抗核抗体检测试剂Hep-2细胞抗原片的制备方法及其产品[发明专利]

[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1281984A [43]公开日2001年1月31日
[21]申请号00121577.9[21]申请号00121577.9
[22]申请日2000.08.14[71]申请人李永哲
地址100730北京市北京协和医院检验科荧光免
疫室
共同申请人王慧珍 倪安平
[72]发明人李永哲 王慧珍 倪安平 [74]专利代理机构北京科龙环宇专利事务所代理人孙皓晨 韩小雷
[51]Int.CI 7G01N 33/53G01N 33/531G01N 33/536
权利要求书 1 页 说明书 3 页
[54]发明名称
抗核抗体检测试剂Hep－2细胞抗原片的制备方法
及其产品
[57]摘要
本发明为一种抗核抗体检测试剂Hep-2细胞抗
原片的制备方法及其制备方法。

本制备过程包括在
胰酶消化细胞消化的Hep－2细胞中加入含胎牛血清
的细胞培养液,混匀后离心分离,加入细胞培养液混
匀得到细胞液并滴于玻片上,经培养、固定、冲洗、
吹干后即得。

本制备方法可大批量生产,所制产品
质量稳定、效果良好。

00121577.9权 利 要 求 书第1/1页 1、一种抗核抗体检测试剂Hep-2细胞抗原片的制备方法，其特征是包括细胞培养玻片预处理、Hep-2细胞培养、Hep-2细胞抗原片制备；其中， 所述细胞培养玻片预处理过程包括将玻片按细胞培养清洗条件洗涤处理后，在无水乙醇中浸泡1小时，用干净医用纱布擦干玻片，置烤箱中，在215℃干烤3小时，自然冷却后待用；
所述Hep-2细胞培养过程包括将Hep-2细胞用含5％胎牛血清的1640细胞培养液培养，待Hep-2细胞增值至充满容器后待用；
所述Hep-2细胞抗原片制备过程是在0．25％胰酶消化细胞消化的Hep-2细胞中加入20ml含5％胎牛血清的 1640细胞培养液，混匀后离心分离，弃去上清液后加入20ml细胞培养液混匀得到细胞液，将细胞液滴于10孔玻片上，每孔1滴，滴片时应保证10孔抗原片中细胞悬液保持一定张力，滴片后置细胞培养箱中在37℃、0．5％CO2条件下培养20小时，然后经37℃预温的0．01M pH7．2磷酸盐缓冲液冲洗细胞培养片、20℃预冷甲醇溶液固定5分钟、-20℃预冷丙酮溶液固定1分钟、蒸馏水快速冲洗一次、吹干即可。

2、如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述玻片可制成留有5-12圆孔面积的玻片，除孔外的玻片上的其它表面均由漆或其它物质覆盖。

3、如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述Hep-2细胞的培养过程的条件是37℃、容器中充有5％CO2气。

4、如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述Hep-2细胞与细胞培养液的混匀过程采用移液管吹打。

5、如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述离心分离过程可置于50m l无菌离心管中，1200转离心分离5分钟，弃去上清液；
6、如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述滴液过程可用经钴60照射灭菌的无菌塑料滴管吸取调整后的细胞悬液，并将细胞液滴于玻片上。

7、如权利要求1所述的制备方法，其特征是还包括将吹干的玻片中加入干燥剂，置锡铂纸包装袋中，用热合器封袋，置-20℃冰箱中保存。

8、一种抗核抗体检测试剂Hep-2细胞抗原片，其特征是采用权利要求1-7所述的制备方法制得的。

00121577.9说 明 书第1/3页抗核抗体检测试剂Hep-2细胞抗原片的制备方法及其产品
本发明涉及临床检验诊断试剂，特别是一种抗核抗体检测试剂Hep-2细胞抗原片的制备方法及其产品。

抗核抗体(anti-nuclear antibodies，ANA)检测是临床免疫学检验一项重要的常规检测项目，对自身免疫性疾病的诊断具有重要意义。

目前，国外临床检测ANA诊断试剂多采用Hep-2细胞抗原片，德国、美国、英国、日本等国家均有诊断试剂厂生产。

Hep-2细胞为应用广泛的商品ANA检测抗原基质片。

与传统的鼠肝(肾)印片或冰冻切片相比较，Hep-2细胞具有核大、细胞结构清晰、便于结果观察及荧光染色核型分析的优点，有助于不同核型间的鉴别；同时，Hep-2细胞具有核抗原丰富、特异性强、含量高、具备人源性抗源性抗原的特征，可以检测出应用鼠肝(肾)冰冻切片检测呈阴性或反应弱的A N A，如抗著丝点抗体、抗体成份为S S A／R0的A N A、抗增殖细胞核抗原(P C N A)抗体及各种抗细胞浆抗体。

文献报道，应用H e p-2细胞株检测A N A较鼠肝(肾)冰冻切片检测A N A，阳性率可提高10％-20％左右。

但是国外产品价格昂贵，不适合国内临床需求。

本发明的目的是提供一种可大批量生产、质量稳定、效果良好的抗核抗体检测试剂Hep-2细胞抗原片的制备方法。

本发明的另一个目的是提供一种上述制备方法制得的产品。

本发明的抗核抗体检测试剂Hep-2细胞抗原片的制备方法包括细胞培养玻片预处理、Hep-2细胞培养、Hep-2细胞抗原片制备；其中，所述细胞培养玻片预处理过程包括将玻片按细胞培养清洗条件洗涤处理后，在无水乙醇中浸泡1小时，用干净医用纱布擦干玻片，置烤箱中，在215℃干烤3小时，自然冷却后待用。

所述玻片可制成留有5-12圆孔面积的玻片，除孔外的玻片上的其它表面均由漆或其它物质覆盖。

所述洗涤处理过程包括将玻片在浓硫酸中浸泡2小时，清水冲洗除酸，在洗涤剂溶液中洗刷，用清水冲洗干净后用蒸馏水浸泡、清洗数次。

所述Hep-2细胞培养过程包括将Hep-2细胞用含5％胎牛血清的1640细胞培养液培养，待Hep-2细胞增值至充满容器后待用。

所述Hep-2细胞属人喉癌细胞系，是北京协和医院检验科病毒室赠送的；所述培养过程的条件是37℃、容器中充有5％CO2气；所述评1640细胞培养液可采用美国生命技术公司生产的产品。

所述Hep-2细胞抗原片制备过程是在0．25％胰酶消化细胞消化的Hep-2细胞中加入20ml含5％胎牛血清的1640细胞培养液，混匀后离心分离，弃去上清液后加入20ml细胞培养液混匀得到细胞液，将细胞液滴于10孔玻片上，每孔1滴，滴片时应保证10孔抗原片中细胞悬液保持一定张力，滴片后
置细胞培养箱中在37℃、0．5％CO2条件下培养20小时，然后经37℃预温的0．01M pH7．2磷酸盐缓冲液冲洗细胞培养片、20℃预冷甲醇溶液固定5分钟、-20℃预冷丙酮溶液固定1分钟、蒸馏水快速冲洗一次、吹干即可。

所述混匀过程可用移液管吹打，即可达到混匀目的；所述离心分离过程可置于50ml无菌离心管中，1200转离心分离5分钟，弃去上清液；所述滴液过程可用经钴60照射灭菌的无菌塑料滴管吸取调整后的细胞悬液，并将细胞液滴于玻片上；所述磷酸盐缓冲溶液可由磷酸氢二钠·12H2O、磷酸二氢钠·2H2O和氢氧化钠配制而成。

本发明的制备方法还可以包括将吹干的玻片中加入干燥剂，置锡铂纸包装袋中，用热合器封袋，置-20℃冰箱中保存。

本发明的制备方法制得的Hep-2细胞抗原片的鉴定方法是：将制备好的Hep-2细胞抗原片从锡铂纸包装袋中取出，电风扇吹干，在10个抗原孔中分别加入1∶20稀释的9种阳性对照及阴性对照血清，按常规间接荧光法操作，并在荧光显微镜下观察结果。

质量合格的Hep-2细胞片应可检出抗核抗体常见荧光染色模型，如：均质型、斑点型、核仁型、着丝点型、P C N A 型、线粒体型、中心体型、高尔基体型等，以及阴性对照孔表现为ANA阴性检测结果。

应用时，按以下步骤进行：
1、将H e p-2细胞片从铝箔包装袋取出后立即用电风扇吹干，待用。

2、将被检血清用0．01mol／L pH7．4PBS1∶20稀释后，吸取20ul滴加于抗原孔中。

同时在“+”孔加入20ul阳性血清，“-”孔加入20ul阴性对照血清作为实验对照。

3、置湿盒37℃孵育30分钟。

4、继用同一PBS轻轻冲洗抗原片后，用摇床摇动洗涤三次，每次5分钟，中间更换PBS液。

5、风干后滴加20u l免抗人1g G荧光标记抗体于各抗原孔中，孵育同上。

6、同上法，用PBS冲洗，洗涤细胞片，最后用双蒸水快速浸洗一次。

7、细胞片风干后，用缓冲甘油封片液及封片盖玻片封片，封片液要滴加适量(每孔10ul)并防止气泡形成。

最后在荧光显微镜下观察结果。

8、结果判断：在H e p-2细胞核或浆位置上出现特异性亮绿色染色为A N A阳性，A N A阴性则无特异性荧光染色。

以H e p-2细胞作为底物测定，A N A效价应≥1∶40方能判断为阳性。

对于阳性血清应稀释后测得抗体最终效价。

实验阳性结果报告方式应包括A N A荧光染色模型及抗体滴度。

使用本发明制备的抗核抗体检测试剂H e p-2细胞抗原片时应注意：
1、检测试剂盒中H e p-2细胞片-20℃保存，其余试剂2-8℃保存。

2、H e p-2细胞片制备时已固定，实验使用时勿需再固定。

3、每次实验必须设阳性和阴性对照。

4、对于检测出A N A阳性血清，可用P B S将血清作倍比稀释后(1∶20、1∶40、1∶60．……1∶2560)，再进行检测抗体滴度。

为节约抗原片，测定ANA阳性滴度时，可滴加间隔稀释度血清检测，如滴加1∶20、1∶80、1∶320、1∶1280四孔检测。

5、有时一份血清内因含有多种抗体，可出现不同的染色膜型，用不同稀释度的血清检测，可分清各种荧光染色模型和抗体效价。

6、实验完毕后最好短时间内荧光显微镜下观察结果，如需放置过夜，请将细胞片放湿盒中2-8℃避光保存。

阳性结果荧光片置-20℃可保存很长时间。

本发明的抗核抗体检测试剂Hep-2细胞抗原片的制备方法科学合理，可大批量生产，所制产品经北京协和医院及国内数十家医院临床试用，质量稳定、效果良好。

下面结合实施例进一步描述本发明。

实施例
一种抗核抗体检测试剂Hep-2细胞抗原片的制备方法，它包括以下步骤：
1、细胞培养玻片预处理：将10孔玻片按细胞培养清洗条件洗涤处理，即在浓硫酸中浸泡2小时，清水冲洗数次除酸后，在洗涤剂溶液中洗刷，清水冲洗干净，在蒸馏水浸泡、清洗数次，再在无水乙醇中浸泡1小时，用干净医用纱布擦干玻片，置不锈钢烤箱中，在215℃干烤3小时，自然冷却后待用。

2、Hep-2细胞培养：将Hep-2细胞用含5％胎牛血清的1640细胞培养液，在培养条件为37℃、培养箱中含有5％CO2气下培养，待Hep-2细胞增值到充满整个容器后待用。

3、Hep-2细胞抗原片制备：将0．25％胰酶消化细胞培养瓶中的Hep-2细胞中加入20ml含5％胎牛血清的1640细胞培养液，用移液管吹打混匀后置于50ml无菌离心管中，以1200转／分离心5分钟，弃去上清液，加入20ml 细胞培养液并混匀细胞，用经钴60照射灭菌的无菌塑料滴管吸取调整后的细胞悬液，将细胞液滴于上述10孔玻片上，每孔1滴，滴片时应保证10孔抗原片中细胞悬液保持一定张力；滴片后置于用无水乙醇擦拭灭菌的不锈钢盒中的细胞培养箱中，在37℃、0．5％CO2条件下培养20小时，并用37℃预温的0．01M pH7．2的磷酸缓冲液冲洗细胞培养片，再置于玻璃缸中，经20℃预冷甲醇溶液固定5分钟、-20℃预冷丙酮溶液固定1分钟、蒸馏水快速冲洗一次后，用电风扇吹干；在被吹干的Hep-2细胞抗原片中加入干燥剂，置锡铂纸包装袋中，用热合器封袋，置-20℃冰箱中保存。