科技支撑计划重点项目(2006BAE03B01)和高等学校博士点学科专项基金(20070183046)资助
鬁Editorial office of Acta Physico -Chimica Sinica
一直以来,人们普遍认为D 型氨基酸只存在于细菌和无脊椎动物体内[1,2],但是研究发现[3,4],依赖磷酸吡哆醛的人类丝氨酸消旋酶(hSR)在体内可催化丝氨酸从L 型转变为D 型,从而调节D 型丝氨酸在组织中的表达水平.近年来研究也证实,D 型氨基酸在高等有机体的脑部和其他一些组织,特别是在中枢神经系统中高度表达,并有着非常重要的作用[5-8],如D 型丝氨酸在哺乳动物的大脑中具有非常高的
丰度,而且作为内源性配体,能够结合于N -甲基-D -天门冬氨酸(NMDA)受体的“甘氨酸”位点,从而调节该受体的活性[9-11].实验上证明NMDA 受体在神经的兴奋传递、神经元和海马区的突触的可塑性、视网膜的发育、学习与记忆等方面发挥着非常重要的作用,NMDA 受体的过度激活会导致神经细胞的死亡和引起脑缺血后的脑部损伤以及其他神经病理学方面的疾病[12].因此调节D 型丝氨酸在组织中的
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表达水平对研究神经方面的疾病具有非常重要的意义[13-15].
到目前为止,已有大量关于hSR的实验研究报道[12-15],表明hSR含有一个磷酸吡哆醛(PLP)结构域,并且结构保守区残基Lys50与PLP共价结合,在催化过程中把L型丝氨酸转换成D型丝氨酸.2006年,Dixon等人[16]利用高通量虚拟筛选和实验等手段获得了hSR的多肽类抑制剂,其研究结果表明本文所研究的多肽类抑制剂A和B(图1)能够很好地抑制hSR的活性并使其活性降低75%以上.但是, hSR三维结构详细信息的缺失,阻碍了对该酶的功能、催化机理等的进一步研究.同源模建和分子动力学模拟的方法能很好地应用于生物大分子的理论模拟,并指导和解释实验现象[17,18],本文采用这两种方法构建了hSR的三维结构模型,并通过分子对接和量子化学计算方法考察了多肽类抑制剂A和B与hSR的结合模式,以期为基于人类丝氨酸消旋酶的三维结构药物设计提供重要的参考信息.
1计算方法
1.1模型搭建
以hSR的一级序列(来源于Swiss-Prot and TrEM BL数据库,编号:EC5.1.1.18)为探针,在NCBI数据库中利用protein blast程序搜索Brookheaven蛋白晶体数据库,得到模板蛋白裂殖酵母菌丝体的丝氨酸消旋酶的三维结构,收录号为1V71.整个模型的构建分为以下四个步骤.(1)利用clusterW程序进行序列比对,确定模板与序列之间的残基匹配.(2)模型的建立:根据序列比对的结果,采用modeler自动模建程序搭建hSR的三维结构并进行侧链异构化,对所得模型在pH为8.0条件下进行加氢、补建等化学修饰,然后把模板1V71中的辅酶磷酸吡哆醛的坐标赋到模建所得结构的相应位置,得到hSR的初始结构模型.(3)模型优化:将整个体系加入0.5nm TIP3P 水分子,借助Insight II程序包[15]中Discover3模块,首先采用最陡下降法(steepest descents,SD)进行500步的能量最小化,再采用共轭梯度法(conjugate gradient,CG)优化至能量梯度小于4.18×10-2kJ·mol-1·nm-1,能量优化采用分级方法,即先对溶剂水和蛋白质的氢原子进行能量优化,进而优化蛋白质的环区侧链、环区主链、结构保守区侧链和结构保守区主链,直至全部放开优化.优化后的hSR模型在没有任何约束条件下进行500ps分子动力学优化,所用力场为CVFF(consistent valence force field)力场.(4)模型的合理性评估:用profile-3D[19]和procheck[20]检查优化后模型的键长、键角及二面角的合理性,并计算了hSR与1V71主链原子的均方根偏差(RMSD).
1.2分子对接
hSR的活性位点的预测用binding-site程序、CASTp[21]程序以及CAVER[22]程序来确定.hSR与多肽类抑制剂的分子对接采用affinity程序[15].Affinity 是一套自动对接配体(客体)到受体(主体)的程序,对给定的由配体分子和受体分子组成的体系,它能自动地依据配体/受体复合物的能量得到最佳的配体和受体结合结构.分子对接时采用Monte Carlo极小化方法与模拟退火的方法,每次优化1000步,并考虑溶剂化效应,计算过程中采用cell multiple模型计算非键相互作用.配体和受体间的能量匹配用半经验的自由能计算方法来评价.
1.3量子化学计算
多肽类抑制剂A和B分子的几何构型见图1,它们都含有一个3-苯基丙乙酸部分和一个组氨酸部分.构型在6-31G(d,p)水平下采用B3LYP[23,24]方法优化,溶剂化模型采用CPCM模型[25](介电常数ε= 80).此外,在分子对接的基础上,截取抑制剂0.3nm 范围内的氨基酸残基获得截断hSR-抑制剂复合物模型.在B3LYP/6-31G(d,p)水平下分别计算抑制剂、氨基酸残基以及截断复合物的单点能,从而获得抑制剂与hSR之间的相互作用能.所有量子化学计算由Gaussian03程序包[26]来完成的.
2结果与讨论
2.1hSR三维结构的同源模建
由自动模建程序modeler构建的初始模型,经
图1多肽类抑制剂A和B的结构示意图Fig.1Structures of peptide inhibitors A and B
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过能量最小化和分子动力学模拟后,得到了hSR三维结构的合理模型,如图2所示.hSR的三维结构中含有14个α螺旋,10个β折叠和11个β转角. hSR与1V71主链原子的均方根偏差为0.054nm.在分子动力学的模拟过程中,如图3所示,体系的势能在50ps之后能量基本保持不变,蛋白质的RMSD 值也在最后达到了平衡.同时应用profile-3D对模建结构进行氨基酸残基的兼容性评测,其结构兼容性得分为130.13,远远高于临界得分60.89.从图4可以看出,绝大多数残基得分都是正值,均位于合理可信的位置,只有2个处于loop区的Tyr225和Ser296处于不合理范围之内,但它们远离活性位点,对后续研究没有不良影响.另外,还应用procheck 程序检查了hSR主链构型中的Φ-Ψ二面角的分布,图5给出的是Ramachandran plot检测图,图中处于合理区域的氨基酸比例大于99.6%,以上检测结果都表明,模建所得的hSR三维结构是合理可信的.
2.2分子对接
在同源模建所得hSR三维结构基础上,利用binding-site程序搜寻得到了hSR的2个可能的活
图5人类消旋酶模建结构的Ramachandran图Fig.5Main-chain dihedral angles(Ramachandran plot)of the modeled human serine racemase A,B,and L represent the residues in most favoured regions;a,b,l, and p represent the residues in additional allowed regions;~a,~b,~l, and~p represent the residues in generously allowed regions.
图2人类丝氨酸消旋酶三维结构的带状显示图
Fig.2Ribbon representation of human serine
racemase
Dots model depicts pyridoxal phosphate(PLP).
图3体系的势能曲线(a)以及蛋白质的RMSD曲线(b) Fig.3Potential energy of the system(a)and the root mean square deviation(RMSD)of the protein(b)
图4人类丝氨酸消旋酶模建结构的profile-3D图Fig.4Profile-3D plot of the modeled human serine
racemase
Score S means the compatibility of an amino acid sequence with a
known3D protein structure.
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性位点,位点1由Lys50,Ser77,Gly79,His81,Pro147,Asn148,Gln149,Gly179,Gly180,Lys235,Ser236,Ser237,Gly239等残基和辅酶PLP 组成,而位点2由Ser78,Val99,Val100,Pro101,Cys122,Pro124,Gly127,Ser128等残基组成,根据消旋酶的催化机制以及实验上的相关报道[27],位点1中包含了催化残基Lys50、辅酶PLP 以及保守残基Gly179,Gly180等,因此选择位点1作为本文研究对象.我们还应用CASTp 和CAVER 位点预测程序验证所选位点的合理性.从图2中可以看出,hSR 的活性位点1位于蛋白质表面较为狭长的凹槽,并位于辅酶磷酸吡哆醛的上方.
为了明确hSR 与多肽类抑制剂的相互作用情况,借助affinity 程序分别进行了hSR 与多肽类抑制剂A 和B 的分子对接研究,计算所得复合物的总能量(total energy),hSR 与配体的最低相互作用能(ΔE ),其主要作用的关键氨基酸残基分别列于表1中.
hSR 与多肽类抑制剂A 的对接结果表明,二者的结合方式具有2种不同的空间取向.取向(1)在10个对接结果中为优势构象(图6(a)),其最低相互作
用能为-347.86kJ ·mol -1.从图6(a)可以看出,抑制剂A 的咪唑环伸向活性位点的深处,其末端的羰基O 与E130的羧基O 形成水合氢键,K235的侧链氨基N 与3-苯基丙乙酸部分的氨基H 形成氢键,从而使3-苯基丙乙酸部分和引入的乙丁基恰好位于活性部位的空腔中.取向(2)与(1)的结合方式存在明显差异,选取其中相互作用能最低(-325.96kJ ·mol -1)的复合物构象来进行分析(图6(b)).抑制剂A 的3-苯基丙乙酸部分伸向活性位点的深处,3-苯基丙乙酸基团上的O 分别与S78和K235形成水合氢键,增强了复合物的稳定性.但是由于配体末端羰基O 与NH 分别与R129胍基和S78的羟基形成氢键,使配体引入的乙丁基暴露在hSR 的表面,从而减弱了多肽类抑制剂A 与hSR 之间的相互作用.从表1可以看到,借助affinity 程序计算得到的取向(1)的体系总能量和分子间相互作用能都比取向(2)的低,也就是说,取向(1)为最佳的作用模式.为了进一步验证抑制剂A 在hSR 中的结合方式,根据配体的作用机理,抽取对接结果中的抑制剂的几何结构,利用B3LYP 方法,在6-31G(d ,p )水平下,用截断复合物
表1抑制剂A 和B 与hSR 对接的结果
Table 1
Results of docking runs for inhibitors A and B with hSR
a)N is the total number of docking results,b)the lowest interaction energy of protein with the inhibitor obtained by docking results,including electrostatic and van der Waals interactions,c)the residues that form hydrogen bonds with the ligand,d)the interaction energy between the protein
and inhibitors calculated at B3LYP/6-31G(d ,p )level,e)the total energy of the complex from the docking results.energy in kJ ·mol -1
Inhibitor Cluster N a ΔE b Contacting residue c
Energy d Total energy e A 16-347.86K235,E130-35.65-5.28×10424-325.96S78,R129,K235-15.05-5.25×104B
15-462.79H76,N148,E130-68.95-5.22×1042
5
-398.23
D232,N148,H76,K235
-52.96
-5.21×104
图6抑制剂A 与人类丝氨酸消旋酶活性位点的对接结果
Fig.6Docking results of inhibitor A with hSR
(a)cluster 1,(b)cluster 2
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模型计算了抑制剂A与蛋白质的相互作用能,从表1可以明显地看出,取向(1)的相互作用能明显的低于取向(2),从而进一步说明抑制剂A是以取向(1)的方式与hSR结合的.此外,还利用Ludi程序来评判所得复合物结构的合理性,取向(1)和(2)的打分分别为371和323,可以看出(1)的对接方式的打分远远高于(2),也进一步证明了抑制剂A是以(1)的方式与hSR结合的.
对于抑制剂B,从得到的复合物的构象来看,在hSR活性位点中的结合情况也主要有两种方式,并且二者出现几率是一样的,对接结果见表1与图7.同样地,分别选取其中能量最低的构象进行讨论,以明确抑制剂B和hSR的具体作用方式.在方式(1)的最低相互作用能(-462.79kJ·mol-1)复合物构象中(图7(a)),抑制剂B的3-苯基丙乙酸部分伸向活性位点的深处,氨基酸残基E130与抑制剂B形成两个氢键,一个由E130的O与抑制剂的末端的NH形成,另一个是E130的O通过水分子与抑制剂B中间肽键上的O形成的水合氢键;残基N148也与抑制剂形成了两个氢键,即N148上的侧链O和氨基H分别通过水分子与抑制剂B末端的羰基O形成水合氢键.这些氢键对稳定空间体积较大的苯甲基有很大贡献.此外,咪唑环上的氮原子与H76的氨基H之间还有一个氢键存在.在方式(2)的最低相互作用能(-398.23kJ·mol-1)的复合物构象中,抑制剂B与hSR之间形成了四个氢键(图7(b)),抑制剂B 的咪唑环伸向活性位点的深处,但由于苯甲基所在的末端链太长,不能完全包埋在活性部位的空腔中而暴露于hSR的表面,导致了hSR和抑制剂B之间的相互作用减弱.为了进一步证明抑制剂B在hSR中结合的优势几何构型,同样的,利用B3LYP 方法,在6-31G(d,p)水平下,计算了方式(1)和(2)的相互作用能.结果如表1所示,方式(1)比(2)的相互作用能低,也就是说抑制剂是以方式(1)的结合方式与hSR结合的.方式(1)和(2)的Ludi打分分别为504和488.以上分析结果都表明,抑制剂B也是以(1)的方式结合在hSR中.
3结论
通过比较分析hSR与多肽类抑制剂A和B的对接结果,得到了hSR与抑制剂分子的最佳作用模式的详细理论信息.从二者之间的相互作用能、氢键的形成以及Ludi打分的数据来看,在多肽类抑制剂的R位点上引入体积较大的苯甲基(抑制剂B)更适合作为hSR的抑制剂.而且在hSR与多肽类抑制剂的对接结果中发现,人类丝氨酸消旋酶的Asn148, His76,Glu130,Lys235等残基在与抑制剂的作用过程中起到非常重要的作用.
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